添加菌劑堆肥發酵對羊糞球蟲卵囊活力的影響

劉林科，王占銘，李世杰，菅憶晨，陸佳偉，菅復春

(1. 河南農業大學動物醫學院，河南 鄭州 450046 ； 2. 廣西大學動物科技學院，廣西 南寧 530004 ；3. 南京農業大學動物科技學院，江蘇 南京 210014)

有研究表明，至2025年畜禽養殖糞污排放始終對環境造成明顯污染[1]。為此，我國出臺《畜禽規模養殖污染防治條例》、《關于推進農業廢棄物資源化利用試點的方案》等規劃和文件來嚴格規范和要求畜禽糞污處理和資源化利用。近年來，我國羊養殖數量快速增長[2]，但隨著該行業的快速發展，規模化羊場糞便污染問題日漸凸顯，受到養殖戶和當地政府的重視。2015 年規模化畜禽養殖糞污產生量為3.834×109t，其中新鮮糞便 6.36×108t[3]。羊糞除了其本身的污染能力外還攜帶有各種病原微生物。羊糞處理不當不僅會污染周圍的生產生活環境，同時還會對附近的人和動物造成一定的健康威脅。球蟲是舍飼羊場最常見的腸道寄生蟲之一，它雖然不是重要的人獸共患寄生蟲，但其對羔羊的危害極大，會嚴重影響羊場的經濟效益[4]。球蟲卵囊隨糞便排出，在外界孢子化后具有感染力，動物可通過糞—口途徑感染球蟲。該病原對外界的抵抗力很強，在污染的天然牧場草地常年存在[5]。如果糞污中的球蟲不能完全殺滅，則可能造成環境和水源的污染，導致動物再次感染。因此，糞污中球蟲失活可作為發酵處理是否合格的參考指標之一。傳統堆肥法發酵羊糞所需時間長，有機質轉化率低，容易受外界因素影響，而加入適當菌劑可加快發酵過程、提高糞肥質量[6-7]。為了評價3種不同菌劑比例處理模式下羊糞發酵對艾美耳球蟲卵囊的殺滅作用，本研究對羊糞發酵過程中不同時間點的卵囊數量及活性變化進行了監測，以期為動物糞污發酵處理提供參考。

1 材料與方法

1.1 發酵菌劑及有效活菌數 枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌的有效活菌數為1×1011CFU/g，綠色木霉、黑曲霉和酵母菌的有效活菌數為1×1010CFU/g，均購自山東和眾康源生物科技有限公司。發酵菌劑用量為每個堆肥處理1 kg菌劑。

1.2 糞樣堆積發酵 發酵糞樣共分為3個組，分別采用不同的微生物菌劑進行接種發酵(表1)，從發酵處理第1天開始連續進行60 d(2019年11月13日—2020年1月11日)的溫度監測，參考《糞便無害化衛生要求》(GB 7959—2012)[8]附錄A高溫堆肥溫度測定方法進行溫度監測(每天上午、下午分別檢測上層、中層、下層以及環境溫度)和樣品采集。

以羊糞為主料，油菜秸稈為輔料，將混勻的物料運至發酵區，調節含水率為55%～65%，碳氮比(C/N)約為20。建成3堆長×寬×高=1.5 m×1 m×1.5 m的條垛式堆體，每堆1 t左右。由于冬天溫度低，發酵時升溫緩慢并且維持高溫時間短，試驗中用塑料薄膜覆蓋堆體，每堆均勻噴灑1 kg提前混合好的菌劑，使用翻拋機將每堆堆體翻拋，使物料均勻混合。前10天每3天翻拋1次，后50天每10天翻拋1次。

表1 3個試驗組中不同菌種的比例Table 1 Proportion of different strains in 3 experimental groups

1.3 糞樣采集 分別在堆積后第0、3、7、10、20、28、37、48天和第58天共9個時間點于糞堆中央抽取約50 g糞樣進行球蟲卵囊計數和孢子化培養。

1.4 球蟲卵囊計數 采用麥克馬斯特計數法[9]進行球蟲卵囊計數，計數板上2個計數室內的卵囊數平均值乘以200，即為每克糞便中的卵囊數(Oocysts per gram of feces，OPG)。

1.5 球蟲卵囊孢子化培養和形態觀察 在所采集的不同批次樣品中加入適量2.5%的重鉻酸鉀溶液，并置于恒溫培養箱中，在28 ℃進行孢子化培養，期間進行數次吹打以使球蟲卵囊更好地進行孢子化[10]。在孢子化培養前、后采用飽和蔗糖溶液漂浮法對球蟲卵囊進行處理并通過顯微鏡觀察其形態[4]。孢子化是球蟲卵囊隨糞便排出動物體外孢子生殖的現象。能夠孢子化是球蟲卵囊具有活力的象征，而且，只有孢子化的卵囊才對動物具有感染能力。本研究將球蟲卵囊是否孢子化作為球蟲是否存活的主要判定指標。球蟲的完整性和活性參考《糞便無害化衛生要求》(GB 7959—2012)[8]附錄H蠕蟲卵死活鑒別方法進行。

2 結果

2.1 堆肥過程中溫度變化 經檢測堆肥內部溫度最高可達70 ℃，在13 d開始降溫，在22 d溫度出現回升，在50 ℃維持數天后溫度繼續下降。在后期又有階段性的溫度回升，但總體溫度呈下降趨勢，直至接近環境溫度(圖1)。

2.2 發酵過程中球蟲卵囊數量變化 在9個不同時間點采樣的9批(每批3份)27份糞樣中，球蟲卵囊檢出率為77.78%(21/27)，分別在第1、2、3、4、5批(分別對應發酵的第0、3、7、10天和第20天)各檢出3份，第6批(發酵第28天)檢出2份，第7批(發酵第37天)檢出1份、第8批(發酵第48天)檢出2份、第9批(發酵第58天)檢出1份。麥克馬斯特計數后計算OPG，3個組中球蟲卵囊定量檢測結果如圖2所示，從第1批到第9批，3個組OPG均呈現出遞減趨勢。結果表明，羊糞發酵對球蟲卵囊的滅活和降解有顯著作用。

圖1 發酵過程中的溫度變化Fig.1 Temperature changes during fermentation

圖2 發酵過程檢出球蟲卵囊數量的變化Fig.2 Changes in the number of Eimeria oocysts during fermentation

2.3 發酵過程中球蟲卵囊活性變化 在球蟲孢子化培養前于顯微鏡下觀察，有一部分球蟲形態完好，另一部分球蟲不規則或不完整，同時也存在孢子化球蟲卵囊。在球蟲孢子化培養后于顯微鏡下觀察，除了受損的球蟲卵囊，還有部分形態完好的球蟲卵囊也未能完成孢子化發育(圖3)，說明在發酵處理后，部分球蟲卵囊即使形態完整但實際已經失去活性，不能繼續發育。顯微鏡觀察各批樣品并計算孢子化率，結果發現，3個組發酵0、3 d和7 d后糞樣中的球蟲卵囊經28 ℃孵育后，孢子化率比孵育前都呈上升趨勢，表明此時發酵處理并未讓卵囊失活，而此后繼續發酵的樣品中球蟲卵囊數量逐漸減少，3個組分別在發酵20、28 d和37 d后未能檢出卵囊。不同發酵時間孢子化培養前后各組球蟲孢子化率分別見圖4和圖5。第1組的發酵處理在最短的時間內使球蟲失活，為較優菌種配比。

3 討論

添加合適的菌劑能提高糞污發酵的效率。本研究中，3個組枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、綠色木霉、黑曲霉和酵母菌的比例分別為1∶1∶1∶1∶2、2∶2∶1∶1∶2和3∶3∶1∶1∶2，其中第1組發酵20 d后未能查到球蟲卵囊，比第2組和第3組分別少用8 d和17 d，是發酵效率最高的組合，這個配比可縮短高肥料生產周期，提高生產效率和經濟效益。

堆體的溫度可直接反映堆肥反應的進程。代黎等[11]研究發現，堆肥腐熟過程溫度變化有兩升兩降的現象，溫度先快速增加后降低，再進入第2次升溫和降溫階段，漸漸進入后腐熟階段，最終趨于穩定，與環境溫度趨于一致。這與本研究中溫度變化情況基本一致，說明本研究中堆肥發酵是合理有效的。

圖3 發酵處理后不同形態的球蟲卵囊Fig.3 Different morphology of Eimeria oocysts after fermentation treatmentA～C：正常未孢子化球蟲卵囊； D：孢子化球蟲卵囊； E～H：受損球蟲卵囊A-C:Normal unsporulated oocysts; D:Sporulated oocyst; E-H:Injured oocysts

圖4 不同發酵時間球蟲孢子化培養前卵囊孢子化率Fig.4 Sporulation rate of Eimeria oocysts before incubation in different fermentation time

林琳等[12]研究發現，在8—10月份的夏秋季節里，堆積發酵處理和塑料罐密閉儲存處理(厭氧發酵)能在30 d左右完成對捻轉血矛線蟲蟲卵的殺滅和降解，比舍內自然放置處理的蟲卵殺滅效果更明顯。李紅霞[13]研究表明，堆肥從0 d開始迅速進入升溫階段，在2 d達到50 ℃，在2 ～ 8 d一直維持在50 ℃以上，然后開始降溫，在14 d時溫度下降到26 ℃，最后與環境溫度保持一致。而在生產操作過程中，為加速堆積發酵進程可添加一些微生態制劑[14]。本研究表明，添加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和綠色木霉等組成的復合制劑好氧堆肥同樣對球蟲卵囊具有顯著的殺滅和降解效果，但不同組合的發酵菌劑效果存在差別。

球蟲卵囊活力與溫度和持續時間相關。影響寄生蟲蟲卵或卵囊生存的因素有多種，其中溫度的影響最為明顯，當環境溫度低于10 ℃或高于30 ℃都不適合其生存和發育，某些寄生蟲蟲卵或卵囊在 40～42 ℃環境下1～2 d 即出現死亡[12,15]。堆肥內

圖5 不同發酵時間球蟲孢子化培養后卵囊孢子化率Fig.5 The sporulation rate of Eimeria oocysts after incubation in different fermentation time

部溫度的變化影響微生物的活性，也可判斷堆肥的無害化效果和穩定性[16]。有研究報道，60 ℃處理20 min或80 ℃處理10 min即可徹底殺滅球蟲孢子化卵囊，高溫長時間處理是殺滅全部雞球蟲卵囊的有效方式，殺滅卵囊的時間隨溫度的升高而縮短[17]。本研究中，堆肥在1～14 d會保持在較高的溫度，隨后還會有數個溫度高峰。3個組數據說明在經過14 d的高溫后，絕大多數卵囊會被滅活分解，但仍有部分卵囊需要再次的溫度回升才會被滅活分解。所以菌劑堆肥發酵處理下，28 d是徹底殺滅所有球蟲卵囊的一個更保險的時間點。國家標準《糞便無害化衛生要求》(GB 7959—2012)[8]中對羊糞等畜禽糞便的好氧發酵要求為：人工堆肥，堆溫≥50 ℃，至少持續10 d；機械堆肥，堆溫≥50 ℃，至少持續2 d。此時蛔蟲卵死亡率≥95%。而本研究發現，堆積發酵10 d后對球蟲卵囊的殺滅作用比較完全，而7 d時仍有部分卵囊具有活性(可以孢子化)，表明國家標準《糞便無害化衛生要求》(GB 7959—2012)[8]中人工堆肥好氧發酵的要求同樣適用于球蟲卵囊。國家標準《畜禽糞便無害化處理技術規范》(GB/T 36195—2018)[18]規定的“堆溫≥50 ℃以上的維持時間不少于7 d或45 ℃以上不少于14 d”要求對球蟲卵囊的完全失活還不夠充分，在實際應用中應延長堆溫持續時間。

就單個樣品來講，雖不能確定孢子化球蟲是糞樣發酵處理前就存在的，還是經過處理仍有活性的卵囊繼續孢子化的，但孵育后孢子化率提高可以表明未孢子化的卵囊仍具有活力，也就是說，糞樣的發酵處理時間還不足夠殺死所有的卵囊。而隨著發酵時間延長，能夠檢到的球蟲卵囊數量明顯減少，表明好氧堆肥對球蟲卵囊具有明顯的滅活和降解作用。

好氧堆肥發酵處理羊糞便對消化道寄生蟲的殺滅效果明顯，而由于羊糞自身的特點，使其糞便比其他動物糞便更適合堆肥[19-20]。在經過堆肥發酵后，寄生蟲蟲卵或卵囊幾乎被殺滅，適合用于農作物的基肥使用[21]。添加合適的發酵菌劑后，能讓堆肥升溫更高更快，這既能提高羊糞有機肥生產效率，也能確保糞堆中寄生蟲卵囊和其他病原體的滅活效果。本研究表明，糞樣中的球蟲卵囊孢子化活性檢測可作為堆肥中病原體是否完全殺滅的檢測指標，為畜禽糞便資源化利用的有機肥產業提供評價標準。