湖北省某奶牛場乳腺炎主要病原微生物的分離鑒定與藥敏分析

許順鑫，張海艷，胡長敏，金爾光，李 東，胡秀秀,4，陳 潔

(1.武漢市農業科學院畜牧獸醫研究所，湖北 武漢 430208 ； 2.華中農業大學動物醫學院，湖北 武漢 430070 ；3.武漢市動物疫病預防控制中心，湖北 武漢 430016 ； 4.長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)

奶牛乳腺炎是奶牛養殖業中最常見且對奶牛生產危害最嚴重的一種復雜的乳腺綜合疾病，可由病原微生物入侵、機械性刺激或化學物理性損傷等因素引起，導致奶牛出現妊娠率降低、流產率升高等，影響奶牛的繁殖性能[1]。據統計，1例普通的臨床型奶牛乳腺炎的治療費用平均在150元左右，嚴重者可能高達幾百元，極大地增加了奶牛的養殖成本[2]。

目前已知能夠引起奶牛乳腺炎的病原微生物有150種之多[3]，其中以金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸埃希菌為主，約占所有病原微生物的90%以上[4]。牛無綠藻(Protothecabovis，P.bovis)曾被命名為中型無綠藻基因Ⅱ型(Protothecazopfiigenotype Ⅱ)，后根據Jagielski等[5]的研究重新分類命名為P.bovis，其被認為是可導致奶牛隱性乳腺炎的一種條件性致病藻類。近年來，由P.bovis所引起的奶牛乳腺炎在波蘭[6]、韓國[7]、日本[8]、德國[9]、意大利[10]等國家被大量報道，在我國北京、天津、山東等地也相繼出現牛無綠藻性奶牛乳腺炎的報道[11-12]。

本試驗對湖北省某規模化奶牛場引起奶牛乳腺炎的主要病原菌進行分離培養、革蘭染色鏡檢、分子生物學方法鑒定，并對主要病原菌分離株進行體外藥敏試驗及分析，以期對奶牛乳腺炎的防控提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑 沙氏葡萄糖瓊脂培養基(Sabouraud dextrose agar medium，SDA)、沙氏葡萄糖液體培養基(Sabouraud dextrose broth medium，SDB)、無綠藻選擇性培養基(Prototheca selective medium，PIM)、胰酪大豆胨瓊脂培養基(Tryptose soya agar，TSA)和胰酪大豆胨液體培養基(Tryptose soya broth，TSB)，均購自青島海博生物技術有限公司；革蘭染色液，購自珠海貝索生物技術有限公司；乳酸酚棉藍染色液，購自上海源葉生物科技有限公司；DNA Marker(DL1 000、DL2 000)、ExTaqDNA聚合酶、Buffer緩沖液、dNTP和ddH2O，均購自TaKaRa公司。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺，北京亞泰科隆儀器技術有限公司產品；Ⅱ級生物安全柜，蘇州蘇潔生物有限公司產品；GI80DWS型立式自動壓力蒸汽滅菌鍋，廈門致微儀器有限公司產品；BM2000型臺式光學顯微鏡，南京江南永新光學有限公司產品；HYL-C型全自動振蕩培養箱，太倉強樂實驗設備有限公司產品；CP-ST100A二氧化碳培養箱，長沙長錦科技有限公司產品；ETC 811型PCR儀，北京東勝創新生物科技有限公司產品。

1.1.3 藥敏材料 本試驗采用的31種常規抗菌藥敏紙片如表1所示，均購自杭州微生物試劑有限公司，包括青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、喹諾酮類和抗真菌類等；組合式藥敏檢測試劑盒，購自天津市金章科技發展有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳樣采集 乳樣采集于湖北省某規模化奶牛場，根據奶牛生產性能測定體系(Dairy herd improvement，DHI)測定結果和臨床奶牛乳腺炎癥狀進行綜合判斷，選取乳樣中體細胞數高于100萬個/mL或存在輕微臨床型乳腺炎癥狀的奶牛進行采樣，共采集40份樣品，采樣前對奶牛乳區進行清洗消毒，棄置前3把奶，隨后采集15～20 mL多乳區混合生鮮乳樣品于無菌離心管中，置冰盒暫存，2 h內進行細菌分離培養。

1.2.2 細菌分離培養 將乳樣搖勻后進行梯度稀釋，取不同濃度乳樣100 μL接種于TSA、SDA和PIM平板上，使用無菌涂布棒涂抹均勻，于37 ℃恒溫培養箱中培養24～48 h，肉眼觀察菌落的生長狀態和菌落形態，挑取典型的菌落進行劃線純化，并進行唯一性編號，接著對典型單個菌落進行革蘭染色或乳酸酚棉藍染色，在油鏡下進行鏡檢，根據菌落形態和染色特征初步判定細菌類屬。

表1 藥敏紙片名稱和含量Table 1 Names and contents of drug senstitive papers

1.2.3 PCR鑒定 對分離出的典型單個菌落使用16S rRNA通用引物進行擴增，引物序列：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應體系見表2，其中DNA模板為在液體培養基中培養后的菌液。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環30次；72 ℃終延伸10 min，同時設置空白對照，PCR反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)，電泳結束后進行凝膠成像分析。PCR陽性產物送檢測序，在NCBI上進行BLAST同源性分析，確定病原菌的類別。對疑似P.bovis的分離菌株進行cytb特異性引物擴增鑒定[13]，引物序列：cytb-F：5′-GyGTwGAACAyATTATGAGAG-3′；cytb-R：5′-wACCCATAArAArTACCATTCwGG-3′。PCR反應體系見表2，其中DNA模板為在液體培養基中培養后的菌液。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環30次；72 ℃終延伸5 min，同時設置空白對照，PCR反應產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，30 min)，電泳結束后進行凝膠成像分析。

1.2.4 最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)測定 對分離出的P.bovis、葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鏈球菌和棒狀桿菌進行藥物敏感性試驗，按照美國臨床實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法，利用組合式藥敏檢測試劑盒(氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、大觀霉素、多西環素、氟苯尼考、磺胺異噁唑、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、頭孢噻呋、頭孢他啶、恩諾沙星、氧氟沙星、美羅培南、安普霉素、黏桿菌素、乙酰甲喹)進行MIC測定。

表2 PCR反應體系Table 2 PCR reaction system

1.2.5 藥敏試驗 采用紙片瓊脂擴散法。對分離編號后的P.bovis分別接種至SDB培養基中增殖24～48 h，使用麥氏比濁管法調整P.bovis菌液濃度至1×108CFU/mL，使用移液器分別吸取100 μL轉移至SDA培養基上，用無菌涂布棒將菌液均勻涂布于培養基表面；使用滅菌眼科鑷夾取藥敏紙片置于培養基表面貼緊，記錄各藥敏紙片名稱及位置，置于37 ℃培養箱中培養24～48 h后使用游標卡尺測量各藥敏紙片的抑菌圈直徑。敏感度判定參照杭州微生物試劑有限公司官網發布的《藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標準》。

2 結果

2.1 細菌的分離鑒定 本試驗對湖北省某規模化奶牛場奶樣中體細胞數較高的奶牛進行采樣，對病原菌進行分離純化、肉眼觀察(圖1)、染色鏡檢(圖2)和16S rRNA通用引物擴增測序比對進行鑒定，對疑似P.bovis菌株進行cytb特異性引物擴增鑒定(圖3)。結果顯示，40份被檢乳樣中共分離出83株微生物，其中能引起奶牛乳腺炎的病原微生物共有46株，主要為P.bovis、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌(表3)，分離率分別為65.0%(26/40)、12.5%(5/40)和10.0%(4/40)；其他非病原微生物有37株，主要包括干燥棒狀桿菌、芽孢桿菌、庫克氏菌、嗜根考克氏菌等。由此可見，引起該規模化奶牛場奶牛乳腺炎的主要病原微生物為P.bovis、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌。

圖1 肉眼觀察P.bovis菌落形態Fig.1 Colony morphology of P.bovis by naked eyes

圖2 P.bovis顯微鏡下形態(1 000×)Fig.2 Microscopic morphology of P.bovis (1 000×)A:革蘭染色； B:乳酸酚棉藍染色A:Gram staining; B:Lactophenol cotton blue staining

圖3 乳樣分離P.bovis cytb基因的PCR擴增Fig.3 PCR amplification of cytb gene of P.bovis isolated from fresh milk samplesM:DL1 000 Marker； 1～16：P.bovis分離株； 17：陽性對照； 18：陰性對照M:DL1 000 Marker; 1-16:Isolated P.bovis; 17:Positive control; 18:Negative control

表3 湖北省某規模化奶牛場病原微生物分離Table 3 Isolation of pathogenic microorganisms in a dairy farm in Hubei Province

2.2 MIC測定 采用組合式藥敏MIC檢測試劑盒進行測定，結果如表4所示，本試驗分離的P.bovis對甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、氧氟沙星、黏桿菌素敏感，對慶大霉素、氟苯尼考、磺胺異噁唑、恩諾沙星、美羅培南、安普霉素、乙酰甲喹中度敏感，對氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、大觀霉素、多西環素、頭孢噻呋、頭孢他啶不敏感。金黃色葡萄球菌對磺胺異噁唑、安普霉素敏感，對阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、大觀霉素、多西環素、氟苯尼考、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、恩諾沙星、氧氟沙星、黏桿菌素、乙酰甲喹中度敏感，對氨芐西林、頭孢噻呋、頭孢他啶、美羅培南不敏感。乳房鏈球菌對氨芐西林、慶大霉素、氟苯尼考、磺胺異噁唑、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、頭孢噻呋，頭孢他啶、恩諾沙星、氧氟沙星、美羅培南敏感，對阿莫西林/克拉維酸、大觀霉素、安普霉素、黏桿菌素、乙酰甲喹中度敏感，對多西環素不敏感。

2.3 藥敏試驗 采用藥敏紙片測定P.bovis對抗菌藥物的敏感性，結果如表5所示，P.bovis對頭孢類、喹諾酮類、大環內酯類、四環素類、糖肽類、β-內酰胺類、林可霉素類和磺胺類的大部分抗菌藥均不敏感，僅對多黏菌素B、丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素、兩性霉素B中度敏感，對抗真菌類抗菌藥制霉菌素B敏感。

表4 主要病原微生物MIC測定結果Table 4 MIC determination results of main pathogenic microorganisms (μg/mL)

續表

表5 26株P.bovis對主要抗菌藥物敏感性Table 5 Sensibility of 26 strains P.bovis to major antibiotic agents

續表

3 討論

本試驗對湖北省某奶牛場的部分乳腺炎患牛乳樣進行主要病原微生物的分離和鑒定，分離出主要病原微生物為P.bovis、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌，其中P.bovis的分離率為65.0%。同時也分離出大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等奶牛乳腺炎常見病原微生物。Shahid等[11]報道,由北京、天津和山東省所采集到的620份牛奶樣品中分離出84株P.bovis，分離率為13.5%，從收集到的410份環境樣品中分離出21份P.bovis，分離率為5.1%；張寒琪等[12]報道的北京某規模化奶牛場中采集的11份臨床型乳腺炎奶樣中分離出8株P.bovis，分離率為72.7%；Alfonso等[14]報道意大利的科莫省、萊科省、米蘭省、洛迪省4個地區奶牛乳腺炎流行病學調查情況中，主要病原微生物為金黃色葡萄球菌(42.0%)、無乳鏈球菌(9.6%)、P.bovis(11.1%)、牛分枝桿菌(1.55%)；Jagielski等[15]對波蘭16個奶牛場奶牛乳腺炎進行流行病學調查，發現主要病原微生物為鏈球菌屬(19.3%)、葡萄球菌屬(7.8%)、P.bovis(8.0%)；朱俊平[16]報道的山東省東營市奶牛乳腺炎流行病學調查顯示，主要致病菌為無乳鏈球菌(27.2%)、金黃色葡萄球菌(26.5%)、大腸埃希菌(15.1%)、停乳鏈球菌(12.1%)；沈陽陽等[17]報道的蘇中地區部分規模化牧場奶牛乳腺炎流行病學調查情況中，主要致病菌為金黃色葡萄球菌(15.0%)、大腸埃希菌(55.0%)、枸櫞酸桿菌(35.0%)、不動桿菌(30.0%)和肺炎克雷伯菌(30.0%)；王玲等[18]報道的廣西壯族自治區某規模化奶牛場的奶牛乳腺炎流行病學調查發現，假絲酵母菌分離率最高，達73.1%；王軍等[19]對青海省部分規模化奶牛場乳腺炎進行調查發現，主要致病菌是大腸埃希菌(14.0%)，其次為金黃色葡萄球菌(4.2%)和鏈球菌(1.4%)。由于地理位置、氣候條件和飼養管理水平不同，奶牛乳腺炎主要病原微生物的分離情況存在較大差異。本試驗為了重點了解奶牛場隱性乳腺炎主要病原微生物種類，專門挑選了前期調查已經證實了的某P.bovis陽性奶牛場作為調查對象，并采集了體細胞數高于100萬個/mL的乳樣進行試驗，結果顯示，P.bovis分離率高達65.0%，明顯高于大多數報道以及本團隊前期調查數據[20]。這進一步提示，P.bovis與奶牛隱性乳腺炎存在著緊密的聯系，其感染機制及相關的防控措施研究值得學者進一步關注和探索。

本試驗中使用紙片瓊脂擴散法和MIC法對分離出的奶牛乳腺炎主要病原微生物進行藥敏分析，通過紙片瓊脂擴散法檢測了分離出的P.bovis對常見抗菌藥的敏感性；通過MIC法檢測了P.bovis與其他常見奶牛乳腺炎病原微生物藥敏分析的差異。結果顯示，該奶牛場所分離出的P.bovis對頭孢類、喹諾酮類、大環內酯類、四環素類、糖肽類、β-內酰胺類、林可霉素類和磺胺類的大部分抗菌藥均不敏感，對多黏菌素B、丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素、兩性霉素B中度敏感，對抗真菌類抗菌藥制霉菌素B敏感；MIC檢測結果顯示，P.bovis對甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、氧氟沙星、黏桿菌素敏感，對慶大霉素、氟苯尼考、磺胺異噁唑、恩諾沙星、美羅培南、安普霉素、乙酰甲喹中度敏感，對氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸、大觀霉素、多西環素、頭孢噻呋、頭孢他啶不敏感。侯榮光等[21]對P.bovis進行藥敏分析表明，P.bovis僅對制霉菌素、慶大霉素、阿米卡星和鏈霉素敏感。目前國內外對奶牛乳腺炎的治療主要依賴抗菌藥物，使用抗菌藥治療在一定程度上可以治愈奶牛乳腺炎，同時奶牛產前給予抗菌藥還能有效防止乳腺炎的發生。結合該奶牛場病原微生物分離情況，P.bovis的感染情況最為嚴重，故可以考慮選擇針對P.bovis有效的抗真菌類或氨基糖苷類藥物進行治療，如制霉菌素B、兩性霉素B、慶大霉素等，同時也需考慮針對乳房鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等其他奶牛乳腺炎常見病原微生物進行綜合防治。鑒于P.bovis是一種條件致病性藻類，能在溫暖、潮濕的環境中長期存在，防控無綠藻性奶牛乳腺炎仍需以加強環境衛生消毒、改善擠奶設備和擠奶程序為主要預防控制手段，輔以干奶期科學使用抗菌藥進行預防，同時考慮使用生物制劑和中藥制劑等新型治療方法進行治療，從而有效降低奶牛乳腺炎發生率，保障奶牛正常生產和乳品質量安全。

目前P.bovis所導致的奶牛乳腺炎在世界范圍內越來越引起人們的重視，由于P.bovis對大多數抗菌藥不敏感，奶牛一旦發生感染很難治愈，且P.bovis一旦感染，在奶牛場環境中可能長期存在，污染奶牛運動場、牛床、飼料、水槽和擠奶機等[22]，P.bovis所致奶牛乳腺炎的流行病學調查、致病機制和防治措施研究值得引起國內外研究者和養殖業主們的重點關注，加快針對P.bovis的中草藥制劑研究及環境消毒劑研發或許對有效防控無綠藻性奶牛乳腺炎起到重要作用。