梅花針聯合超聲導入在增生性瘢痕兔耳模型光動力治療中的應用研究

張明莉，柯錦城，焦云鶴，馬 莉

（廈門醫學院附屬第二醫院，福建 廈門，361021）

增生性瘢痕是一種由創傷、手術、燒傷、痤瘡和帶狀皰疹等恢復不當引起的病理性瘢痕[1]，對患者的形體美觀、肢體功能以及心理健康均產生嚴重影響。目前病理性瘢痕仍缺乏非常理想的治療手段，近年來有研究應用光動力療法對病理性瘢痕或其成纖維細胞進行治療，取得了一定的療效，但由于光敏劑前體藥物和光的穿透深度有限，治療效果仍欠理想，需要改善前體藥物給藥方法和光的傳入途徑，以加強瘢痕組織對光動力的治療反應[2]。本研究使用動物模型，擬觀察采用梅花針聯合超聲波導入光敏劑的光動力治療方法對增生性瘢痕的有效性和安全性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與儀器

新西蘭大耳白兔6只，均為雄性，體重2.0～2.5 kg，購自上海市松江區松聯實驗動物場。TUNEL試劑盒購自瑞士Roche公司；Masson染色試劑套裝購自廈門安提海拉生物科技有限公司；光敏劑外用鹽酸氨酮戊酸散購自上海復旦張江生物醫藥有限公司；LED光譜治療儀購自科諾醫學儀器設備有限公司；超聲波導入儀器購自以色列飛頓公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 兔耳增生性瘢痕(HS)模型建立

本研究經倫理委員會審批，參考賈宇博等造模方法[3-4]，6只新西蘭大耳白兔，5%異氟烷氣麻生效后將濃度降低為3%維持麻醉，剃刀刮除兔耳腹側毛發，露出光滑皮膚，充分暴露操作視野，展平兔耳，避開皮下較大血管，沿兔耳腹側長軸用環鉆做直徑8 mm創面，切除全層皮膚，保留軟骨，11號手術刀片以及止血鉗將軟骨膜刮除剔除干凈，后紗布壓迫止血3-5分鐘，待創面自行愈合，愈合前創面未給予碘伏消毒等任何操作。33周后創面上皮化，形成突出于皮膚表面的紅色增生性瘢痕，界限清晰，表面光滑無毛。6只大耳兔每耳造模6～7個，間隔1～1.5cm，共建立60個可供實驗用的瘢痕組織。

1.2.2 實驗分組與方法

造模成功后將60個增生性瘢痕隨機分成3組（實驗組、對照組、空白組），每組20個。實驗組HS先經過梅花針點刺，壓迫止血，外涂20%鹽酸氨酮戊酸凝膠制劑（ALA），超聲波導入（50HZ,占空比50%）2.5 min后外敷3 h，LED紅光源(633 nm)照射30 min，能量密度100 mW/cm2，連續3次，每次間隔1周。對照組HS單純進行光動力治療，20%ALA凝膠制劑外敷3 h后照光30 min，能量密度100 mW/cm2，連續3次，間隔1周。空白組未經任何處理。光動力治療結束后4周，觀察瘢痕組織大體形態變化，切取各組HS組織進行Masson染色觀察膠原變化，此外使用TUNEL（免疫組化法，具體按照TUNEL試劑盒說明書進行操作）檢測細胞凋亡。

1.2 觀察指標與療效判定標準

TUNEL免疫組化結果判定采用采陽性系數的判定方法[5]，陽性系數記分=染色強度記分×陽性細胞百分比記分。棕黃色、棕褐色為陽性染色，陽性細胞百分比=染色陽性的細胞個數/細胞總數×100%，＜5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，＞51%記3分。顯微鏡下隨機選擇3個高倍視野（400×），依據染色強度進行評分，不染色記0分，淡染色記1分，中等強度染色記2分，深染色記3分。陽性系數判斷標準：陰性(-)為0～1分；弱陽性()為2～3分，中等陽性()為4～6分，強陽性()為9分。療效判定標準：陽性系數0～1分無效，2～3分為顯效，4分以上為優效。

1.3 統計學分析

采用SPSS 23.0統計軟件，等級資料采用非參數秩和檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組瘢痕組織外觀形態變化

治療前HS組織色紅、隆起、質硬韌；治療后，實驗組HS色澤明顯變淡、質地明顯變平變軟，空白組瘢痕組織色略暗淡、質地變化不明顯，對照組變化介于兩者之間，見圖1。

圖1 治療前后瘢痕組織外觀形態變化

2.2 各組瘢痕組織膠原纖維Masson 染色

膠原纖維呈藍色。空白組真皮膠原纖維粗大紊亂，排列緊密；實驗組膠原變細、排列規則疏松；對照組膠原粗細、排列密度及規則度方面的改善均較實驗組為弱、較空白組明顯，見圖2。

圖2 治療后瘢痕組織膠原纖維Masson 染色

2.3 TUNEL 結果

3組TUNEL檢測細胞凋亡情況見表1和圖3，各組染色結果陽性系數等級分布見表2，各組療效比較見圖4。經非參數秩和檢驗，實驗組與對照組以及實驗組與空白組有效率兩兩比較，Z值分別為-2.190和-3.543（P＜0.05）。

表1 三組陽性細胞百分比均值（，%）

表1 三組陽性細胞百分比均值（，%）

圖3 TUNEL 檢測細胞凋亡情況

表2 三組陽性系數等級分布

圖4 各組療效情況

3 討論

光動力（PDT）治療病理性瘢痕，是近年來研究較多的新方法。現有研究發現PDT療法通過上調基因p53/p21、Bax/Bcl-2的比值以及caspase-3剪切等機制導致成纖維細胞凋亡[6]，同時PDT明顯限制成纖維細胞TGF-β1及堿性成纖維細胞生長因子mRNA的表達[6,7]，減少血管形成[8]，抑制細胞增殖，促進成纖維細胞凋亡，進而使血流減少、柔韌性增加、膠原蛋白和血紅蛋白水平下降[9]。由于光敏劑前體藥物吸收有限等因素制約，PDT在瘢痕方面的治療效果仍有待提升。

梅花針是我國傳統醫學當中重要外治法之一，現代醫學中屬于物理治療范疇[10]。梅花針叩刺可人為造成眾多微小孔道，有利于外用藥物滲透吸收[11]。有研究采用梅花針垂直叩刺皮膚癌皮疹預處理后進行10%鹽酸氨酮戊酸（ALA）凝膠封包，可提高ALA的藥物滲透，加強了ALA-PDT 治療皮膚腫瘤的療效[12,13]。

超聲波技術是現代醫學常用技術手段之一，除了作為常規檢查技術，還可以用于疾病的治療。當一定強度和頻率的超聲能量作用于液體時會產生眾多微小氣泡，這些微泡會發生震蕩、膨脹甚至爆裂，這稱之為超聲波的空化效應。當空化效應發生在細胞膜表面時，細胞膜形成瞬時可逆的斷裂、塌陷，形成聲孔效應，從而增加細胞膜通透性，有利于藥物轉運到細胞內[14]。發生空化效應時，聲場能量瞬間釋放，細胞微環境可以產生高溫高壓，產生活性氧物質、細胞降解壞死等一系列繼發損傷。同時Prescott[15]等發現超聲波空化效應可以通過破壞細胞骨架而直接使細胞損傷死亡。

本研究將梅花針與超聲波導入聯合使用，研究結果顯示，實驗組（梅花針聯合超聲波導入處理后再進行光動力治療組）的瘢痕組織色澤更淡，質地較對照組

（單獨光動力治療組）和空白組（未給予任何處理）更平軟，且膠原變細、排列更規則疏松；實驗組細胞凋亡水平亦高于其他兩組。從研究結果看，光動力治療前經過梅花針點刺聯合超聲波導入光敏劑前體藥物的方法對增生性瘢痕治療有效，且較單純光動力治療效果佳，可能與梅花針點刺打開組織通道后超聲波加強促進了光敏劑前體藥物的滲透轉運吸收有關，光敏劑前體藥物吸收增加可能使后續產生的單線態氧或氧自由基等活性氧物質增加，進而加強細胞毒性等光化學反應作用，增強光動力治療效果。其次，超聲波的空化效應可以使組織細胞骨架受損，促進細胞崩解，增加活性氧物質的產生，加速細胞傷亡，也可能協同強化了光動力的治療作用。這提示梅花針點刺聯合超聲波導入促滲的方法可有效增強增生性瘢痕的光動力治療效果。近年有研究表明，光敏劑ALA的代謝產物原卟啉(PpIX)也是一種較強的聲敏劑，在適當頻率和強度的超聲波作用下產生聲-化學效應，造成組織細胞損傷死亡，故本研究中若在ALA凝膠外敷結束充分產生PpIX時再次給予超聲波作用，聯合光照依次進行，筆者認為這是再次增強光動力治療效果可以考慮嘗試的方法。同時，本研究為動物實驗研究，樣本量偏小，操作過程中存在不可避免的實驗誤差，使得實驗結果可能存在一定偏差。由于經費等問題，本研究中未能比較不同組別間光動力治療后不同時段細胞凋亡水平的差異，未能探究梅花針和超聲波單獨預處理對光動力療效的影響；由于實驗條件等限制，本研究亦未能直接檢測梅花針聯合超聲波導入處理后光敏劑前體藥物的真實吸收水平、所產生的活性氧物質的具體含量，使得本研究存在一定的局限性，有待后續研究完善。