脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對小鼠巨噬細胞氧化應激及自噬的影響

張 衍，陳長福，劉鼎闊，李 存，湯樹生，李道穩(wěn),

[1. 天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院 天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 西青 300384 ；2. 龍巖市動物疫病預防控制中心，福建 龍巖 364000 ； 3. 鼎正新興生物技術(天津)有限公司 天津市生物飼料添加劑企業(yè)重點實驗室，天津 西青 300383 ； 4. 中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 海淀100193]

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)屬于B型單端孢霉烯族化合物，在各種谷物中經(jīng)常被檢出，由食品中存在的鐮刀菌、漆斑菌、頭孢霉菌和葡萄穗霉菌產(chǎn)生，對人和動物有廣泛毒性。畜禽DON中毒后的主要臨床癥狀表現(xiàn)為嘔吐、胃腸炎癥、腹瀉和腸道菌群紊亂等。AKT/mTOR信號通路屬于自噬負調(diào)控的經(jīng)典途徑之一[1]。有研究證實，自噬抑制劑3-MA和PI3K激活劑740Y-P可以顯著提高DON所損傷細胞的活性，有效恢復細胞形態(tài)，維持正常細胞形態(tài)，抑制DON誘導的細胞凋亡和自噬，保護細胞免受損傷，表明DON誘導的自噬是細胞凋亡所必需的，對其進行抑制可減少DON誘導的IPEC-J2細胞凋亡，且DON可以通過抑制AKT/mTOR信號通路觸發(fā)細胞凋亡和自噬[2]。另外，DON可通過降低抗氧化酶活性、增加細胞活性氧(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化來誘導氧化應激[3]。氧化應激被認為是DON引起肝毒性、免疫毒性、腸道毒性和遺傳毒性的可能機制。有研究表明，DON誘導的ROS積聚在最初階段會導致肝臟損傷，但Nrf2/HO-1相關通路的激活促進了ROS的清除，降低了氧化應激水平，并保護了肝臟免受更嚴重的損傷[4]。

本試驗選擇小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)作為體外模型，分析DON對RAW264.7細胞的毒性作用及其作用機制，測定DON對細胞氧化應激和細胞自噬的影響，初步探討DON對細胞免疫毒性的作用機理，以期為進一步研究DON的免疫毒性以及探究毒性抑制試劑并制定科學合理的谷物毒素污染防治措施提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 DON標準品，購自上海阿拉丁公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶，均購自美國Gibco公司；活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA)、線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)、CCK-8細胞活性檢測試劑盒、小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7)、β-actin抗體、二抗，均購自上海碧云天生物公司；超氧化物歧化酶(SOD)、還原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)檢測試劑盒，均為南京建成生物研究所產(chǎn)品；Nrf2、HO-1抗體，均購自Proteintech生物公司；AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、Beclin-1、LC3B抗體，均購自美國Abcam公司。酶標儀、Western blot電泳儀、轉膜儀和凝膠成像儀，均購自美國Bio-Rad公司；CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱，購自德國BINDER公司；RVL-100-G正倒置一體熒光顯微鏡，購自美國ECHO公司。

1.2 細胞傳代培養(yǎng) RAW264.7細胞接種于培養(yǎng)皿中，匯合度達到80%左右時傳代，吸棄舊液，PBS輕柔洗2次，均勻滴加少量胰酶，室溫消化30 s后加適量DMEM培養(yǎng)全液終止消化，輕輕吹下貼壁細胞，按適當比例將細胞接種于新皿，放入37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 分組及處理 將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細胞按5×104個/孔的細胞密度接種于細胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，分別加入終濃度為0、100、200、400、800 ng/mL和1 600 ng/mL的DON毒素作為對照組和試驗組，另設無細胞無DON的空白組。

1.4 細胞形態(tài)觀察 將RAW264.7細胞接種于6孔板，經(jīng)DON毒素處理24 h后使用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)并記錄。

1.5 細胞活性檢測 將RAW264.7細胞接種于96孔板，經(jīng)DON毒素處理后，分別在孵育6、12 h和24 h后取出96孔板，每孔加100 μL 10% CCK-8溶液，培養(yǎng)箱避光孵育1 h，酶標儀于450 nm處測吸光度值，按照公式計算細胞存活率。

1.6 細胞內(nèi)活性氧檢測 按照試劑盒說明書進行，取6 μL DCFH-DA原液和6 mL培養(yǎng)液混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。將RAW264.7細胞接種于6孔板，經(jīng)DON毒素處理24 h后，棄去舊液，PBS洗2次，每孔加入1 mL DCFH-DA染色液，細胞培養(yǎng)箱中避光放置30 min，取出后PBS清洗3次，使用熒光顯微鏡于綠色熒光通道觀察活性氧水平。

1.7 氧化應激標志物檢測 將RAW264.7細胞接種于6孔板，加入DON毒素處理24 h。用無菌細胞刮板輕輕收集細胞，低速離心后保留沉淀，加少量PBS重懸細胞，用手持式勻漿機破碎離心管中的細胞，BCA法測蛋白濃度。按照試劑盒說明書檢測破碎的細胞液中MDA和GSH的含量、SOD的活性水平。

1.8 線粒體膜電位檢測 將RAW264.7細胞接種于6孔板，經(jīng)DON毒素處理24 h后，按照試劑盒說明書加入JC-1染色工作液和新鮮培養(yǎng)液，混勻后避光孵育20 min，預冷的染色緩沖液清洗2次，加入適量培養(yǎng)液并置于熒光顯微鏡下觀察紅色或綠色熒光表達。

1.9 Western blot檢測氧化應激和自噬通路相關蛋白的表達 將RAW264.7細胞接種于6孔板，經(jīng)DON毒素處理24 h后，加入適量RIPA裂解液，4 ℃、1 000 g離心10 min提取蛋白。用BCA試劑盒測定樣品蛋白濃度，按照30 μg蛋白上樣量計算相應的上樣體積。蛋白加樣至10%～15%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，待分離出所需條帶后停止電泳，并將條帶轉印至0.45 μm PVDF膜上。轉膜結束后將PVDF膜在5%脫脂奶粉中封閉2 h，TBST洗5 min，重復3次，蛋白膜放入一抗(AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、Beclin-1、LC3B、Nrf2、HO-1、β-actin)中4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次后放入相應種屬的二抗中室溫孵育2 h，TBST清洗后滴加適量ECL發(fā)光液，用凝膠成像儀采集蛋白條帶圖像并用Image J分析蛋白灰度值。

1.10 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)的差異性比較采用SPSS軟件中的單因素方差分析，并用GraphPad Prism軟件繪圖，P<0.05表示兩組間差異顯著，P<0.01表示兩組間差異極顯著。

2 結果

2.1 DON毒素對RAW264.7細胞形態(tài)的影響 細胞的形態(tài)觀察結果如圖1所示，對照組的RAW264.7細胞均勻貼壁生長，外觀呈圓顆粒形，邊緣清晰，排列密集，基本無漂浮細胞，細胞密度較高；經(jīng)梯度濃度的DON毒素處理后，隨著DON的濃度增加，細胞的間隙逐漸增大，數(shù)量變少，且細胞的貼壁能力也逐漸下降，800 ng/mL和1 600 ng/mL濃度的DON處理后無活性的懸浮細胞明顯增多。

圖1 顯微鏡觀察RAW264.7細胞形態(tài)的變化(100×)Fig.1 Microscopic observation of morphological changes of RAW264.7 cells (100×)A：對照組; B：100 ng/mL DON; C：200 ng/mL DON; D：400 ng/mL DON; E：800 ng/mL DON; F：1 600 ng/mL DONA：Control group; B：100 ng/mL DON; C：200 ng/mL DON; D：400 ng/mL DON; E：800 ng/mL DON; F：1 600 ng/mL DON

2.2 DON毒素對RAW264.7細胞活性的影響 CCK-8試驗結果如圖2所示，細胞活性隨DON毒素濃度遞增而逐漸降低，并隨DON處理時間的延長而降低；DON毒素濃度從100 ng/mL增加到1 600 ng/mL時，處理6 h的細胞存活率從92.63%降至59.62%，計算6 h的半抑制濃度(IC50)為2 100 ng/mL，處理12 h的細胞存活率從89.47%降至54.19%，計算12 h的IC50為1 800 ng/mL，處理24 h的細胞存活率從88.49%降至38.57%，計算24 h的IC50為860 ng/mL。由此可知，DON毒素可抑制RAW264.7細胞增殖，并呈時間和劑量依賴性，對RAW264.7細胞有明顯的毒性作用。

圖2 DON誘導RAW264.7細胞毒性Fig.2 Cytotoxicity induced by DON in RAW264.7 cells與對照組相比，*:P<0.05，**:P<0.01; 下同Compared with the control group,*:P<0.05,**:P<0.01. The same as below

2.3 DON毒素對RAW264.7細胞氧化應激的影響 DCFH-DA染色結果如圖3A所示，對照組細胞的綠色熒光點較少，而DON高劑量(800 ng/mL和1 600 ng/mL)時的綠色熒光點較為密集；且與對照組相比，DON處理后的綠色熒光強度會隨著DON濃度的遞增而逐漸增強，表明DON可誘導細胞的ROS產(chǎn)生水平增加，呈劑量依賴性。氧化應激標志物檢測結果如圖3B～3D所示，與對照組相比，隨著DON濃度遞增，細胞中SOD的活性和GSH的含量呈極顯著減少趨勢(P<0.01)，MDA的含量在DON 400 ng/mL濃度處開始極顯著遞增(P<0.01)。表明DON毒素處理可導致細胞抗氧化水平降低，脂質(zhì)氧化水平升高，誘導細胞氧化損傷。

圖3 DON誘導RAW264.7細胞氧化應激Fig.3 Oxidative stress induced by DON in RAW264.7 cellsA:ROS水平(100×); B:SOD活性; C:GSH含量; D:MDA含量A:ROS level(100×); B:SOD activity; C:GSH content; D:MDA content

2.4 DON毒素對RAW264.7細胞線粒體膜電位的影響 DON毒素處理RAW264.7細胞24 h后，線粒體膜電位的變化結果見圖4，隨著DON毒素處理濃度的遞增，線粒體膜電位發(fā)生變化：細胞中代表低電位的綠色熒光逐漸增多，在1 600 ng/mL DON濃度時達到最高；而代表高電位的紅色熒光比例逐漸減少，在1 600 ng/mL DON濃度時近乎消失。結果表明，經(jīng)DON毒素處理后的RAW264.7細胞的線粒體膜電位呈劑量依賴性逐漸降低，線粒體功能發(fā)生異常。

2.5 DON對氧化應激和自噬通路相關蛋白表達的影響 氧化應激通路蛋白表達結果如圖5A所示，與對照組相比，隨著DON毒素濃度增加，HO-1蛋白相對表達量在400 ng/mL DON處理時極顯著升高(P<0.01)，后逐漸降低(P<0.01)(圖5B)；Nrf2蛋白相對表達量在800 ng/mL DON處理時達到最高值，與對照組相比極顯著升高(P<0.01)(圖5C)。自噬通路蛋白表達結果如圖5D所示，與對照組相比，隨著DON毒素濃度遞增，LC3II/LC3I的比值在400 ng/mL DON處理時極顯著升高(P<0.01)，后逐漸下降(圖5E)；Beclin-1相對表達量呈劑量依賴性上升，在1 600 ng/mL DON處理時達到最高值(圖5F)；p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR的相對表達量均隨DON濃度增加而減少，p-AKT/AKT在800 ng/mL和1 600 ng/mL DON處理時極顯著低于對照組(P<0.01)，p-mTOR/mTOR在400、800 ng/mL和1 600 ng/mL DON處理時極顯著低于對照組(P<0.01)(圖5G、5H)。結果表明，DON可通過調(diào)控自噬相關蛋白的表達誘導RAW264.7細胞發(fā)生自噬并誘導RAW264.7細胞產(chǎn)生氧化應激。

圖4 DON誘導RAW264.7細胞線粒體膜電位失調(diào)(200×)Fig.4 Mitochondrial membrane potential disorder induced by DON in RAW264.7 cells (200×)A：對照組； B：100 ng/mL DON； C：200 ng/mL DON； D：400 ng/mL DON； E：800 ng/mL DON； F：1 600 ng/mL DON；紅色熒光：JC-1聚合物； 綠色熒光：JC-1單體A：Control group； B：100 ng/mL DON； C：200 ng/mL DON； D：400 ng/mL DON； E：800 ng/mL DON； F：1 600 ng/mL DON； Red fluorescence:JC-1 aggregates; Green fluorescence:JC-1 monomer

圖5 DON對氧化應激和自噬通路相關蛋白的影響Fig.5 Effects of DON on proteins related to oxidative stress and autophagic pathwayA：Western blot檢測氧化應激通路蛋白表達； B：HO-1； C：Nrf2； D：Western blot檢測自噬通路蛋白表達； E：LC3II/LC3I； F：Beclin-1； G：p-AKT/AKT; H：p-mTOR/mTOR A:Western blot was used to detect the expression of oxidative stress pathway; B:HO-1; C:Nrf2; D:Western blot was used to detect the expression of autophagy pathway; E:LC3II/LC3I; F:Beclin-1; G:p-AKT/AKT; H:p-mTOR/mTOR

3 討論

本試驗使用RAW264.7細胞為體外試驗模型，研究DON對單核巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)作用。不同濃度的DON處理細胞后，隨著毒素濃度的增加，細胞排列稀疏，貼壁能力下降。CCK-8法檢測細胞存活率的結果顯示，DON顯著抑制細胞增殖，有明顯毒性作用。線粒體是ATP合成、信號傳遞、代謝以及細胞因子產(chǎn)生所必需的重要細胞器[5]，其狀態(tài)與細胞代謝關系緊密。線粒體可以產(chǎn)生活性氧，是活性氧的靶位點，同時線粒體的膜電位也與細胞凋亡有關聯(lián)[6]。線粒體途徑引起的細胞凋亡主要是由于凋亡信號刺激引起蛋白質(zhì)、基因和線粒體膜通透性發(fā)生改變。有研究證明，DON染毒可誘導豬脾淋巴細胞ROS升高，并削弱線粒體融合，表明線粒體損傷與ROS的產(chǎn)生是相互關聯(lián)的，線粒體受損可導致ROS增多[7]。

單端孢霉烯族毒素可以誘導ROS的過量積累，增加脂質(zhì)過氧化程度，改變細胞膜和抗氧化系統(tǒng)的完整性[8]。細胞抗氧化能力下降和ROS含量增加是細胞產(chǎn)生氧化應激的主要原因。細胞內(nèi)的主要抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和還原型谷胱甘肽(GSH)[9]。有研究表明，ROS清除劑N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)可顯著降低DON暴露引起的細胞ROS積聚，并減少細胞凋亡，表明DON通過促進ROS過量產(chǎn)生而導致腸上皮細胞的損傷[10]。Habrowska-Górczyńska等[11]證明，DON(2～5 μmol/L)會導致ROS產(chǎn)生增加，SOD抗氧化活性降低，與核轉錄因子(NF-κB)和缺氧誘導因子1α(HIF-1α)信號通路相關的基因表達顯著增加。同樣，DON在雞的氧化應激過程中可調(diào)節(jié)HIF-1α的表達，并在抑制癌細胞生長的過程中結構性地調(diào)節(jié)NF-κB的表達[12]。本試驗結果顯示，DON可顯著降低RAW264.7細胞中SOD的活性和GSH的含量，顯著增加脂質(zhì)氧化物MDA的含量；顯著增加ROS的產(chǎn)生，導致細胞發(fā)生氧化應激；顯著降低線粒體膜電位，表明DON可誘導細胞發(fā)生氧化損傷和線粒體損傷。抗氧化元件Nrf2/ARE可驅動抗氧化物[包括血紅素加氧酶-1(HO-1)、SOD、GSH等]的表達調(diào)控，以減輕氧化應激造成的損害。ROS的積累會導致Nrf2的釋放，釋放的Nrf2移位到細胞核中并與抗氧化反應元件(ARE)結合[13]。而Nrf2/ARE通路下游的抗氧化基因HO-1可被Nrf2激活，將血紅素分解為膽綠素，膽綠素可被還原酶轉化為具有抗氧化活性的膽紅素。DON可誘導氧化應激，Nrf2從KEAP-1解離，轉位到細胞核后，上調(diào)了HO-1的表達，以保護細胞免受氧化損傷[14]。本試驗結果顯示，DON染毒RAW264.7細胞可隨梯度濃度上調(diào)HO-1和Nrf2的蛋白表達，并分別在DON濃度大于400 ng/mL和800 ng/mL后逐漸下調(diào)，推測可能原因為氧化應激激活后機體活性氧過量積累，到達一定閾值后負向調(diào)控Nrf2/HO-1通路。有研究發(fā)現(xiàn)，HO-1激活劑氯化血紅素(Hemin)在早期階段可上調(diào)細胞的抗氧化能力，但隨著DON處理時間的延長，這種能力受到抑制[15]。這意味著盡管HO-1的表達對氧化損傷具有保護作用，但可能存在一個限值，超過這個限值，HO-1的表達就會變得有害并可能引發(fā)氧化損傷[16]。

AKT/mTOR信號通路是自噬過程中重要的調(diào)節(jié)因子[17]，它可以介導神經(jīng)保護[18]。有研究表明，刀豆球蛋白A可誘導HeLa細胞自噬，導致AKT磷酸化蛋白表達降低[19]。為了進一步研究AKT/mTOR通路在DON誘導的RAW264.7細胞自噬中的作用，本試驗檢測了自噬通路相關蛋白的表達。結果顯示，隨著DON濃度的增加，AKT、mTOR蛋白的磷酸化水平呈下降趨勢，在800 ng/mL DON時達到最低，表明AKT/mTOR信號通路在DON誘導的RAW264.7細胞自噬中處于被抑制狀態(tài)，本結果與Wang等[20]的結果相似。LC3包含LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式。在自噬的誘導下，LC3從細胞核移位到胞漿與自噬小體結合，隨后LC3前體被剪切形成LC3-Ⅰ，后與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3-Ⅱ[21]。由于LC3在自噬體膜中含量豐富，因此被當作自噬的標志物[22]。Han等[23]在DON誘導豬卵母細胞自噬和凋亡的研究中觀察到自噬空泡和自噬小體增多時，LC3的mRNA表達也隨之增強。Beclin-1是細胞自噬過程中至關重要的蛋白分子，可誘導自噬體膜形成，促進自噬體的成熟，從而調(diào)控自噬[24]。本試驗結果顯示，隨著DON濃度的增加，LC3II/I的比值和Beclin-1表達水平逐漸升高，表明DON可以誘導細胞自噬。

綜上所述，DON可抑制RAW264.7細胞活性，刺激細胞產(chǎn)生過量ROS，激活Nrf2/HO-1通路誘導氧化應激，Nrf2、HO-1蛋白表達上升，并抑制抗氧化物活性，脂質(zhì)氧化物增多。ROS的積聚可破壞線粒體功能，使線粒體膜電位降低。另外，自噬蛋白LC3II/I、Beclin-1表達增多，AKT、mTOR磷酸化減少，表明DON可通過抑制AKT/mTOR通路誘導自噬。本試驗可為后續(xù)研究DON誘導的細胞氧化應激與自噬之間串聯(lián)互擾作用及DON免疫毒性的相關研究提供一定參考。