不同傳染性法氏囊病病毒株感染對CCL19-CCR7軸系表達量的影響

王秋霞，張 新，楚富茗，王明明，王 芳，盧 浪，魏小兵，余 燕，張艷紅，馬金友，姜金慶，歐長波，劉興友,2

(1. 河南科技學院動物科技學院，河南 新鄉 453003 ； 2. 新鄉學院生命科學與基礎醫學學院，河南 新鄉 453003)

傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)是禽類傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)的病原體，主要攻擊禽類的中樞免疫器官——法氏囊，從而引起育成雞的病理損傷和免疫抑制，若同時混合其他病原感染，往往會引起雞只的大批死亡，給養禽業帶來嚴重的經濟損失。

有研究顯示，在IBDV感染過程中，法氏囊組織受到攻擊，導致前B淋巴細胞凋亡[1-2]，大量的外源T細胞遷移至法氏囊[3]，浸潤法氏囊的T細胞活化后，釋放Th1細胞因子γ-干擾素(IFN-γ)，可刺激巨噬細胞進一步產生促炎細胞因子，如白細胞介素IL-6、IL-1β和趨化因子CXCLi2等[4]，在IBDV感染后的炎癥過程、病毒清除和法氏囊損傷發展以及恢復過程中發揮了重要作用，也造成了周圍組織的病理損傷[5-7]。高通量測序結果顯示，IBDV CJ801株感染早期，部分趨化因子及其受體的表達量明顯上調，其中以趨化因子CCL19的表達量變化最為明顯[8]。

T細胞趨化至法氏囊發揮T細胞免疫應答受宿主基因型和毒株毒力的影響，有研究顯示，宿主基因型和毒株毒力能夠影響IBDV感染后產生的病變程度、細胞浸潤狀態、細胞因子表達水平及信號通路的激活[4,9]。但是，不同毒株感染對趨化因子表達量的影響是否存在差異尚不清楚，為了進一步了解不同毒力毒株感染后對CCL19及其受體基因表達水平的影響，本試驗選取IBDV經典毒株CJ801株和新鄉本地分離毒株HN-1株進行攻毒試驗，比較分析CCL19及其受體CCR7基因表達情況，以期為后續的研究提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 IBDV CJ801株，由北京市農林科學院畜牧獸醫研究所劉爵研究員饋贈；IBDV HN-1株，由本實驗室自新鄉本地病禽體內分離獲得。

1.1.2 試驗動物 SPF種蛋，購自北京梅里亞維通利華實驗動物技術有限公司，孵化后于隔離器中飼養，21日齡進行攻毒試驗。

1.1.3 試劑 總RNA提取試劑盒、質粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒，均購自Omega公司；M-MLV反轉錄酶，購自Promega公司；Real Master Mix (SYBR Green I)，購自Invitrogen公司；其他常規試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物攻毒試驗 將53只SPF雞隨機分成3個組，分別為HN-1感染組、CJ801感染組和對照組，感染組每組20只，對照組13只。分別通過點眼、滴鼻的方式感染，按103EID50/0.1 mL的劑量，給予感染組每只雞0.2 mL IBDV病毒液，對照組每只雞以同樣方式給予0.2 mL PBS。不同組雞只分別飼養在不同的隔離器中，自由飲水、進食，光照、黑夜各12 h。在病毒感染后第1、3、5天和第7天，每組隨機挑選3只雞，麻醉致死，收集法氏囊備用。

1.2.2 RNA提取與反轉錄 分別取感染組和對照組雞的法氏囊組織，經液氮研磨后，按照試劑盒說明書提取總RNA后進行反轉錄，合成cDNA。

1.2.3 引物設計與合成 根據GenBank上已登錄IBDVVP2、禽源CCL19和CCR7基因序列，分別設計1對引物，同時針對β-actin基因設計1對引物作為內參，進行熒光定量PCR(qPCR)檢測。所設計引物見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.4VP2基因PCR擴增 以反轉錄合成的cDNA為模板，使用VP2基因的引物進行PCR擴增。反應程序：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。擴增產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外照射下觀察條帶并拍照。

1.2.5 序列比對分析 PCR擴增呈陽性的HN-1株IBDVVP2片段送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，利用DNASTAR 5.0軟件，將測序結果與GenBank中登錄的不同毒力IBDV毒株(表2)的VP2基因序列進行比對，通過MEGA軟件做進化分析。

1.2.6 qPCR檢測 qPCR使用SYBR Green Master Mix試劑盒，在7500 Real-time PCR儀中進行。qPCR程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個循環；72 ℃ 10 min。qPCR以β-actin為內參基因。所有樣品重復3次確保擴增重復性。使用2-ΔΔCt方法對基因表達水平進行相對含量計算。

1.2.7 數據處理與分析 執行t檢驗分析，利用 Graphpad Prism 7.0 軟件對處理數據生成圖片和分析，將對照組基因表達水平設置為1，評價感染組目的基因表達水平。結果記為“平均值±標準誤”，P<0. 05 表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0. 05 表示差異不顯著。

表2 比對和進化分析所用參考序列Table 2 Reference strains used in the sequence alignment and phylogenetic analysis

2 結果

2.1 動物攻毒試驗 感染組SPF雞攻毒后自第1天開始便出現精神沉郁癥狀，隨著時間的推移，CJ801感染組和HN-1感染組雞只均出現羽毛蓬亂、腹瀉等癥狀。2個感染組剖檢癥狀無明顯差異，均可見胸肌、腿肌的明顯出血，法氏囊呈明顯的“紫葡萄”狀(圖1)；但與CJ801感染組相比，HN-1感染組雞只死亡時間稍延后，感染后期可見胸腺嚴重萎縮。對照組無明顯臨床癥狀，剖檢未見明顯病理變化。攻毒試驗結果表明，感染組SPF雞成功感染IBDV。

圖1 IBDV攻毒SPF雞引起的病理變化Fig.1 Macroscopic lesions in SPF chicken after inoculation with IBDVA: 感染組雞法氏囊； B: 對照組雞法氏囊； C:感染組腿肌和胸肌； D:對照組腿肌和胸肌A: Bursal tissues from infection group SPF chicken; B: Bursal tissues from control group SPF chicken; C: Leg muscles and chest muscles from infection group SPF chicken; D: Leg muscles and chest muscles from control group SPF chicken

2.2VP2基因PCR擴增 為了進一步證實攻毒試驗成功，分別取感染組和對照組雞只法氏囊樣品，提取總RNA，以反轉錄合成的cDNA為模板，對IBDV的VP2基因進行PCR擴增。凝膠電泳結果如圖2所示，無論是CJ801感染組還是HN-1感染組，擴增產物條帶大小均與預期大小一致，對照組未見明顯條帶。

圖2 VP2片段的PCR擴增Fig.2 PCR amplification of VP2 geneM:DL2 000 Marker； 1:對照組； 2:CJ801感染組； 3:HN-1感染組M:DL2 000 Marker; 1:Control group; 2:CJ801 infection group; 3:HN-1 infection group

2.3 序列比對分析 擴增的VP2片段測序后經BLAST分析，與GenBank上登錄的IBDVVP2基因序列一致，進一步證實本次感染成功。為進一步了解本地分離株HN-1的進化關系及其與CJ801株之間的遺傳距離，使用測得的HN-1VP2基因序列與GenBank上登錄的不同毒力IBDV毒株VP2基因序列進行比對，利用MEGA軟件構建進化樹，結果顯示，HN-1株VP2基因序列與UK661、Harbin-1、OKYM、D6948等超強毒株VP2基因序列高度同源，而與CJ801株的VP2基因序列不在同一個小分支上(圖3)。

圖3 CJ801株和HN-1株IBDV VP2序列進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of VP2 nucleotide sequences from IBDV CJ801 strain and HN-1 strain●：本試驗毒株●：Strains in this study

2.4 感染早期法氏囊組織中CCL19基因表達 分別取感染組和對照組雞法氏囊組織，液氮研磨后提取總RNA，反轉錄后進行qPCR擴增，檢測IBDV不同毒株對雞T細胞趨化因子CCL19基因表達量的影響。結果如圖4和圖5所示，盡管CJ801株感染雞CCL19基因的表達要早于HN-1株，達到最高峰的時間也早于HN-1株，但感染后，無論是CJ801組，還是HN-1組，CCL19基因的表達水平均明顯高于對照組(P<0.05或P<0.01)。

圖4 CJ801株IBDV感染SPF雞后法氏囊組織中CCL19 mRNA的表達Fig.4 Chicken bursal CCL19 mRNA expression levels after infection with IBDV CJ801 strain與對照組相比，*：P<0.05,**：P<0.01； 下圖同Compared with the control group,*：P<0.05,**：P<0.01. The same as below

圖5 HN-1株IBDV感染SPF雞后法氏囊組織中CCL19 mRNA的表達Fig.5 Chicken bursal CCL19 mRNA expression levels after infection with IBDV HN-1 strain

2.5 感染早期法氏囊組織中CCR7基因表達CCR7基因的qPCR檢測結果與CCL19基因呈一致的趨勢(圖6、圖7)。感染早期，CCR7基因的表達量明顯升高，HN-1株感染雞CCR7基因的表達和達到高峰的時間均晚于CJ801株。但感染后，2個感染組CCR7的mRNA表達水平均明顯高于對照組(P<0.01)。

圖6 CJ801株IBDV感染SPF雞后法氏囊組織中CCR 7 mRNA的表達Fig.6 Chicken bursal CCR 7 mRNA expression levels after infection with IBDV CJ801 strain

圖7 HN-1株IBDV感染SPF雞后法氏囊組織中CCR 7 mRNA的表達Fig.7 Chicken bursal CCR 7 mRNA expression levels after infection with IBDV HN-1 strain

3 討論

IBDV主要侵襲雞法氏囊組織，破壞其中樞免疫器官法氏囊，導致雞的免疫反應性降低，長期處于免疫抑制狀態，因此，IBD也被稱為雞的“艾滋病”，當合并其他細菌或病毒感染時，極易造成雞只的死亡，給養禽業帶來嚴重危害。有研究顯示，當IBDV侵染法氏囊組織后，IBDV在法氏囊內大量增殖，造成B細胞和巨噬細胞損傷[4,10]，T細胞滲入，最終導致法氏囊組織中T細胞達到65%，而B細胞僅占7%[3]。浸潤法氏囊的T細胞活化后，釋放Th1細胞因子IFN-γ，發揮抗病毒作用；同時上調促炎因子，介導炎癥反應，損傷法氏囊，延緩組織修復。升高的CD4+CD25+T細胞還可能參與IBDV誘導的免疫抑制[6]，而IBDV誘導的免疫損傷也與法氏囊的炎癥、凋亡和炎性細胞因子失衡有關[11]。通常認為，趨化因子與受體結合參與了T細胞遷移的調節作用[12-14]。

在前期研究中，本團隊發現，經典毒株CJ801感染SPF雞后，感染組法氏囊樣品與對照組樣品差異表達基因很多。在感染早期，許多與免疫相關的基因，如炎性反應基因、抗病毒相關基因等，表達水平明顯升高。在炎性反應相關基因中，趨化因子往往通過趨化免疫細胞，參與人和動物許多疾病進程。在對高通量測序結果分析過程中，本團隊發現趨化因子CCL19及其受體CCR7的表達量變化比較明顯，推測CCL19及其受體的相互作用可能在T細胞遷移過程中發揮著非常重要的作用。進一步的研究結果也證實，CCL19是T細胞遷移至法氏囊的主要驅動力[15]。但是這個結果是否具有代表性？不同毒株感染后，趨化因子CCL19及其受體的變化趨勢是否相同？從本試驗的結果來看，無論是經典毒株CJ801還是本地分離毒株HN-1，感染后，盡管引起趨化因子CCL19及其受體CCR7基因表達量達到最高的時間有所差異，但二者都能夠引起趨化因子CCL19及其受體CCR7基因表達量的明顯上升。但是本試驗也觀察到一個奇怪現象：進化分析的結果顯示，本地分離毒株HN-1株VP2基因序列與UK661、Harbin-1、OKYM、D6948等超強毒株VP2基因序列高度同源，而與CJ801株VP2基因序列進化關系較遠。進化分析結果表明HN-1株與CJ801株毒力上存在一定的差異，但感染試驗的結果表明二者毒力相近；HN-1感染后趨化因子CCL19及其受體CCR7表達量的升高要晚于CJ801株，持續時間也偏長。VP2是IBDV的主要保護性抗原基因，其高變區通常能夠影響毒株的毒力，因此，許多學者將其作為分子流行病學和進化研究的指標[16-17]。本試驗也選取了VP2基因序列進行進化分析，但從分析結果和感染試驗結果比對來看，僅使用VP2基因來做進化分析是不夠的。前期研究中，對本地分離株HN-1的B片段進行了比對分析，顯示其B片段與超強毒株存在較大差異，與一些重組毒株具有近的親緣關系[18]。這些結果提示B片段的來源在一定程度上影響了HN-1株的毒力，Lu等[19]、Gao等[20]和Abou El-Fetouh等[21]學者的研究結果，均證實了IBDV B片段對其毒力具有一定的貢獻。因此，推測是由于重組造成毒株的毒力下降，出現了上述情況。

本試驗結果證實，不同毒力IBDV毒株感染均能引起趨化因子CCL19及其受體CCR7基因表達呈一定程度的升高，而IBDV毒株毒力強弱也能夠影響CCL19和CCR7基因表達變化趨勢。這為進一步探究是否可以通過調控CCL19或CCR7基因表達水平，減輕IBDV感染后細胞因子風暴對法氏囊組織的影響提供了數據支撐。