實驗動物質量控制中泰澤病原體的研究進展

陶俊豪, 鄢慧瓊, 謝 琿, 應華忠, 戴方偉

(杭州醫學院實驗動物中心,浙江省實驗動物與安全性研究重點實驗室,杭州 310013)

泰 澤 病 原 體 （Tyzzer’s organism） 是Ernest Tyzzer［1］于1917 年 發 現 的 一 種 毛 發 狀 芽 孢 桿 菌（Clostridium piliforme，舊稱Bacillus piliformis），能夠感染多種動物，引起肝腸壞死、腹瀉及死亡（稱為泰澤病）。目前在小鼠、大鼠、豚鼠、沙鼠、倉鼠、麝鼠、兔、犬、貓和馬等體內均發現過泰澤病原體，此外有關鳥類感染泰澤病原體的案例報告有4 篇［2-5］。Smith等［6］發現一例感染泰澤病原體的人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染患者，其體內微生物序列與已知的泰澤病原體16 S rRNA序列只有一個堿基對不同，這是迄今人類臨床上報告的唯一病例。國內姚菊芳等［7］對與實驗動物有密切接觸的飼養人員、相關人員和無關人員進行血清學調查，發現密切接觸人員的泰澤病原體抗體陽性率（85.7%）高于相關人員（40.5%）和無關人員（22.0%）。泰澤病原體主要呈隱性或者亞臨床感染，對實驗動物和相關工作人員均存在威脅，國家標準《實驗動物泰澤病原體檢測方法》（GB/T 14926.10—2001）規定泰澤病原體是清潔級以上動物必須排除的病原體之一。

泰澤病原體是一種嚴格的細胞內寄生菌，無法在無細胞培養基上培養，只能用雞胚和選定的細胞系進行體外培養［8］。這極大地限制了對泰澤病原體的研究。目前通常使用已經受感染的實驗動物進行泰澤病原體研究。鑒于此，本文從泰澤病原體的生物學特性、流行病學與疾病特征、檢測方法與進展以及防治四個方面進行綜述，為以實驗動物質量控制和生物安全管理為目標的泰澤病原體研究提供參考。

1 泰澤病原體的生物學特性

泰澤病原體是一種厭氧的專性細胞內寄生毛發狀芽孢桿菌，有繁殖體和芽孢兩種形態［9］。繁殖體呈絲狀或粗短桿狀。絲狀結構的細菌邊緣由細胞質膜、中間層和厚度為25～30 nm 的特征性細胞壁組成，富含鞭毛；粗短桿狀的細菌內含有許多較小的空泡，細菌外壁邊緣可見一層額外的疏松層，厚度約為3.5 nm，完全包圍菌體，并與胞質和內質網直接接觸，寄主細胞的核糖體與其外圍相連［10］。繁殖體在體外易失活，一般以芽孢的形式傳播，可通過鞭毛感染另一個宿主細胞。

泰澤病原體最常見的傳播方式為糞-口傳播，動物一般從受糞便污染的環境中攝入芽孢。垂直傳播也是泰澤病原體感染動物的途徑之一。泰澤病原體通過細菌導向的宿主微絲依賴機制入侵腸上皮細胞，然后迅速逃脫吞噬小體，以與志賀菌和立克次體相似的方式在細胞質內復制。與其他胞內病原體的區別在于，泰澤病原體富有的周生鞭毛使其能夠在細胞內快速運動，并可能侵入細胞核［11］。

泰澤病原體的繁殖體在45 ℃加熱15 min即可被殺滅；芽孢能夠在56 ℃下存活，在60 ℃加熱30 min 滅活，在80 ℃加熱15 min滅活。泰澤病原體在－80 ℃能保存數年，其感染力與菌株種類、芽孢數量有關，一般至少需要50～100 個芽孢才能達到半數感染量。甲醛、過氧乙酸、次氯酸鈉、碘酚、苯酚可滅活芽孢。

泰澤病原體有多種菌株，不同宿主的菌株具有不同的抗原表位，同一宿主的不同分離株在蛋白質和抗原表型上存在差異，單個鞭毛抗原不能用于感染所有分離株的動物的血清學測試。但各分離株之間均有共同表位，這可能是泰澤病原體為了適應不同宿主所出現的遺傳進化［12-13］。

2 泰澤病的流行病學與疾病特征

實驗動物兔、小鼠、大鼠、沙鼠等對泰澤病原體均易感。有研究表明，從小鼠體內分離的M 株、大鼠體內分離的R 株以及兔體內分離的K 株對小鼠致病性是相同的［14］。泰澤病原體接種小鼠后，小鼠體內白細胞介素-12 表達上升，自然殺傷（natural killer，NK）細胞和Th1 反應在感染和介導免疫應答過程中發揮了重要作用［15-16］。而且無胸腺的小鼠比有胸腺的小鼠更容易感染泰澤病原體［17］，這可能是由于無胸腺的小鼠免疫力更低。泰澤病原體毒力因子的成分為蛋白質，不同的分離株能引起不同程度的細胞毒性，表明不同的泰澤病原體菌株可以誘導不同的臨床表現［18］。

泰澤病的癥狀一般在動物死亡前不久才出現，而且通常是非特異性的，在個體之間存在差異，但都會出現肝臟和腸道病變。鼠類感染泰澤病原體后，通常會出現肝腸病變，偶爾出現心臟病變及腦炎［3，19］。小鼠對泰澤病原體的易感性隨宿主年齡、免疫狀態和感染菌株的不同而出現差異。倉鼠和沙鼠在死亡前很少有或無跡象，有一些病例會出現腹瀉、肛周糞便污染、抑郁、脫水、毛發粗糙等癥狀，并且幼年動物無法成長［20］。實驗幼兔對泰澤病原體非常易感，臨床表現為不同程度的胃腸道癥狀，體征包括食欲不振、嗜睡、腹脹、盲腸嵌塞、腹瀉、脫水等［21］。自發性腦炎是一種罕見的泰澤病表現，在沙鼠和雀形目動物中有報告［2-3，22］。研究還發現，泰澤病原體感染后的沙鼠［22］和普通狨猴［23］的中樞神經系統會發生病變。

對感染泰澤病原體的鼠類進行尸檢，發現盲腸和回腸肌層均有多灶性壞死，有多形核細胞浸潤，黏膜潰瘍旁的上皮細胞和黏膜肌層的平滑肌細胞內可見叢生的細長桿菌，腸系膜內有淋巴細胞浸潤；肝臟中可觀察到直徑達1 mm的白褐色病灶，門脈周圍有凝固性肝細胞壞死的多灶性病變，壞死灶含有細胞碎片，輕度多形核細胞浸潤，偶見紅細胞［19］。在感染最嚴重時期的大鼠肌間神經叢內通常出現空泡化或缺失，而在病情較輕的動物器官中僅發現肝門管區周圍有輕微的淋巴細胞浸潤［24］。胃腸道、肝臟和心臟的壞死性和炎性病變是哺乳動物泰澤病的典型病理表現。病變區域和健康區域之間的過渡區很小，由1層或2層部分變性的細胞組成，對堿性和酸性染料的親和力增強［25］。

泰澤病的發病機制包括攝入泰澤病原體芽孢或繁殖體。動物感染該菌后，首先在回腸-盲腸結腸區域復制，進一步可能到達肝臟，再感染體內其他組織或器官，偶爾也通過體循環到達心臟［26］。肝損傷可導致肝臟氨基酸清除率降低，這可能是代謝性酸中毒的重要因素［27］。腸黏膜上皮損傷與肝臟損傷都可能引起低血糖。

泰澤病一般由多種因素引起，其發病率低，但致死率高。幼年動物特別是當免疫功能受損時最易感。在小型哺乳動物體內，潛伏期一般為2～10 d。Fries［28］通過對小鼠、大鼠和兔體液抗體應答的長期觀察發現，該病原體可能以持續或潛伏感染的形式存在于動物體內，并持續刺激免疫系統，動物對感染的抵抗力與抗體效價有關。泰澤病原體的感染力和致病力與宿主的種屬、健康狀況、周齡、性別、飲食和機體免疫，以及宿主所處的周邊環境均有密切關系。過度擁擠、衛生條件差和皮質類固醇治療等因素可誘發泰澤病。

Ganoe等［29］認為，泰澤病可能是在過去50年里導致北美麝鼠數量顯著下降的原因之一。研究還發現泰澤病原體在嚙齒類實驗動物體內具有較高的檢出率。馮麗萍等［30］、潘金春等［31］和魏杰等［32］分別對2010—2013年上海市、2013—2015年廣東省和2009—2013年北京市實驗大鼠、小鼠的病原體感染情況進行檢測，結果顯示，各年度均能檢出泰澤病原體。戴方偉等［33］對普通環境飼養的長爪沙鼠病原感染情況進行初步調查，泰澤病原體檢出率為6.7%。北京市及浙江省的地方標準已經將泰澤病原體列入清潔級長爪沙鼠必檢項目之一。

3 泰澤病原體的檢測技術及其進展

泰澤病原體的檢測方法有很多，如組織病理學診斷、可的松激發試驗、懸液芯片技術、酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫熒光法（immunofluorescence assay，IFA）、聚合酶鏈式反應（polymearse chain reaction，PCR）等，但都存在一定的缺陷［34］。例如，2001 年發布的國家標準（GB 14926.10—2001）將可的松激發試驗作為參考方法，此法以發病動物特有的病理改變及鏡下檢出泰澤病原體為依據，結果準確可靠，但操作繁瑣；組織病理學診斷也存在相似的缺點。

何靜云等［35］于2006 年證明，免疫磁珠分離技術可有效地分離和純化泰澤病原體，為特異性ELISA 診斷抗原的制備奠定了基礎。2008 年國家標準（GB 14926.10—2008） 將可的松激發試驗刪除，IFA 和ELISA兩種方法被用來進行泰澤病原體診斷。ELISA具有簡單、可靠、準確性高的優點，但對窗口期或隱性感染動物易漏檢；IFA 方法雖簡單易行，但由于梭菌與泰澤菌有交叉反應，可能存在非特異性結合導致的假陽性。ELISA和IFA都存在檢測靈敏度低、檢測方法成本高等問題。由于泰澤病原體的分離培養較為困難，ELISA 等方法的假陽性率較高，因此一般采用對患病動物的器官組織切片后通過銀染或May-Giemsa染色來確認該菌。

Niepceron 等［36］在2010 年建立了一種特異性強的巢式PCR 檢測法。該方法適用于臨床標本，包括盲腸內容物和肝臟，也可應用于設備簡單的實驗室進行泰澤病的常規診斷。丁聰等［37］采取ELISA和IFA并結合巢式PCR 法對實驗大鼠中泰澤病原體的攜帶情況進行調查，發現ELISA 和IFA 敏感性要高于PCR，提出采用IFA 與ELISA 相結合的方法可提高檢測結果的敏感性及可靠性。馮潔等［38］對已建立的泰澤病原體巢式PCR 檢測方法進行優化，并將優化后的巢式NPCR 與IFA 相比，發現優化后的方法具有較高的特異性和靈敏度。PCR 或反轉錄PCR 等分子檢測方法可以克服其他檢測方法的局限性［39］，具有高特異性，能區分密切相關的非致病株和致病株的感染性病原體，但新菌株的引物位點的微小變化可能會導致假陰性，并且PCR的高敏感性可能會產生假陽性。

趙婷婷等［40］根據泰澤病原體16S rDNA 保守基因組序列設計引物和特異性探針，建立反向斑點雜交方法。張超超等［41］采用懸液芯片技術進行實驗兔中包括泰澤病原體在內的常見病原體檢測，該方法具有快速、微量、特異、敏感性高等優點。Tosa 等［42］建立了泰澤病原體、鼠肝炎病毒和仙臺病毒（又稱日本血凝病毒）的多重免疫層析檢測法，此方法快速簡便，能夠同時且特異地檢測多種抗原的抗體，但試紙的制備費時費力，許多實驗室可能缺乏必要的試劑和技術。

另外，由于泰澤病在早期很少出現癥狀，出現癥狀后動物很快就會死亡，因此開發一種早期診斷技術對泰澤病的防治至關重要。有研究者采用實時熒光PCR 法分析廢氣粉塵樣本的方法檢測小鼠嗜肺巴斯德桿菌［43］和諾如病毒（MNV）［44］，結果顯示該方法優于傳統的污穢墊料哨兵監測法［45］，這為泰澤病原體檢測提供了新的思路。環介導等溫擴增技術（loopmediated isothermal amplification，LAMP）具有靈敏性高、特異性強等優點，將其與膠體金技術結合對泰澤病原體的早期診斷可起到重要作用。生物傳感器技術、重組酶聚合酶擴增技術和生物成像發光技術等的高速發展，也為泰澤病原體檢測帶來廣闊的前景。

4 泰澤病的防治

泰澤病原體的感染是由多種因素導致，目前還沒有針對泰澤病原體的疫苗，對泰澤氏病的治療尚不完善。由于該病發病迅速，在發現時動物往往很快就死亡，因此難以進行早期的診斷治療。目前，僅有兩例報告［27，46］通過靜脈注射葡萄糖、廣譜抗生素、抗菌和抗炎藥物成功治療泰澤病原體感染的馬；但大多數情況下通過靜脈注射藥物的方法使患有疾病的幼馬短暫性好轉后，還會很快惡化，最終死亡［46］。一般認為，四環素對泰澤病有部分療效，而氯霉素治療需要大劑量［47］。有研究者認為，針對泰澤病原體這類細胞內寄生型病原體的治療藥物研發，可參考同樣作為胞內寄生菌的結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和布魯桿菌（Brucella）［48］。例如，結核分支桿菌的治療藥物貝達喹啉是針對ATP 合成酶［49］；Q203 則屬于咪唑并吡啶類化合物，可作用細胞色素bcl 復合物，抑制ATP合成，影響結核分枝桿菌的能量代謝［50］。上述兩種藥物均可為泰澤病的治療提供參考。

監測潛在的帶菌動物，如沙鼠和倉鼠等嚙齒動物，是一項預防泰澤病的重要措施。一旦發現動物被感染，芽孢很可能會在個體之間快速轉移，因此對小鼠和大鼠的感染群體應及時進行生物凈化或淘汰處理。在實驗動物的日常飼養工作中，預防泰澤病的具體措施包括：使用含氯、含碘消毒劑進行消毒，制定嚴格的洗手規章制度，增加更換防護用品的頻率，改變動物的喂食順序和清洗順序，對進出飼養地的人員進行嚴格限制和培訓管理［51］。

5 展望

近年來，針對泰澤病原體的工作主要集中于檢測技術開發、臨床癥狀、病理特征研究和疾病治療方面，而基礎性研究并不多見。例如，關于泰澤病原體基因組方面的研究尚未見報告。另外，泰澤病原體難以進行人工培養和分離純化，致使其深入研究相對困難。而且，由于無法體外獲得大量純化的抗原，使得國內泰澤病原體檢測試劑盒的生產面臨困境，進口試劑盒供應雖能暫時緩解國內檢測材料供不應求的現狀，但在新冠病毒肺炎全球大流行的環境下，進口試劑采購的不便性勢必會對檢測工作產生不利影響。因此，泰澤病原體基因組序列的確定是研究泰澤病原體生物學特性的理論基礎，人工培養泰澤病原體的體系優化也是必須要解決的難題之一，在此基礎上才能為其生物學特性研究及疫苗研制等工作奠定基礎，從而減少泰澤病原體感染，避免不必要的經濟損失，保證我國實驗動物科技事業穩步健康發展。

[作者貢獻Author Contribution]

陶俊豪和鄢慧瓊檢索和整理文獻，撰寫文章；謝琿對文章框架及內容進行修改，并提供重要意見；應華忠提供資金，對文章內容進行檢查并提出意見；戴方偉修改文稿，提供資金。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。