黃連對不同機制介導的大腸桿菌耐藥的消除作用

王芝超，左 麗，曠年玲，鄧聰聰，鐘翠紅,2，林冬梅,2，張永英,2

(1. 河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056000 ； 2. 河北省禽病工程技術研究中心，河北 邯鄲 056000)

近年來多重耐藥大腸桿菌的出現和廣泛傳播，給疾病治療帶來了巨大困難[1]，致使抗菌藥物治療效果越來越差。大腸桿菌耐藥性由多重耐藥機制決定[2]，大腸桿菌R質粒攜帶多種耐藥基因，使細菌對某些抗菌藥耐藥[3]；β-內酰胺類耐藥大腸桿菌可水解其中β-內酰胺環，導致抗菌藥敏感性降低[4]；大腸桿菌主動外排系統將進入細胞內的藥物轉運至細胞外，使胞內藥物濃度下降，逃避藥物殺傷作用；大腸桿菌耐藥率與生物膜形成能力成正比[5]。而中藥成分復雜，一種中藥含有多種有效成分，具有多靶位效應，對于不同耐藥機制介導的大腸桿菌耐藥性消除較單一成分更具有實際應用價值。

黃連具有清熱、燥濕和排毒等功效，具有廣泛藥理活性。研究表明，小檗堿為黃連中最重要的活性單體，其抗菌能力強，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌等具有明顯抑制作用[6]。寧官保等[7]研究發現，大腸桿菌經黃連提取液作用后缺失2條質粒條帶。吳崢嶸[8]研究表明，將高、中、低濃度雙黃連分別作用于多重耐藥大腸桿菌時，β-內酰胺酶活性由初始(9.52±0.71) U/mg分別降至(3.81±0.36) U/mg、(7.54±0.49) U/mg、(9.08±0.61) U/mg，并且當雙黃連作用耐藥菌24 h時，大腸桿菌細胞膜結構被完全破壞，出現細胞質流失。但尚未發現有關黃連對大腸桿菌4種耐藥機制消除情況的研究，因此本試驗根據中藥消除耐藥大腸桿菌耐藥機制，檢測經黃連作用后耐藥大腸桿菌R質粒攜帶情況、超廣譜β-內酰胺酶(Extended spectrum beta-lactamases，ESBLs)活性、主動外排泵基因acrA、acrBmRNA相對表達量及生物膜粘附性情況，為臨床篩選新抑制劑提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物、試劑及菌株 黃連，購自邯鄲同仁堂藥房；質粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。4株對β-內酰胺類藥物耐藥的大腸桿菌(命名為E-1～E-4)，由河北工程大學禽病工程技術研究中心保存。

1.2 中藥水提物制備 黃連100 g，浸泡30 min，文火熬制2次，合并濃縮，過濾除菌，濃度以生藥計(1 g/mL)。

1.3 中藥水提物最低抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)測定 采用梯度稀釋法，中藥水提物2倍倍比稀釋，共設10個梯度，第1～10孔加入濃度為1×106CFU/mL菌液100 μL，第11孔只加入100 μL菌液作為陽性對照，第12孔加入100 μL LB液體培養基作為陰性對照，混勻，37 ℃培養24 h，觀察結果，無菌生長的最低稀釋度即定為MIC值。

1.4 中藥水提物處理菌液制備 濃度為1×106CFU/mL菌液中加入終濃度為1/2 MIC的中藥水提物，37 ℃搖床培養18～24 h后，將此菌液重新接種至LB液體培養基中，37 ℃搖床培養4.0～4.5 h。

1.5 大腸桿菌R質粒消除試驗 按照試劑盒說明書操作步驟提取細菌質粒，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測對照組(未經黃連水提物處理的菌株)和黃連組(經黃連水提物處理的菌株)R質粒攜帶情況。

1.6 大腸桿菌ESBLs活性試驗 采用雙紙片法頭孢噻肟(CTX)和頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/CA)、頭孢他啶(CAZ)和頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CA)測定對照組和黃連組大腸桿菌ESBLs活性變化。結果判定：參照美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)雙紙片確認方法[9]，若含酶抑制劑紙片抑菌圈直徑-單藥紙片抑菌圈直徑≥5 mm，判為ESBLs陽性。

1.7 大腸桿菌主動外排基因acrA和acrBmRNA表達 按照試劑盒說明書對菌株進行RNA抽提、反轉錄合成cDNA，利用熒光定量PCR法檢測對照組和黃連組外排系統基因acrA、acrBmRNA的相對表達量。具體反應條件見表1，利用2-△△Ct法參照參考文獻[10]對熒光定量PCR的數據進行相對定量分析。

表1 大腸桿菌基因引物信息和熒光定量PCR反應條件Table 1 E.coli gene primer details and qPCR reaction conditions

1.8 大腸桿菌生物膜試驗 采用生物膜陽性篩選方法，在96孔板中分別加入對照組菌液(OD600 nm0.4～0.6)、黃連組菌液和LB液體培養基(空白組)每孔200 μL，每組5個重復，37 ℃培養36～48 h，再經1%PBS清洗、甲醇固定、1%結晶紫染色、33%冰醋酸溶液脫色后，酶標儀測定OD600 nm值。計算和結果判定參照參考文獻[11]：測定值-空白值>0.12判為生物膜陽性，臨界值(AC):空白組平均OD值+3×標準差；不粘附(-)OD4AC。

1.9 統計學分析 使用SPSS軟件進行統計學分析，2個組均數比較用t檢驗，P<0.05為差異顯著，具有統計學意義。

2 結果

2.1 中藥水提物MIC測定 如表2所示，黃連對4株大腸桿菌均有不同程度抑菌效果，其MIC在0.03～0.06 g/mL。

2.2 大腸桿菌R質粒消除試驗 4株大腸桿菌均攜帶3個質粒條帶，經黃連作用后均表現1～3個質粒條帶消除(圖1)。

表2 中藥水提物對4株大腸桿菌MIC值Table 2 MIC value of traditional Chinese medicine liquid on 4 E.coli strains (g/mL)

圖1 大腸桿菌質粒電泳圖譜Fig.1 Electrophoretic map of E.coli plasmidsM：1kb DNA ladder Marker； E-1、E-2、E-3、E-4：對照組； E-1a、E-2a、E-3a、E-4a：黃連組M:1kb DNA ladder Marker; E-1，E-2，E-3,E-4：Control group； E-1a,E-2a,E-3a,E-4a：Rhizoma Coptidis group

2.3 大腸桿菌ESBLs活性試驗 如表3所示，對照組E-1、E-3含酶抑制劑紙片(CTX/CA、CAZ/CA)抑菌圈直徑-單藥紙片(CTX、CAZ)抑菌圈直徑<5 mm，判定為產ESBLs陰性菌；對照組E-2、E-4含酶抑制劑紙片(CTX/CA、CAZ/CA)抑菌圈直徑-單藥紙片(CTX、CAZ)抑菌圈直徑≥5 mm，判定為產ESBLs陽性菌；黃連組E-2、E-4 CAZ和CAZ/CA、CTX和CTX/CA藥敏紙片與對照組相比抑菌圈直徑增大，且差異顯著(P<0.05)，說明黃連可抑制ESBLs活性。

表3 CTX和CTX/CA、CAZ和CAZ/CA對E-1、E-2、E-3、E-4的抑菌圈直徑Table 3 Inhibitory zone diameters of CTX and CTX/CA、CAZ and CAZ/CA to E-1,E-2，E-3,E-4 (mm)

2.4 大腸桿菌主動外排基因acrA和acrBmRNA表達 如圖2所示，與對照組相比，黃連組4株大腸桿菌acrAmRNA相對表達量均下降，且差異顯著(P<0.05)；黃連組E-1acrBmRNA相對表達量下降，但差異不顯著(P>0.05)，E-2、E-3、E-4acrBmRNA相對表達量均下降，且差異顯著(P<0.05)。說明中藥黃連可降低雞源大腸桿菌外排泵基因acrA和acrBmRNA表達量，從而降低外排泵基因表達量，達到消除耐藥目的。

圖2 外排泵基因mRNA相對表達量(2-△△Ct)Fig.2 Relative mRNA expression levels of efflux pump gene (2-△△Ct)A：4株大腸桿菌acrA mRNA相對表達量； B：4株大腸桿菌acrB mRNA相對表達量A:Relative expression of acrA mRNA of 4 E.coli strains; B:Relative expression of acrB mRNA of 4 E.coli strains

2.5 大腸桿菌生物膜試驗 結果見圖3，4株雞源大腸桿菌中E-1測定值-空白值<0.12，判定為生物膜陰性菌；E-2、E-3、E-4測定值-空白值>0.12，判定為生物膜陽性菌；與對照組相比，黃連組E-2、E-4粘附性由中等粘附性(++)變為弱粘附性(+)；E3由強粘附性(+++)變為弱粘附性(+)。

圖3 4株大腸桿菌生物膜粘附性分析Fig.3 Biofilm adhesion analysis of 4 E.coli strains

3 討論

大腸桿菌R質粒攜帶多種耐藥基因，使細菌對某些抗菌藥耐藥。研究表明，中藥可有效消除大腸桿菌R質粒，且在疾病治療中發揮重要作用。劉洋[12]研究表明，山楂水提物作用于8株β-內酰胺類藥物耐藥大腸桿菌后，其質粒條帶均缺失1～3條，耐藥消除率達20%以上。楊奇等[13]研究發現，黃連作用于多重耐藥大腸桿菌后，均有部分質粒條帶缺失，其耐藥消除率達4.8%，黃連中小檗堿可以抑制多重耐藥大腸桿菌細胞膜蛋白合成。

耐藥大腸桿菌產生β-內酰胺酶，可使抗菌藥喪失活性。Shrivastav等[14]研究發現，丁香油和羅勒葉對β-內酰胺酶具有很好的抑制能力，并且2種中藥協同使用效果更佳。曹敏[15]研究表明，蘆薈大黃素、木犀草素、苦參堿、黃連素、香紫蘇醇均能抑制β-內酰胺酶活性。本試驗中，黃連組E-2、E-4 CAZ和CAZ/CA、CTX和CTX/CA藥敏紙片與對照組相比抑菌圈直徑增大，說明黃連可抑制ESBLs活性，增強大腸桿菌對抗菌藥的敏感性，這一結果與吳崢嶸[16]研究結果相吻合。馬馳[17]研究發現，由黃連組成的雙黃連方劑不僅可以消除多重耐藥大腸桿菌R質粒，還可以抑制β-內酰胺酶活性。

主動外排系統(AcrAB-TolC)是大腸桿菌產生對β-內酰胺類藥物耐藥性重要機制之一，該系統將進入細胞內的藥物轉運至細胞外，使胞內藥物濃度下降，從而逃避藥物的殺傷作用達到自我保護的目的。劉坤友等[18]研究表明，苦丁茶處理后的耐藥大腸桿菌，主動外排系統中acrAmRNA表達量由5.01下降至1.77；經小飛揚草處理后的耐藥大腸桿菌，acrAmRNA相對表達量由1.57降至0.32。任玲玲[19]研究發現，小檗屬類植物中黃連可有效抑制主動外排泵活性，由黃連組成的方劑“連黃”，可使耐藥大腸桿菌的外排泵基因acrAmRNA表達量下降，這與本試驗結果相同。本試驗中經黃連處理后耐藥大腸桿菌的外排泵基因acrA和acrBmRNA相對表達量顯著下降，說明黃連可以降低外排泵基因表達量，使細胞轉運能力下降，減少抗菌藥物流出，從而增強大腸桿菌的抗菌藥物敏感性，降低或消除大腸桿菌耐藥性。

大腸桿菌耐藥率與生物膜形成能力成正比，中藥對具有強生物膜形成能力菌株表現出明顯的抑制作用，這為消除大腸桿菌耐藥性提供了基礎。Qu等[20]研究表明，多重耐藥大腸桿菌經槲皮素處理后，其β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶水平顯著升高，大腸桿菌細胞外膜破裂。張玉國[21]研究發現，黃連連續作用四環素類藥物耐藥大腸桿菌后，菌株外膜蛋白OmpF和OmpC由缺失變為恢復表達，使耐藥大腸桿菌外膜粘附性下降，與本試驗結果相同。本試驗中E-1為生物膜陰性菌，黃連組E-2、E-4的粘附性由中等粘附性(++)變為弱粘附性(+)；而E-3由強粘附性(+++)變為弱粘附性(+)，說明黃連可使耐藥大腸桿菌外膜粘附性下降，形成生物膜的能力降低或消失，從而達到消除耐藥性目的。

綜上所述，黃連不僅能消除β-內酰胺類藥物耐藥大腸桿菌的R質粒、抑制ESBLs活性和生物膜的形成，還可以降低主動外排泵基因acrA和acrBmRNA表達量。總之，黃連對不同耐藥機制介導的大腸桿菌β-內酰胺類藥物耐藥均具有消除作用。