河北邢臺(tái)及周邊地區(qū)PRRSV流行情況調(diào)查及ORF5基因變異分析

高明艷，葛生虎，文生萍

(1. 青海農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，青海 西寧 812100 ； 2. 河北銘諸生物科技有限公司，河北 邢臺(tái) 054000)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染可導(dǎo)致豬群出現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)，又稱豬藍(lán)耳病，該病的主要臨床癥狀包括母豬繁殖障礙(死胎、流產(chǎn)和弱仔等)、不同發(fā)育階段豬群呼吸困難和高熱等，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。PRRSV基因組大小約為15 kb，可編碼多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，根據(jù)其基因組序列差異可將PRRSV分為2個(gè)基因型，分別為歐洲型(基因1型)和美洲型(基因2型)[3]。

2013年開始，國內(nèi)部分地區(qū)開始流行類NADC30毒株，該毒株的Nsp2氨基酸序列中存在大片段的氨基酸缺失，且毒力與之前流行的歐洲型或美洲型存在較大差異[4]。當(dāng)前類NADC30毒株在我國不同省份廣泛流行，甚至在部分地區(qū)的流行比例呈逐年上升趨勢(shì)[5]。本試驗(yàn)于2021年3—10月從河北邢臺(tái)及周邊地區(qū)采集疑似感染PRRSV病料組織樣品進(jìn)行病原檢測(cè)，旨在了解該地區(qū)PRRSV流行情況及基因型所占比例情況，以期為該地區(qū)PRRS的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；PRRSV美經(jīng)典株/高致病性/類DADC30毒株核酸檢測(cè)試劑盒[實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)-TaqMan熒光探針法]，購自湖南冠牧生物科技有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2 000 DNA Marker、2×PCR預(yù)混液和瓊脂粉末等，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要儀器 FQA-48熒光定量PCR儀，購自杭州博日科技股份有限公司；PCR擴(kuò)增儀，購自力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；超凈工作臺(tái)，購自山東博科再生醫(yī)學(xué)有限公司；瓊脂糖凝膠電泳儀等，均購自蘇州阿爾法生物試驗(yàn)器材有限公司。

1.3 樣品來源 2021年3—10月從河北邢臺(tái)及周邊地區(qū)收集疑似感染PRRSV病豬組織樣品共217份。其中部分病豬臨床癥狀包括繁殖母豬流產(chǎn)或死胎，仔豬或保育豬高熱、呼吸困難等；剩余組織樣品來源病豬未表現(xiàn)以上癥狀。在確定不是非洲豬瘟感染前提下對(duì)病豬進(jìn)行解剖，無菌采集淋巴結(jié)、扁桃體、肺臟等組織樣品，標(biāo)記樣品來源和日期等信息，低溫送至河北銘諸生物科技有限公司，保存于-20 ℃，待檢。

1.4 臨床病料處理及PRRSV核酸檢測(cè) 采用滅菌眼科剪和手術(shù)刀剪取約0.5 g組織樣品，加入少量滅菌PBS溶液后研磨勻漿，反復(fù)凍融后高速離心(12 000 r/min，5 min)，取200 μL上清用于RNA基因組提取，基因組提取步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用PRRSV美洲經(jīng)典株/高致病性/類DADC30毒株核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，若樣品Ct值<35判定為對(duì)應(yīng)毒株核酸陽性，樣品對(duì)應(yīng)Ct值>35判定為陰性。

1.5 類NADC30毒株ORF5基因序列擴(kuò)增與測(cè)序 根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]合成擴(kuò)增PRRSV毒株ORF5基因序列的特異性引物：PRRSV-ORF5-F:5′-GTTTTAGCCTGTCTTTTTGCC-3′，PRRSV-ORF5-R：5′-TA-TATCATCACTGGCGTGTAGG-3′，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。以類NADC30 PRRSV毒株陽性樣品核酸為模板，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法對(duì)毒株ORF5基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系(50.0 μL)：2×PCR預(yù)混液25.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板3.0 μL，無RNA酶水20.0 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，最終72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后取5.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，并在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。將類NADC30 PRRSV毒株陽性產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.6 類NADC30毒株ORF5基因序列分析 從NCBI網(wǎng)站上下載國內(nèi)外具有代表性的PRRSV毒株ORF5基因序列，應(yīng)用DNASTAR軟件(MegAlign)對(duì)獲得的ORF5基因核苷酸序列進(jìn)行同源性分析；使用MEGA 7.0軟件中Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹，其Bootstrap值設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果

2.1 河北邢臺(tái)及周邊地區(qū)送檢樣品PRRSV核酸檢測(cè) 采用qPCR法對(duì)河北邢臺(tái)及周邊地區(qū)采集的疑似PRRSV感染組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1所示，77個(gè)送檢豬場(chǎng)中有43個(gè)豬場(chǎng)存在PRRSV陽性病料，場(chǎng)陽性率為55.84%；217份組織樣品中有105份樣品檢測(cè)為PRRSV核酸陽性，平均檢出率為48.39%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PRRSV廣泛流行于不同送檢地區(qū)，各地區(qū)PRRSV場(chǎng)陽性率和樣品陽性率分別介于40.91%～76.47%和29.85%～75.00%，其中石家莊市流行情況相對(duì)最嚴(yán)重。

2.2 河北邢臺(tái)及周邊地區(qū)不同基因型PRRSV毒株流行特點(diǎn) 進(jìn)一步分析PRRSV陽性毒株基因型發(fā)現(xiàn)，河北邢臺(tái)及周邊地區(qū)同時(shí)存在3種不同基因型的PRRSV流行，但其檢出率存在較大差異。結(jié)果如表2所示，類NADC30毒株檢出率最高，為29.49%(64/217)，高致病性PRRSV毒株和經(jīng)典型PRRSV毒株檢出率分別為15.21%(33/217)和4.61%(10/217)，3種毒株陽性樣品占PRRSV陽性樣品的比例分別為60.95%、31.43%和9.52%。此外，2份樣品存在“類NADC30毒株+高致病性毒株”混合感染，但未發(fā)現(xiàn)其他毒株混合感染現(xiàn)象。

表1 邢臺(tái)及周邊地區(qū)送檢樣品PRRSV核酸檢測(cè)Table 1 PRRSV nucleic acid detection of samples from Xingtai and its surrounding areas

表2 邢臺(tái)及周邊地區(qū)不同基因型PRRSV毒株流行情況Table 2 Prevalence of PRRSV strains with different genotypes in Xingtai and its surrounding areas

2.3 類NADC30毒株ORF5基因序列擴(kuò)增與測(cè)序 凝膠電泳結(jié)果顯示，8個(gè)PRRSV毒株ORF5基因序列均成功擴(kuò)增，其RT-PCR產(chǎn)物大小約600 bp，與預(yù)期大小基本相符，且無非特異性條帶(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示，8個(gè)毒株ORF5基因序列大小均為606 bp，可編碼202個(gè)氨基酸。根據(jù)樣品采集時(shí)間和地點(diǎn)將8個(gè)毒株分別命名為HBXT1-2021、HBXT2-2021、HBHS1-2021、HBHS2-2021、HBSJZ1-2021、HBSJZ2-2021、HBHD1-2021和HBHD2-2021。

圖1 PRRSV毒株ORF 5基因序列RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 RT-PCR amplification of PRRSV ORF 5 geneM:DL2 000 DNA Marker； N：陰性對(duì)照； P：陽性對(duì)照； 1～8：8份樣品M:DL2 000 DNA Marker; N:Negative control; P:Positive control; 1-8:8 samples

2.4 類NADC30毒株ORF5基因序列分析 核苷酸序列分析結(jié)果顯示，8個(gè)PRRSV毒株ORF5基因核苷酸序列同源性為98.5%～99.8%；與類NADC30 PRRSV代表性毒株(如NADC30、HeN1和HeN2014)OFRF5基因序列同源性最高，為93.9%～99.5%，與疫苗株VR2332ORF5基因序列同源性為85.1%～85.4%；與高致病性PRRSV代表性毒株(如JXA1和HuN4)ORF5基因序列同源性為83.9%～84.4%；與譜系3.5代表性毒株(如QYYZ和FJFS)ORF5基因序列同源性則為82.8%～83.1%(圖2)。

當(dāng)前全球流行的PRRSV毒株可分為2個(gè)基因型，分別為歐洲型(PRRSV-1)和美洲型(PRRSV-2)，而美洲型毒株可分為多個(gè)亞型[7-8]。應(yīng)用MEGA 7.0軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹顯示，本試驗(yàn)獲得的8個(gè)毒株與GenBank收錄的類NADC30代表性毒株聚為同一分支，且與我國流行的河南株(HeN1)相距最近(圖3)。結(jié)果表明，本試驗(yàn)獲得的毒株均屬于類NADC30毒株，且其與國內(nèi)流行毒株(HeN1)親緣關(guān)系最近。

圖2 PRRSV毒株ORF 5基因核苷酸序列同源性分析Fig.2 Homology analysis of PRRSV ORF 5 nucleotide sequences▲:本試驗(yàn)獲得PRRSV毒株；下圖同 ▲:PRRSV strains obtained in this study. The same as the following figures

圖3 PRRSV毒株ORF 5基因序列遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree construction based on the PRRSV ORF 5 sequences

3 討論

當(dāng)前，PRRS已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疫病。PRRSV屬于RNA病毒，而RNA病毒基因組在復(fù)制過程中易出現(xiàn)堿基突變、缺失和缺失，這導(dǎo)致當(dāng)前我國PRRSV流行毒株基因型復(fù)雜，對(duì)其進(jìn)行有效防控十分困難[8]。2006年，我國江西省部分地區(qū)豬場(chǎng)暴發(fā)高致病性PRRSV感染引發(fā)的PRRS，豬群感染該病后出現(xiàn)高熱和高病死率，該病的廣泛流行給我國部分豬場(chǎng)造成毀滅性打擊[9]。其后，2013年我國部分地區(qū)開始流行類NADC30毒株[10]。3種不同基因型PRRSV毒株(經(jīng)典型毒株、高致病性毒株、類NADC30毒株)對(duì)宿主的致病性存在差異，使得我國PRRS防控相對(duì)困難，這也提示監(jiān)測(cè)PRRSV流行情況及不同基因型所占比例情況十分必要。

綜上，本試驗(yàn)通過對(duì)河北邢臺(tái)及周邊地區(qū)PRRSV流行情況進(jìn)行調(diào)查和分析，發(fā)現(xiàn)樣品中PRRSV檢出率較高(48.39%,105/217)，說明該病原仍然廣泛流行于河北部分地區(qū)豬場(chǎng)。可能是由于目前PRRS已退出國家強(qiáng)制性免疫豬病名單，使得部分豬場(chǎng)疏于對(duì)該病的防控[11]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，被調(diào)查地區(qū)同時(shí)存在3種基因型PRRSV毒株的流行，但不同基因型毒株所占比例差異較大，其中類NADC30毒株、HP-PRRSV毒株和經(jīng)典型PRRSV毒株所占比例分別為60.95%、31.43%和9.52%。說明類NADC30毒株和HP-PRRSV毒株在被調(diào)查地區(qū)已屬于優(yōu)勢(shì)基因型，這與周群等[5]調(diào)查結(jié)果基本一致，提示當(dāng)前國內(nèi)部分地區(qū)PRRSV流行毒株基因型較為復(fù)雜，這也說明對(duì)PRRSV流行株進(jìn)行基因型鑒定十分重要。

在PRRSV基因組中，ORF5基因是變異最頻繁的開放閱讀框之一，大量研究表明可以依據(jù)ORF5基因?qū)RRSV遺傳變異情況進(jìn)行初步探究[12-14]。為初步分析河北及周邊地區(qū)流行類NADC30毒株遺傳變異情況，本試驗(yàn)對(duì)8個(gè)類NADC30毒株ORF5基因序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序和分析，發(fā)現(xiàn)8個(gè)類NADC30毒株ORF5基因與經(jīng)典PRRSV弱毒疫苗毒株VR2332和高致病性PRRSV弱毒疫苗毒株(JXA1和HuN4)同源性相對(duì)較低，這提示此類疫苗對(duì)類NADC30毒株的防控能力可能有限[13]。