基于網絡藥理學探討石菖蒲-綠茶藥對治療帕金森病的分子機制※

董海玉 梁建慶，2，3▲ 何建成 馬利芳

石菖蒲最早載于《神農本草經》，是天南星科石菖蒲（Acorus tatarrinowii Schott）的干燥根莖，其性溫，味辛、苦，歸心、胃經[1]，具有開竅豁痰、醒神益智、化濕開胃之功。臨床主要用于神昏癲癇、健忘失眠、耳鳴耳聾、脘痞不饑、噤口下痢等癥[2]。其化學成分復雜多樣，主要有揮發油（如細辛醚系列）、非揮發性成分（如生物堿、醛、酸類等）等，其中揮發油為主要活性成分[3]。現代藥理研究表明，石菖蒲具有鎮靜、抗抑郁、抗癡呆、保護心肌細胞、健胃、抗氧化、鎮咳平喘、抑菌抗炎及抗疲勞等多種作用[4]，且對中樞神經系統作用顯著[5]。

茶（Camellia sinensis）為山茶科山茶屬植物[Camellia sinensis（L.）O.Kuntze]的葉芽。最早在神農時期就已經有關于茶藥用的描述：“神農嘗百草，日遇七十二毒，得荼而解之。”[6]荼即為茶。綠茶作為未發酵的茶，其成分較為復雜，包括茶多酚、生物堿、氨基酸、茶多糖、維生素等多種物質，這些營養及藥理成分是發揮生物活性的物質基礎[7]。現代研究發現，綠茶具有抗癌、抗炎、抗菌、抗氧化、調節免疫、治療心腦血管疾病、改善肥胖和糖尿病等藥理作用[8-9]。綠茶不僅能夠提高正常人的認知功能，對神經退行性疾病的預防和治療也具有積極作用[10]。

石菖蒲、綠茶為何建成教授篩選并總結出治療帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）的中藥復方——復方地黃方中的兩味藥[11]。目前有關石菖蒲相關藥對治療神經系統疾病有一定進展，而綠茶治療該病的相關研究較少[12]。網絡藥理學作為近年來一種新的藥理學研究方法，其整體性、系統性和綜合性與中藥多成分、多靶點、整體性的特點具有高度的相似性，為揭示中藥作用的分子機制提供了可能性[13]。因此，本研究旨在利用現有數據庫，運用網絡藥理學方法，收集石菖蒲-綠茶藥對的活性成分及帕金森病的相關靶點，探討石菖蒲-綠茶藥對治療帕金森病的作用機制，同時也為進一步實驗驗證提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 數據庫與軟件BATMAN-TCM 數據庫（Http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）；GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）；Cytoscape3.7.2 軟 件；Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；STRING 數據庫（https://www.string-db.org/）；R 軟件；bioconductor數據包（http://bioconductor.org/biocLite.R）。

1.2 石菖蒲-綠茶藥對成分及靶點的獲取在BATMAN-TCM 數據庫中分別輸入石菖蒲、綠茶的拼音“SHI CHANG PU”“LV CHA”,設置參數為Score cut-off≥20，P-value＜0.05進行藥物成分及潛在靶點初步檢索，后可根據所檢索出藥物的成分和靶點在數據庫中的數量及評分情況調整Score cut-off 的值，確定藥物成分及靶點的納入標準，獲取最終檢索結果。

1.3 石菖蒲-綠茶藥對成分-靶點網絡構建將石菖蒲-綠茶藥對的成分及藥物靶點信息導入Cytoscape軟件中，構建藥物成分-靶點可視化網絡并分析。根據節點度的大小（Degree值，即度值）來篩選藥物的主要活性成分。節點度值是該節點與其他節點相連邊的條數，邊越多，節點度值越大，說明該節點在此網絡中起的作用越大，占據的地位越重要。

1.4 PD相關疾病靶點的搜集在GeneCards數據庫中以“Parkinson’s disease”為關鍵詞進行疾病靶點檢索，并可根據檢索結果及藥物靶點等研究情況設置Relevance score 的數值，篩選并確定納入標準的疾病靶點。

1.5 石菖蒲-綠茶藥對與PD共有靶點篩選及PPI網絡構建將上述獲取的石菖蒲-綠茶藥對的靶點與PD的疾病靶點取交集，篩選出共有靶點，用可視化軟件表示該結果。并將共有靶點上傳至STRING數據庫中進行PPI網絡構建。

1.6 PPI 網絡中核心靶點的篩選在STRING 數據庫下載得到的靶點蛋白信息，并提交至Cytoscape 中，進行網絡分析，計算節點度值，以節點大小、顏色體現。根據度值篩選關鍵的核心基因。

1.7 共有靶點的基因本體(GO)分析和京都基因與基因百科全書（KEGG）通路富集分析運用R 語言對石菖蒲-綠茶藥對與PD 共有靶點進行GO 分析和KEGG 通路富集分析，設置基因物種為人，即“organism=hsa”“pvalue Cut-off=0.05”“qvalue Cut-off=0.05”。分別篩選排名前20 的分子功能（Molecular function，MF）和KEGG富集通路。

2 結果

2.1 石菖蒲-綠茶藥對成分及靶點信息在BATMAN-TCM 數據庫中，設置參數為Score cut-off≥20，P-value＜0.05 時，初步檢索到石菖蒲具有14 種成分528 個靶點（其中2 種成分在該參數條件下無靶點信息），綠茶具有9種成分959個靶點。觀察藥物靶點評分，多數評分較低，為22.373 分，故通過調整Score cut-off 值，最終將參數設置為Score cut-off≥80，Pvalue＜0.05。此時，符合納入標準的石菖蒲成分11種，靶點137個；綠茶成分7種，靶點240個。經篩除重復靶點，石菖蒲-綠茶藥對共有336個靶點。見表1。

表1 石菖蒲-綠茶活性成分及其拓撲參數

2.2 石菖蒲-綠茶藥對成分-靶點網絡石菖蒲-綠茶藥對的18 種活性成分和336 個藥物靶點信息導入Cytoscape 軟件后，進行網絡構建及分析。結果顯示，該網絡共有356 個節點，506 條邊。其中Degree 值排名前5位的藥物成分依次是：維生素U、壬酸、肉豆蔻酸、胡蘿卜素、維生素K，其Degree 值分別是102、71、71、56、30。見圖1。

圖1 石菖蒲-綠茶藥對活性成分-靶點網絡

2.3 PD 疾病靶點信息通過Genecards 數據庫共檢索到與PD 相關的疾病靶點7841 個，計算“relevance score”中位數值為3.2956，選擇分值大于中位數的目標靶點為疾病靶點，最終得到PD靶點3921個。

2.4 石菖蒲-綠茶藥對與PD共有靶點PPI網絡將336 個藥物靶點與3921 個疾病靶點輸入Venny2.1.0,得到166個共有靶點（見圖2），推測可能是石菖蒲-綠茶藥對治療PD 的潛在作用靶點。將166 個共有靶點導 入STRING 數 據 庫，設 置“Organism”為“Homo sapiens”，蛋白相互作用分數設為“Medium confidence=0.4”，得到PPI網絡（見圖3），共166個節點（含3個游離節點），1039條邊，體現蛋白之間的相互作用。

圖2 PD與石菖蒲-綠茶藥對靶點韋恩圖

圖3 PD與石菖蒲-綠茶藥對共有靶點PPI網絡

2.5 核心靶點篩選結果使用Cytoscape3.7.2 的工具“NetworkAnalyzer”計算，得出該PPI 核心網絡共有163 個節點，1039 條邊，節點平均度值為12.75。其中大于平均度值的靶點有70 個，推測這70 個靶點可能是石菖蒲-綠茶藥對治療PD的潛在核心靶點，可能與PD治療密切相關。根據Degree值將前30個靶點用柱狀圖進行呈現，其中Degree 值排名前5的靶點依次是CAT（過氧化氫酶）、GRIN2A（谷氨酸離子受體NMDA型2A 亞基）、GRIN2B（谷氨酸離子受體NMDA 型2B亞基）、SCN2A（鈉電壓門控通道α 亞基2）、GABRG2（γ-氨基丁酸受體亞基γ-2）。見圖4。

圖4 石菖蒲-綠茶藥對治療PD核心靶點（Degree排名前30）

2.6 GO功能富集結果GO富集結果顯示，石菖蒲-綠茶與PD共有靶點共富集到192條結果，其分子功能主要體現在門控通道活動(gated channel activity)、離子通道活性(ion channel activity)、被動跨膜轉運蛋白活性(passive transmembrane transporter activity)、維生素結合(vitamin binding)、電壓門控離子通道活性(voltage-gated ion channel activity)、電壓門控通道活動(voltage-gated channel activity)、有機酸結合(organic acid binding)、羧酸結合（carboxylic acid binding）、陽離子通道活性（cation channel activity）、金屬離子跨膜轉運蛋白活性(metal ion transmembrane transporter activity)、神經遞質受體活性（neurotransmitter receptor activity）等。見圖5。

圖5 石菖蒲-綠茶藥對與PD共有靶點GO富集分析圖

2.7 KEGG 通路富集結果KEGG 富集結果顯示，石菖蒲-綠茶藥對與PD 共有靶點共富集出44 條通路，主要涉及尼古丁成癮（Nicotine addiction）、碳代謝（Carbon metabolism）、神經活性配體-受體相互作用（Neuroactive ligand-receptor interaction）、檸檬酸循環（Citrate cycle）、朊病毒病（Prion disease）、神經退行性疾病的途徑-多種疾病（Pathways of neurodegeneration-multiple diseases）、嗎啡成癮（Morphine addiction）、氨基酸的生物合成（Biosynthesis of amino acids）、精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）、非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease）、阿爾茨海默病（Alzheimer disease）等信號通路。見圖6。

圖6 石菖蒲-綠茶藥對與PD共有靶點KEGG富集分析圖

3 討論

PD 又名震顫性麻痹，是以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直和姿勢平衡障礙為主要特征的中樞神經系統退行性疾病。其主要病理改變為黑質致密部多巴胺能神經元變性或減少和路易小體積聚。治療上西醫以藥物替代療法為主，常規藥物主要有復方左旋多巴、多巴胺受體激動劑等，在長期服藥過程中，療效隨療程進行性下降，且會出現癥狀波動、異動癥等嚴重的不良反應，而中藥復方治療PD臨床療效確切，有著增效減毒的作用，研究顯示了中藥復方活性多組分、作用多途徑、多靶點的作用機制[14-15]。

依據臨床運用復方地黃顆粒治療PD的療效經驗及相關藥理研究，本研究通過對石菖蒲-綠茶治療PD有效成分的篩選，發現維生素U、壬酸等為主要活性成分。維生素U(Vitamin U，Vit U)，即S-甲基蛋氨酸（S-methyl-L-methionine，SMM），為類維生素化合物，廣泛存在于綠葉蔬菜中，具有保護胃、降血脂和抗氧化，參與調節脂肪細胞功能等作用[16]。PD發病多認為與氧化應激、神經炎癥等機制密切相關。在PD 患者中，細胞處于氧化應激狀態產生的活性氧（reactive oxygen species,ROS）致使黑質多巴胺能神經元能量需求超過供應，最終造成多巴胺能神經元受損死亡[17]。腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎性因子的表達可以增加PD 發生的可能性[18]。研究發現，Vit U 能清除過氧自由基，減少H2O2誘導的ROS 生成[19]。實驗研究表明，Vit U 通過增加抗氧化酶活性，改善機體氧化應激狀態，通過降低TNF-α、白細胞介素（IL）-1β 等水平和腺苷脫氨酶活性來發揮抗炎作用，防止組織損傷[20]。因此，Vit U 治療PD 可能與調節氧化應激水平和炎癥因子的表達等有關。壬酸（nonanoic acid，NA），為一種中鏈脂肪酸，研究發現壬酸和辛酸（caprylic acid,CA）通過抑制組蛋白去乙酰化酶，上調內源性宿主防御肽，增強腸上皮免疫屏障功能[21]。近年來研究發現，腸-腦軸可以通過調節腸道菌群預防或減緩PD的發生或發展速度，而腸道菌群失衡可以引起自身代謝產物短鏈脂肪酸（SCFAs）水平的降低，進而破壞腸道上皮屏障，使腔內病原體更容易沿腸-腦軸上移，導致神經炎癥，加速PD 發生[22]。因此，壬酸可能通過調節腸道內環境，增強腸道上皮屏障功能來改善神經炎癥，發揮神經保護功能，進而防止PD患者病情的進一步發展。

本研究發現，石菖蒲-綠茶藥對治療PD的核心靶基因主要有CAT、GRIN2A/GRIN2B、SCN2A、GABRG2等。過氧化氫酶（catalase，CAT）作為一種抗氧化酶，能夠分解過多的ROS，減少氧化應激對神經元的損傷。研究發現，其模擬制劑EUK-189 對于多巴胺能神經元死亡具有神經保護作用[23]，PEP-1-CAT通過降低ROS 和調節細胞存活信號顯著保護神經細胞免受MPP+誘導的死亡,對MPTP 誘導的PD 動物模型具有保護作用[24]。這些發現為與氧化應激相關的神經退行性疾病PD 提供了新的治療思路。GRIN2A/GRIN2B，是編碼N-甲基-D 天冬氨酸(NMDA)受體亞基GRIN基因的兩種變體，GRIN2A變異體通常與癲癇表型相關，而GRIN2B 變異在神經發育障礙患者中普遍存在[25]。NMDA受體作為一種主要的離子型谷氨酸受體之一，在興奮性突觸傳遞、突觸可塑性、神經元和大腦發育中起著關鍵作用[26]。NMDA受體功能障礙與一系列神經和精神疾病有關，包括帕金森病、精神分裂癥等[27]。相關研究[28]發現，家族性PD發病與遺傳基因有關，GRIN2A/GRIN2B 的易感可能影響PD 的發病。可以推測，石菖蒲-綠茶的有效成分可能作用于GRIN2A/GRIN2B，以NMDA 受體亞基為靶點，引起紋狀體突觸功能障礙來對抗PD 中的突觸功能障礙。SCN2A 編碼在中樞神經系統神經元中表達的電壓門控鈉通道NaV1.2，是神經發育障礙患者中最常見的突變基因之一。研究提示，SCN2A 介導的NaV1.2 表達水平可能影響小鼠的主要行為表型[29]；CaMKII作為神經元鈉通道的一種可能的調節因子，其介導的神經元鈉電流調節影響SCN2A Q54小鼠的神經元興奮性[30]。以上研究說明關注SCN2A基因表達可能是治療PD的一個靶點。GABA（γ-氨基丁酸），是中樞神經系統(CNS)中主要的抑制性神經遞質，在CNS 中有兩種類型的受體：GABAA受體和GABAB受體，GABA的調控通過GABA 受體發揮作用[31]。GABRG2 基因，編碼GABAA 受體的γ2 亞基，研究發現GABRG2 基因表達量減少有可能通過PKA/NF-κB 信號通路引起MMP3（基質金屬蛋白酶3）表達量升高，并進而參與細胞損傷修復過程[32]。近年來有研究報道指出，MMP3 與學習記憶、神經元發育和神經退行性疾病密切相關[33]，MMP2、MMP3等分子通過NF-κB、p38MAPK、AKT、βcatenin 等信號通路參與炎癥和氧化應激等過程中[34]。而細胞凋亡、炎癥反應、氧化應激等在多巴胺能神經元變性死亡中都有參與，對帕金森的發病均有重要影響，因此GABRG2 基因對于PD 發病可能具有潛在生物作用。以上提示石菖蒲-綠茶中多個關鍵靶點共同發揮PD治療作用。

KEGG 分析結果表明，石菖蒲-綠茶治療PD 的靶點主要富集在尼古丁成癮、神經活性配體-受體相互作用、檸檬酸循環（TCA 循環）、嗎啡成癮、GABA能突觸等信號通路。尼古丁成癮是指長期攝入尼古丁會使機體對其產生耐受，并使得中樞神經系統內多種神經遞質受體及神經遞質系統發生適應性變化，即發生尼古丁成癮[35]。尼古丁作為煙草中的主要成癮物質，其進入機體內主要通過與煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic ace tylcholine receptor,nAChR) 結合[36]，調節紋狀體中多巴胺釋放，改善由黑質紋狀體多巴胺能缺陷引起的運動損傷，產生神經保護作用，減緩PD 的進展[37]。多項研究表明，尼古丁對PD 的神經保護作用主要包括抗氧化應激、抗炎反應、抗細胞凋亡作用和（或）增加對神經至關重要的神經營養因子的表達[38]，拮抗Mn和Fe所誘導的神經元損傷等[39]，發揮保護PD受損神經元的生物效應。這些綜合數據表明，尼古丁可能是一種有用的治療策略，可作為治療PD 等中樞神經系統疾病的潛在藥物。但目前廣泛認為尼古丁對人體肺臟、血管的損傷程度遠大于尼古丁對多巴胺能神經元的保護作用，因此利用尼古丁達到靶向治療緩解PD的目的仍需進一步斟酌和研究。

綜上，本研究利用網絡藥理學方法探究石菖蒲-綠茶藥對治療PD的復雜藥理網絡關系，發現石菖蒲-綠茶藥對潛在活性成分為維生素U、壬酸等，通過參與氧化應激、炎癥反應等過程，作用于CAT、GRIN2A/GRIN2B、SCN2A、GABRG2 等核心靶基因，調節尼古丁成癮等信號通路，從而對抗神經元損傷，延緩PD的發生、發展。該結果表明，石菖蒲-綠茶治療PD 具有多靶點、多通路的協同作用，可為臨床中藥復方治療PD提供良好依據，為進一步探究中藥治療PD的藥理機制提供基礎。當然，由于多數中藥藥效成分及作用機制尚不明確，藥物靶標主要是通過不同軟件及數據庫挖掘獲取，因此網絡藥理學研究的整個分析過程中蘊含了不確定性因素，在機制探索方面可能存在差異[40]。針對這些不確定性因素，在后續研究中將整合多個數據來源進行補充及分析，并在后期結果分析方面根據結果特點及研究方向采用動物實驗及臨床試驗等方法驗證，保證研究結果準確性，為中醫藥分子機制研究提供更廣闊前景。