6種藏藥對奶山羊乳房炎葡萄球菌的體外抑菌作用

邱 芳，侯思夢，李芳娥，顧慶云，郭晶晶，劉連杰，周祥玲，劉曉強

(1.西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌 712100 ； 2. 陜西省富平縣畜牧獸醫局，陜西 富平 711700 ；3. 西藏職業技術學院，西藏 拉薩 850030 ； 4. 甘肅武山縣畜牧獸醫服務中心，甘肅 武山 741300)

乳房炎是泌乳動物常見的疾病之一，在奶山羊養殖中較為常見，其發病率高、防治困難，嚴重時還會導致動物死亡，給養殖業造成嚴重的經濟損失[1-2]。葡萄球菌是引起奶山羊乳房炎的常見菌[3]，以金黃色葡萄球菌最為常見，其也是重要的人獸共患病病原微生物，且極易耐藥，一旦感染很難徹底治療，對公共衛生安全造成嚴重威脅。藏藥在我國已有幾千年的歷史，是一種古老的民族藥，流傳至今，對人類健康有不可磨滅的貢獻[4-7]。

近年研究表明，很多藏藥具有良好的抗菌活性，逐漸成為“替抗”研究的熱點。短穂兔耳草是常用的藏藥，全草入藥可用于治療全身發燒、腎炎、肺病、高血壓和動脈粥樣硬化等[8]；藥理試驗證明，其具有體外抑菌、抗炎、降血糖和抗腫瘤等功效[9]。獐牙菜根入藥能去肝火[10]。鉤藤莖枝入藥可降血壓。鐵棒錘塊根可用于治療跌打損傷、骨折、風濕腰痛、凍瘡等癥。甘青青蘭具有平肝、利膽等功效，常用于治療肝炎、膽囊炎、流感、胃炎等疾病。近年來，也有文獻報道了上述藥物的抗菌活性[11-15]。本試驗旨在測定短穂兔耳草、甘青青蘭、烏奴龍膽、鐵棒錘、鉤藤和獐牙菜此6種藏藥對奶山羊乳房炎分離的葡萄球菌的體外抑菌活性，為綜合開發藏藥治療奶山羊乳房炎提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 獐牙菜、烏奴龍膽、鉤藤、鐵棒錘、甘青青蘭(唐古特青蘭)和短穂兔耳草，均購自西藏自治區拉薩市雪域大藥房；青霉素、阿莫西林、頭孢曲松、頭孢噻呋、阿米卡星、克林霉素、環丙沙星、泰萬菌素和多西環素，均購自大連美倫生物科技有限公司；酵母粉、胰蛋白胨，均購自英國OXOID公司；瓊脂粉，購自北京Solarbio科技有限公司；MH培養基、麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂，均購自青島海博生物技術有限公司；革蘭染色液，購自珠海貝索生物技術有限公司；2×TaqPCR Master Mix，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物合成和測序分析由北京奧科鼎盛生物公司完成。

1.2 主要儀器設備 液體加熱器，廣東潮安金石鎮柏源五金制品廠產品；臺式低速離心機TDZ5，湖南赫西儀器裝備有限公司產品；FA1204B電子天平，上海天美天平儀器有限公司產品；微生物培養箱DHP-9051，上海一恒科學儀器有限公司產品。

1.3 奶樣采集 2020年4—6月從陜西省渭南市富平縣3個奶山羊養殖場采集診斷為強陽性、陽性和隱性乳房炎的羊的乳樣品。采集奶樣前需先用溫水清洗采樣乳頭，再用碘酒消毒乳頭，并在清洗或消毒乳頭后均用消毒毛巾擦干。棄去采樣乳區的頭3把乳，然后采集乳樣5～8 mL，擠入滅菌離心管，并做好標記，于冰浴中送回實驗室進行細菌分離和鑒定。采樣前患羊均未接受藥物治療。

1.4 細菌的分離鑒定 搖勻乳樣，劃線接種于5%犢牛血瓊脂培養基，37℃恒溫箱培養24～48 h后，取形態和溶血環不同的單個菌落繼續劃線接種于LB固體培養基、高鹽甘露醇固體培養基和麥康凱培養基，37 ℃恒溫箱培養18～24 h，觀察菌落形態，并選取不同形態單菌落涂片、革蘭染色鏡檢。同時，對各菌落進行生化鑒定和16S rRNA擴增、測序。

1.5 藥液的制備 分別稱取短穂兔耳草、鐵棒錘、鉤藤、烏奴龍膽、甘青青蘭和獐牙菜各20 g，剪碎后放入煎藥砂鍋，加入10倍量蒸餾水，室溫浸泡過夜后煎煮1 h，用4層折疊的紗布過濾，收集濾液。再加入適量蒸餾水，按上述方法煎煮、過濾，重復3次。將3次的濾液合并，加熱濃縮至50 mL，4 000 r/min離心5 min，取上清液置于50 mL燒杯中，進一步加熱濃縮至20 mL，得到濃度為1 g/mL的藏藥水提取物原液，紫外線照射 30 min 滅菌，4℃保存備用。抗菌藥物按照美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的方法配制為1 280 μg/mL的藥液，-20℃保存備用。

1.6 葡萄球菌藥物敏感性試驗 采用CLSI推薦的微量稀釋法測定分離的葡萄球菌對青霉素、阿莫西林、頭孢曲松、頭孢噻呋、阿米卡星、克林霉素、環丙沙星、泰萬菌素和多西環素這9種(7類)抗菌藥物的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration, MIC)。以金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 25923為質控菌株。參考CLSI[16]和歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會(EUCAST)[17]中相關菌種和藥物的標準，判定耐藥折點敏感(Sensitive, S)、中介(Intermediate, I)和耐藥(Resistant, R)。由于對除金黃色葡萄球菌之外的其他葡萄球菌在獸醫臨床的耐藥折點尚無判定標準，所以本試驗中主要參考金黃色葡萄球菌的耐藥折點進行判定。

1.7 藏藥水提取物的體外抑菌活性 采用紙片瓊脂擴散(K-B)法測量抑菌圈直徑。將滅菌的空白濾紙圓片(直徑 6 mm)放入含生藥濃度為1 g/mL 的藏藥水提取物中浸泡12 h，待圓片飽和以后用無菌鑷子取出，置于烘箱烘干備用。以金銀花作為陽性對照。

將菌液調至0.5麥氏濁度涂布于MH培養板，將制備的藏藥紙片貼于 MH 平板上，置于37℃培養箱培養16～24 h后測量抑菌圈直徑，每株細菌重復3次。藥物敏感性判定標準：抑菌圈直徑>16 mm 為高度敏感，11～15 mm 為中度敏感，≤10 mm 為輕度敏感或不敏感。

2 結果

2.1 細菌的分離和鑒定 從55份乳樣中共分離得到52種細菌，共計149株。其中葡萄球菌56株(37.58%)、腸桿菌60株(40.27%)、芽孢桿菌11株(7.38%)、腸球菌2株(1.34%)，其他菌株20株(13.43%)。56株葡萄球菌中包括金黃色葡萄球菌27株、溶血性葡萄球菌10株、表皮葡萄球菌6株、腐生葡萄球菌5株、雞葡萄球菌4株，此外，加利鈉葡萄球菌、科尼葡萄球菌、模仿葡萄球菌、馬葡萄球菌各1株。

2.2 葡萄球菌藥物敏感性試驗 本試驗所選的9種抗菌藥物對56株葡萄球菌的藥敏試驗結果見表1。受試的葡萄球菌對青霉素、阿莫西林和頭孢曲松100%耐藥；金黃色葡萄球菌和溶血性葡萄球菌對阿米卡星、泰萬菌素和多西環素較為敏感；表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌和雞葡萄球菌對阿米卡星和泰萬菌素的耐藥率介于25.0%～50.0%，對其余受試藥物的耐藥率達50.0%～100%，且以多重耐藥菌居多；科尼葡萄球菌和模仿葡萄球菌對9種受試藥物均耐藥，加利鈉葡萄球菌對阿米卡星和多西環素敏感，對其他受試藥物均耐藥；馬葡萄球菌對阿米卡星和泰萬菌素敏感，對其他受試藥物均耐藥。

2.3 藏藥水提取物的體外抑菌活性 采用K-B法測定了6種藏藥水提物對所分離的葡萄球菌的體外抑菌活性，結果見圖 1 和表 2，6種藏藥水提物對各類葡萄球菌均具有不同程度的抑制作用，抑菌圈直徑范圍為7.30～25.50 mm。根據藥物敏感性判定標準及每株受試菌的抑菌圈直徑，短穂兔耳草的抗菌作用最強，所有受試的葡萄球菌均對其高度敏感；其次為鐵棒錘，89.3%(50/56)的受試葡萄球菌對其高度敏感；分別有91.1%(51/56)、89.3%(50/56)、83.9%(47/56)的受試葡萄菌株對鉤藤、獐牙菜和甘青青蘭中度敏感；87.5%(49/56)受試菌對烏奴龍膽輕度敏感或不敏感。6種藥物的抗菌活性依次為短穂兔耳草>鐵棒錘>鉤藤>獐牙菜>甘青青蘭>烏奴龍膽。

圖1 6種藏藥對部分葡萄球菌的體外抑菌試驗Fig.1 In vitro antimicrobial test of six Tibetan medicinal plants against some Staphylococcus isolatesA:溶血性葡萄球菌； B:表皮葡萄球菌； C:金黃色葡萄球菌A:S. haemolyticus; B:S. epidermidis; C:S. aureus

3 討論

本試驗從55份奶山羊乳房炎奶樣中分離得到52種細菌，共149株，其中葡萄球菌56株，占37.58%。金黃色葡萄球菌為主要致病菌，這與國內外許多關于奶山羊乳房炎致病菌的報道相似[18-20]。目前，臨床對于奶山羊乳房炎的治療主要以抗菌藥物為主，抗菌藥物的使用容易導致病原菌耐藥性的出現和蔓延，特別是多重耐藥菌的增多。因此，防控奶山羊乳房炎不應頻繁過量使用同一種或同一類抗菌藥物[21]。另外，羊舍的環境保障也是關鍵，要做到衛生整潔、消毒徹底、科學擠奶、合理干奶以及完善管理等。

從藥敏試驗結果可知，所分離的葡萄球菌對青霉素、阿莫西林和頭孢曲松的耐藥率均達到100%，對其他6種受試的抗菌藥物也具有不同程度的耐藥性；加利鈉葡萄球菌對除阿米卡星和多西環素之外的其他受試藥物均耐藥；馬葡萄球菌對除阿米卡星和泰萬菌素之外的其他受試藥物均耐藥；科尼葡萄球菌和模仿葡萄球菌則對所有受試的抗菌藥物均耐藥(表1)，但是所有分離的葡萄球菌對除烏奴龍膽之外的其他5種受試藏藥普遍具有敏感性(表2)。短穂兔耳草和鐵棒錘對致奶山羊乳房炎的葡萄球菌的抗菌活性最明顯，鉤藤、獐牙菜和甘青青蘭對所受試菌株也表現出較好的抑菌效果，烏奴龍膽則未表現出明顯的抑菌活性。基于本試驗結果，初步篩選出對包括多重耐藥菌在內的葡萄球菌有顯著抑制活性的藏藥，為后續進一步研究其對奶山羊乳房炎的治療作用和新型抗耐藥菌天然藥物的開發提供了科學依據。目前，單味藏藥抑菌研究主要集中于清熱解毒類藏藥對常見致病菌的抑菌作用[22]。2003年，蔣丹等[23]研究了包括龍膽草在內的22種中草藥醇提物對大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的敏感性，結果表明，龍膽草對3種細菌均有較強的抑菌活性，其MICs分別為2.50、2.50 g/mL和1.25 g/mL。2005年，張春江[24]研究了甘肅甘南采集的異葉青蘭、甘青烏頭、烏奴龍膽、五脈綠絨蒿、獐牙菜、蒺藜、兔耳草提取物對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌等細菌的抑菌活性，發現藏藥對所選菌種均有一定抑制作用，其中異葉青蘭和甘青烏頭抑菌活性最強。2006年，靳涵[25]研究了唐古特青蘭水提物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等8個標準菌株的抗菌活性，結果顯示，唐古特青蘭對受試菌株均有不同程度的抑菌活性。2014年，胡君茹等[26]用瓊脂擴散法測定甘青青蘭水和乙醇提取物的抑菌活性，結果顯示，兩者對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均有確切的抑菌作用。2015年，董開忠等[27]研究了鐵棒錘不同提取物的抑菌活性，結果顯示，鐵棒錘具有廣譜抗菌作用，且對以大腸埃希菌為代表的革蘭陰性菌的抑菌活性更顯著。2019年，王曉玲等[28]的研究結果表明龍膽燥濕栓提取液對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和鏈球菌具有較好的抑制作用。

本試驗結果顯示，短穂兔耳草、鐵棒錘、鉤藤、甘青青蘭和獐牙菜對致奶山羊乳房炎葡萄球菌具有較強的抑菌活性，尤其是對金黃色葡萄球菌抑制效果最好，對耐藥菌也有較好的抑制效果，這為解決細菌耐藥性問題提供了研究基礎。本試驗為青藏高原藏藥資源的開發和研究起到積極的推動作用，并對綜合開發利用藏藥治療奶山羊乳房炎具有重要的探索價值。