微生物發(fā)酵酉素方對脾虛證小鼠的影響※

官清華 黃君陽 陳炳焜 連蓮香 蔡韶芳 饒線明▲

功能性消化不良（functional dyspepsia,FD）約占我國脾胃病門診量的50%[1]，西醫(yī)治療以抑酸、促進胃動力、抗焦慮抑郁等為主[2]，但療效不甚理想，而中醫(yī)從“脾虛”辨證治療FD 具有確切作用[3]。相關(guān)研究表明，現(xiàn)代微生物發(fā)酵中藥具有提高中藥活性成分利用率、增強中藥藥效、降低中藥不良反應(yīng)、節(jié)省藥材資源、保護生態(tài)環(huán)境等優(yōu)點[4]，同時也能達到標準質(zhì)控和開展規(guī)模生產(chǎn)，故筆者將多年臨床實踐用于FD 治療的酉素方，通過新型微生物發(fā)酵配制，對脾虛證小鼠胃腸功能與免疫功能進行相應(yīng)實驗研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級ICR 小鼠80 只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，由閩侯縣上街行難實驗動物工作室提供。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005。分籠飼養(yǎng)于室溫20～26 ℃的環(huán)境，經(jīng)3 d過渡喂養(yǎng)。

1.2 發(fā)酵方法發(fā)酵酉素方（黨參10 g，茯苓15 g，淮山30 g，炒白術(shù)10 g，谷芽6 g，黃芪10 g，薏苡仁30 g，芡實30 g，扁豆30 g，馬蹄金30 g，菜豆殼30 g，陳皮10 g，木香10 g，炙甘草3 g）按藥材總質(zhì)量與清水1∶5的比例，用夾層罐通蒸汽加熱，待溫度達95 ℃開始計時，保持微沸1 h，期間控制溫度在95 ℃以上，煎煮60 min，過濾藥液，并進行酶解和滅酶滅菌處理，按10%接種量接種活化種子液（含5%植物乳桿菌活化種子液、5%嗜酸乳桿菌活化種子液），于40 ℃條件下發(fā)酵3 d，再將中藥發(fā)酵液置于15～20 ℃條件下后發(fā)酵2 d，離心過濾和超濾處理，并進行低溫真空濃縮處理。

1.3 主要試劑與儀器活性炭粉；阿拉伯樹膠；小鼠胃動素檢測試劑盒；酶標定測量儀（ThermoFisher）；高速離心機；灌胃針。

1.4 動物分組、造模及給藥將80 只ICR 小鼠按體重和性別隨機分為4組：空白對照組、模型組、發(fā)酵酉素方低劑量組和發(fā)酵酉素方高劑量組。空白對照組常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲食飲水。其余各組采用飲食不節(jié)加勞倦過度的復(fù)合造模法制備脾虛小鼠模型，即第1 d至第12 d，單日禁食不禁水，不限量喂食甘藍，游泳至耐力極限（即指小鼠口鼻部首次浸入水中）；雙日根據(jù)小鼠體重按0.02 mL/g喂食豬油。模型小鼠出現(xiàn)便溏（嚴重者脫肛）、皮毛枯槁、拱背納呆、體重減輕、瞇眼等癥狀即表示造模成功。

造模成功后，從第13 d開始，空白對照組和模型組予蒸餾水灌胃。發(fā)酵酉素方低劑量組給予低濃度酉素方溶液（濃度22.32 g/kg，為成人單位公斤體重的1倍量），發(fā)酵酉素方高劑量組給予高濃度酉素方溶液（濃度59.81 g/kg，為成人單位公斤體重的2.68倍量），每日早晚各灌胃給藥1 次，連續(xù)給藥7 d。灌胃量按小鼠體重0.3 mL/10 g給藥。

1.5 觀察指標

1.5.1 小鼠一般情況 記錄小鼠體重、體征變化，包括毛色、有無拱背、運動狀況、飲食狀況、大便性狀、有無瞇眼、有無脫肛等。

1.5.2 消化道排空速率的測定 第7 d 灌服給藥后20:00 起禁食不禁水12 h，第8 d 早上8:00 每只小鼠根據(jù)體重按0.02 mL/g 灌服5%活性炭阿拉伯膠混懸液，30 min 后迅速脫臼處死，剖開腹腔，取出小腸（自幽門至回盲部）。將小腸管不加牽引地平鋪在玻璃板上，以幽門為起點，測量炭末在腸管內(nèi)的移動距離（cm）和小腸全長（cm），計算每只小鼠活性炭的移動距離占小腸全長的百分比（%），其值越大則消化道排空速率越快。

1.5.3 胸腺和脾臟臟器指數(shù)的測定 小鼠脫臼處死后，解剖取胸腺和脾臟，分別稱取胸腺和脾臟重量（mg），計算臟器與體質(zhì)量（g）之比，即為胸腺和脾臟指數(shù)（mg/g）。其值越大提示免疫功能強。

1.5.4 胃腸激素的測定 連續(xù)給藥7 d 后摘取小鼠眼眶，取血采集血清，按試劑盒方法測定和計算小鼠血清胃動素（MTL）濃度。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，在滿足參數(shù)檢驗的前提下，運用方差分析檢驗實驗結(jié)果。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況比較以復(fù)合造模法喂養(yǎng)12 d 后，模型組、發(fā)酵酉素方低劑量組和高劑量組小鼠多出現(xiàn)毛發(fā)稀松無光澤、體形消瘦、腹部兩側(cè)凹陷、背微弓、大便稀溏、神情萎靡、瞇眼等癥狀或體征，體重顯著低于空白對照組（P＜0.01），提示脾虛證小鼠造模成功。治療后，與模型組比較，發(fā)酵酉素方高、低劑量組小鼠的毛發(fā)較順亮、食量較大、行為較活躍，體重增加（P＜0.01），而高劑量組與低劑量組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組小鼠體重比較（g，）

表1 各組小鼠體重比較（g，）

注：與空白對照組比較，AP＜0.01，aP＜0.05；與模型組比較，BP＜0.01，bP＜0.05

2.2 各組小鼠消化道排空速率、MLT水平比較與空白對照組比較，模型組的消化道排空速率、MLT 水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，發(fā)酵酉素方高劑量組小鼠的消化道排空速率、MLT 水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠消化道排空定量指標觀測結(jié)果（）

表2 各組小鼠消化道排空定量指標觀測結(jié)果（）

注：與空白對照組比較，AP＜0.01，aP＜0.05；與模型組比較，BP＜0.01，bP＜0.05

2.3 各組小鼠胸腺和脾臟臟器指數(shù)比較與空白對照組比較，發(fā)酵酉素方高劑量組的胸腺指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，發(fā)酵酉素方高劑量組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠臟器指數(shù)定量指標的觀測結(jié)果（）

表3 各組小鼠臟器指數(shù)定量指標的觀測結(jié)果（）

注：與空白對照組比較，AP＜0.01，aP＜0.05；與模型組比較，BP＜0.01，bP＜0.05

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為FD 的發(fā)病因素及機制呈多元化，與胃腸功能障礙、心理精神因素、胃腸激素改變、幽門螺桿菌感染、炎癥、內(nèi)臟高敏感性、特定基因型改變與遺傳易感性、早期生活應(yīng)激等有關(guān)。西醫(yī)主要采取對癥治療，病情易反復(fù)，療效滿意度較差。中醫(yī)認為FD主要是以脾胃虛弱為本，氣機阻滯為標，因此尤其注重健脾補虛來治療消化系統(tǒng)疾病。以飲食不節(jié)加勞倦過度的復(fù)合造模法制備的脾虛動物模型，無其他藥物干擾且更符合臨床特點，可用于相關(guān)中藥的藥理學(xué)研究。

酉素方系第三批全國名老中醫(yī)陳炳焜及饒線明師徒二人臨床多年用于治療FD 的有效實踐方，全方按照中醫(yī)健脾益氣，藥食同源的思路組合，以四君子湯為基礎(chǔ)，佐藥食同源之品，結(jié)合當?shù)夭菟幒现贫伞Ｋ木訙鲎浴短交菝窈蛣┚址健罚牲h參、茯苓、白術(shù)和甘草四味中藥組成。方中君藥黨參具有補氣健脾養(yǎng)胃的功效；臣藥白術(shù)味甘、苦，性溫，可補氣健脾、燥濕利水；佐藥茯苓味甘、淡，性平，可利水滲濕、健脾化痰；使藥甘草味甘，性平，可益氣滋養(yǎng)、通陽復(fù)脈。諸藥共用以益氣健脾，為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)補益脾胃之名方[5]。Meta 分析[6]結(jié)果顯示，四君子湯加味治療FD 在總有效率方面優(yōu)于常規(guī)西藥組。酉素方中有淮山、芡實、扁豆、薏苡仁等藥食同源補脾之品，通過影響消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等相關(guān)功能以達到健脾的作用[7]，方中地方草藥馬蹄金[8]、菜豆殼[9]常被用于理氣消脹，能有效緩解FD癥狀。

但是，由于FD 患者眾多，傳統(tǒng)中藥煎煮費時耗力，無法統(tǒng)一質(zhì)控和規(guī)模生產(chǎn)，因此需要結(jié)合現(xiàn)代工藝進行藥劑轉(zhuǎn)化，以期滿足眾多患者便捷服用的需求。目前，現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)既可滿足標準質(zhì)控、規(guī)模生產(chǎn)、方便攜帶的現(xiàn)實需要，又可以有效提取中藥活性成分，提高中藥利用率，減低中草藥毒性[4]。陳旸等[10,11]利用植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌對人參進行發(fā)酵，將有效成分人參總苷轉(zhuǎn)化為小分子單體人參皂苷Rd 和稀有人參皂苷Rg，有效提高人參有效成分活性與功能性。王身艷[12]采用藥用真菌使草烏發(fā)酵，降低了草烏中劇毒成分烏頭堿、中烏頭堿與次烏頭堿的含量，而增加了毒性較小的苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰中烏頭原堿及苯甲酰次烏頭原堿的含量。故本實驗利用現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)，以新型微生物發(fā)酵制備酉素方藥液，對脾虛證小鼠進行實驗研究。實驗中采用飲食不節(jié)加勞倦過度的復(fù)合造模法制備脾虛證小鼠模型，結(jié)果顯示脾虛證小鼠造模成功。通過對成功造模的脾虛證小鼠給予發(fā)酵酉素方進行治療發(fā)現(xiàn)，高劑量酉素方對于脾虛模型小鼠的體重變化、消化道排空速率、胃動素濃度以及臟器指數(shù)都有較顯著的改善，進一步證實新型微生物發(fā)酵酉素方對脾虛小鼠的胃腸功能和免疫功能有較好的調(diào)節(jié)作用。因此本研究提示，新型微生物發(fā)酵酉素方可通過調(diào)節(jié)胃腸功能和免疫功能而用于治療FD。本研究的不足之處在于未開展陽性藥物組與酉素方（不發(fā)酵）組對脾虛小鼠影響的比較實驗，將在今后研究中進一步予以探討和證實。

綜上，本動物實驗研究證實了新型微生物發(fā)酵酉素方有助于調(diào)節(jié)胃腸功能和免疫功能，后期可進一步探討高劑量酉素方的微生物發(fā)酵法與傳統(tǒng)煎煮法的優(yōu)劣及其作用機制的差異，為廣大FD 患者提供簡便效廉的健康服務(wù)新途徑。