基于網絡藥理學與分子對接挖掘地錦草抗類風濕關節炎的作用機制※

劉守才 廖承譜 趙小超▲ 商 勛 丁美婷 吳 玲

地錦草為大戟科植物地錦或斑地錦的干燥全草，記載于歷代版《中國藥典》，具有清熱解毒、涼血止血、利濕退黃的功效?，F代中藥藥理研究[1-5]表明其具有抗菌、抗炎、鎮痛、抗腫瘤、免疫調節、解毒、抗過敏、抗氧化、保肝、止血與止瀉等作用，臨床主要用于痢疾、上呼吸道感染、肺炎、病毒性肝炎、腎盂腎炎、腸炎、皮膚濕疹等疾病。地錦草的民間應用也較為廣泛，研究小組在走訪收集民間驗方期間發現有2 名類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）患者使用地錦草鮮草搗成泥外敷關節處，3～5 天換藥一次，1 個月左右關節處腫脹已經全部消失，疼痛消失，行走自如。關于地錦草對RA 的作用研究暫無報道，故本研究通過網絡藥理學初步探討其對RA 的作用機制，并通過分子對接模擬實驗驗證，為進一步深入研究開發提供參考依據。

1 方法

1.1 地錦草的活性成分及靶點的收集和篩選通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）、中藥分子作用機制的生物信息學分析工具（Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，Batman-TCM，http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/），再結合《中國知網》等文獻檢索進行地錦草的活性化學成分收集和靶點預測工作，設置條件為生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18，篩選出符合條件的活性成分。

1.2 類風濕關節炎疾病靶點預測通過基因組注釋數 據 庫（genome annotation database platform，GeneCard，https://auth.lifemapsc.com/）、人類孟德爾遺傳 數 據 庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，https://www.omim.org/）、DisGeNET 數 據 庫（https://ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/）、藥物靶點數據庫（Therapeutic Target Database，TTD，http://db.idrblab.net/web/），關鍵詞“Rheumatic Arthritis”，獲得疾病相關靶點基因，利用Venny 2.1.0 軟件獲得交集靶點。

1.3 地錦草調控網絡構建利用cytoscape 3.7.1 軟件將藥物-疾病交集靶點進行可視化處理，構建藥物-疾病-靶點網絡關系圖。

1.4 藥物-疾病靶點蛋白間互作網絡將交集靶標基因復制到String數據庫（http：//stringdb.org/），以人為研究對象，設置條件為mendium confidence＞0.9，剔除游離的蛋白靶點，構建出蛋白相互作用PPI 網絡?！肮濣c”代表靶點蛋白，“邊”表示有效成分與靶點之間的聯系。

1.5 靶點功能和通路富集分析利用Bioconductor軟件，借助clusterprofiler 包、pathview包、Dose包，通過R4.4.1 軟件運行獲得基因本體論及通路富集數據并可視化，進行GO功能富集和KEGG通路分析，P＜0.01為篩選閾值，取校正P值前10的條目。

1.6 分子對接通過有機小分子生物活性數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取小分子數據，利用openbabel 轉化為mol 2 格式，使用prepare_ligand4.py腳本為小分子添加電荷，分配原子類型，均設置為半柔性鍵，將小分子保存為pdbqt格式，便于分子對接。PDB 蛋白結構數據庫（https://www.rcsb.org/）下載蛋白受體數據，采用pymol1.7程序將受體蛋白結構中的結晶水和其他小分子刪除，并添加氫原子后保存。載入autodocktool 1.5.6程序，添加電荷，分配原子類型，保存為pdbqt 格式，作為分子對接受體，采用vina 1.1.2 軟件進行分子對接。對接盒子大小設置為能夠恰好包含蛋白的結合位點，選取對接最佳構象作為分子對接結果，結合能評分并進行排序。結合能數值越低，表明結合越好。

2 結果

2.1 地錦草的活性成分及靶點的收集和篩選共收集到51種活性成分，經篩選獲得15種有效活性成分，包含4',5-二羥基黃酮、槲皮素、鞣花酸、山奈酚、紫云英苷、谷甾醇等，其中，已有研究表明槲皮素、山奈酚對RA作用良好[6-9]。活性成分對應的作用靶點共篩選出102個。

2.2 類風濕關節炎疾病靶點預測共篩選出1184個疾病靶點，通過Venny 軟件最終獲得38 個共同靶點，見圖1。

圖1 藥物-疾病靶標圖

2.3 地錦草調控網絡構建藥物-疾病-靶點網絡包含節點138 個及相互聯系的邊191 條，其中表現活躍的成分是槲皮素、山奈酚、4',5-二羥基黃酮。見圖2。

圖2 藥物-疾病-靶點網絡圖

2.4 藥物-疾病靶點蛋白間互作網絡PPI網絡圖顯示，共有67個節點及其相互聯系的277條邊。Degree值排名前20 位的潛在抗類風濕關節炎靶點為IL-6、ALB、CASP3、NOS3、PPARG等。見圖3。

圖3 藥物-疾病蛋白間互作網絡圖（PPI）

2.5 靶點功能和通路富集分析

2.5.1 GO 功能富集分析 通過GO 富集分析，篩選出53 個分子功能條目（P＜0.05），包括DNA 結合轉錄因子結合、泛素蛋白連接酶結合、配體激活的轉錄因子活性、泛素樣蛋白連接酶結合、核受體活性、核糖核酸聚合酶II 特異性脫氧核糖核酸結合轉錄因子結合受體配體活性、組蛋白脫乙酰酶結合、核激素受體結合等，其中多個條目均有報道與RA 關系密切[10-11]，關聯度較高的20條分子功能如圖4。

2.5.2 KEGG 通路富集分析 通過KEGG 通路富集分析將38 個核心靶點篩選出89 條信號通路，包括脂質與動脈粥樣硬化、流體切應力與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、化學致癌-受體激活、白細胞介素-17信號通路、細胞凋亡、NOD樣受體信號通路等，其中多條通路均有報道與RA 關系密切[11-12]，比較關鍵的20 條信號通路見圖5。

圖5 地錦草KEGG分析及氣泡圖

2.6 分子對接本研究通過以上綜合評比分析選擇地錦草5 種主要活性成分與5 個關鍵抗RA 靶點蛋白進行分子對接。如表1 所示，結合能數值越低，表明結合越好。其中，4',5-二羥基黃酮與AR 關鍵靶點蛋白結合最優，槲皮素、山奈酚與PTGS1、AR、DPP4、HSP90AA1、RELA 關鍵靶點蛋白結合評分均較良好，結合能≤-9的強結合共有6組。整體結合評分均較良好，分子對接情況見圖6、圖7。

圖6 槲皮素與5個靶點蛋白分子對接模型圖

圖7 山奈酚與5個靶點蛋白分子對接模型圖

表1 分子對接結合能評分情況表（kcal/mol）

3 討論

民間資料收集發現，地錦草對RA 具有明顯的治療作用，兩位RA患者在使用地錦草鮮草搗泥外敷后，RA 癥狀明顯減輕，生活能力有一定的恢復。為進一步證實其作用，本文通過網絡藥理學和分子對接模擬實驗初步探討地錦草對RA 的分子作用機制，結果顯示其對RA有一定的治療作用，主要與DNA結合轉錄因子結合、核受體活性、泛素蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合、RNA聚合酶II特異性脫氧核糖核酸結合轉錄因子結合受體配體活性、配體激活的轉錄因子活性等分子功能有關，涉及脂質與動脈粥樣硬化、化學致癌-受體激活、流體切應力與動脈粥樣硬化、腫瘤壞死因子信號通路、白細胞介素-17信號通路、細胞凋亡、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE 等眾多信號通路。

目前，關于地錦草化學成分方面的研究較為廣泛，數據文獻統計匯總為51 種，其中槲皮素、山奈酚對RA的作用研究較為全面。槲皮素是一種黃酮醇類的天然產物，主要通過抑制血管生成、滑膜增生、炎癥因子浸潤、中性粒細胞胞外誘捕網生成，調節破/成骨細胞和Th17/調節性T 細胞之間的平衡發揮治療作用，涉及TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-1β、IL-17、IL-10、NF-κB、CXCL1、CXCL5、LTB4、TGF-β、Th17細胞、中性粒細胞以及巨噬細胞等[13-19]細胞因子。山奈酚主要通過抑制FGFR3 激酶活性、降低體內外破骨細胞分化、抑制破骨細胞標志物，如抗酒石酸酸性磷酸酶、整合素β3、MMP9等發揮抗RA作用[6]。另外山奈酚具有較強的抗炎作用，主要涉及MAPK、PKC、PI3K、IL-1、IL-8、IP-10、PGE2、IL-2、TNF-α、NF-κB、AP-1 等[20-22]因子，同時這些因子也均屬于與RA 關系密切的重要因子，因此其作用可能與調節炎癥因子水平有關。

RA 是一種常見的慢性多系統自身免疫性疾病，周期較長，易造成殘疾，此病可發生于任何年齡段，常見于青壯年，發病率高達0.2%～0.4%，嚴重影響患者生活質量。其發病機制[23]主要包含：①免疫細胞感染引起炎癥局部產生大量的炎性細胞、ROS、炎癥因子，從而激活核因子κB、蛋白激酶B、JNK 等信號通路導致RA 形成；②刺激MMPs 促使MMP-2 的產生，導致軟骨、骨骼等損傷加劇RA 的發展；③氧化應激異常；④遺傳和生存環境等因素。發病過程主要涉及PGs、IL-2、IL-6、IL-8、IFN-γ、COX-2、LTs、5-LOX、AA、LTB4、TNF-α、IL-1β、ROS、MMPs、MMP-2、NF-κB、T細胞等因子、蛋白酶、細胞[24-27]。目前抗RA 藥物主要包括非甾體消炎藥、抗風濕藥、糖皮質激素、TNF抑制劑、B 細胞耗竭劑、T 細胞阻斷劑、IL-6 受體單克隆抗體、IL-1受體拮抗劑、靶向小分子抑制劑等[28]藥物，均存在一定的優缺點，療效好的價格昂貴，價格便宜的不良反應多等等，尚存在不足，因此需要醫藥研究者們繼續深入開發挖掘，以造福人類。

綜上所述，地錦草活性成分、作用靶點、RA 疾病靶點基因蛋白三者存在著諸多交集與聯系，可以推斷地錦草具有一定的抗RA 作用，主要與腫瘤壞死因子信號通路、細胞凋亡、化學致癌-受體激活、白細胞介素-17信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路等有關，可為今后進一步研究開發提供參考。