應用網絡藥理學分析蘿藦促進母豬泌乳的藥效物質基礎和靶點

李涪鋅，白家成，曲雪嘉，王春花，2

(1.牡丹江師范學院生命科學與技術學院，黑龍江 牡丹江 157000 ； 2. 東北農業(yè)大學動物科學技術學院，黑龍江 哈爾濱 150036)

母豬乳汁是新生仔豬營養(yǎng)物質需求的最理想來源，對仔豬的繁育意義重大，母豬產乳量多少直接影響新生仔豬的存活率和生長。規(guī)模化養(yǎng)殖場通過多種措施改善后，在排除飼養(yǎng)管理、環(huán)境因素以及母豬乳腺等疾病問題外[1]，母豬缺乳仍常有發(fā)生，特別是初產母豬和老齡母豬，如何有效提高母豬產乳量已成為養(yǎng)豬業(yè)關注的熱點。中獸醫(yī)認為，導致母豬缺乳的原因主要與營養(yǎng)不良、分娩過程致使母豬氣血虛弱，以及喂養(yǎng)過度、運動缺乏等造成脂肪堵塞致使母豬氣血瘀滯有關[2]，臨床常在母豬生產前后飼料中添加補氣、養(yǎng)血、理氣活血、通經下乳類中藥改善母豬缺乳癥狀[3]。蘿藦(Metaplexisjaponica)又名奶漿草，為蘿藦科蘿摩屬多年生草質纏繞藤本植物，亞洲地區(qū)均有分布，具有補氣益精、行氣止血、消腫解毒、通乳、止帶之功效，可用于治療體質虛弱、乳汁不足、遺精等[4]。《本草匯言》中記載“蘿藦補血、生血，功過歸、地；壯精培元，力堪枸杞；化毒解疔，與金銀花、半枝蓮、紫花地丁，共效驗亦相等也”[5]，蘿藦催乳作用可能與其補血、生血、化毒解疔之功效有關。中獸醫(yī)古籍《豬經大全》也記載了蘿藦治療缺乳母豬的方法[6]，但其藥效基礎和機制未見報道。田間、溝邊雜草蘿藦價格低廉且催乳作用明確，具有開發(fā)為母豬催乳功能類飼料添加劑的價值。但目前蘿藦的研究主要集中在藥用成分分離和鑒定以及其抗癌、增強免疫作用方面，在催乳功效上的基礎研究還屬空白，因此明確蘿藦對母豬泌乳性能藥效物質基礎與調控機制是蘿藦開發(fā)的關鍵。本試驗基于網絡藥理學技術虛擬篩選蘿藦調控母豬泌乳的藥效物質基礎和靶點，為明確蘿藦藥效基礎以及研究調控泌乳的作用機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 蘿藦化合物-靶點網絡的構建與分析 基于參考文獻[7-10]獲得蘿藦化學成分，借助ChemBioDraw軟件繪制化合物的分子結構式，并導入PharmMapper服務器，進行潛在靶點預測分析，打分值(z-score)>0.9的蛋白作為該化合物的重要靶點蛋白，通過Cytoscape 3.7.1軟件構建蘿藦化合物-靶點網絡，分析化合物和靶點間的連接度(Degree)。

1.2 蘿藦靶點PPI網絡的構建與分析 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)以關鍵詞“Lactation disorders”和“Hypogalactia”檢索，設定推理分數(shù)(Inference score)、關聯(lián)分數(shù)(Relevance score)>20篩選缺乳相關靶點。將蘿藦重要靶點與缺乳相關靶點代入在線數(shù)據(jù)庫STRING 11.0(https://string-db.org)，物種選擇為“Susscrofa”，獲取蘿藦化合物靶點蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein interaction,PPI)網絡信息，通過Cytoscape 3.7.1軟件構建蘿藦與缺乳靶點的PPI網絡圖，分析確定蘿藦調控泌乳的核心靶點。

1.3 蘿藦核心靶點GO和KEGG富集分析 將蘿藦與缺乳直接相關的核心靶點(Degree≥40)上傳數(shù)據(jù)庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov)，物種限定為“Susscrofa”，以P<0.05作為具有統(tǒng)計差異篩選條件，進行基因本體(Gene ontology,GO)生物學過程富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG pathway analysis，KEGG)代謝通路富集分析，探討蘿藦促進母豬泌乳的分子機制。

1.4 蘿藦核心靶點的歸經分析 將關鍵靶點(Degree≥20)輸入BIOGPS數(shù)據(jù)庫(http://biogps.org/#goto= welcome)，物種限定“Pig”，搜索各靶點器官分布信息，通過Cytoscape 3.7.1軟件繪制蘿藦靶點-歸經網絡圖。

2 結果

2.1 蘿藦化合物-靶點網絡的構建與分析 共收集到蘿藦的化學成分64個，包括C21甾體(29個)、萜類(4個)、黃酮類(9個)、苯丙素類(5個)、生物堿類(4個)和其他類化合物(13個)。利用PharmMapper服務器繪制并搜索化合物靶點，去除無靶點化合物14個，共獲得50個含有靶點的化合物作為蘿藦活性化合物進行分析(表1)。化合物-靶點網絡(圖1)共包括457個節(jié)點(50個化合物，407個靶點)和1 564條邊，其中，紅色節(jié)點代表蘿藦化合物，節(jié)點大小與Degree相關，圈內紅色節(jié)點代表蘿藦關鍵化合物(Degree>65)，藍色節(jié)點代表靶點，該網絡說明蘿藦泌乳功效可能是多成分、多靶點作用的結果。在蘿藦化合物-靶點網絡中，每個化合物有平均靶點數(shù)目31.28個，每個靶點平均與8.14個化合物相互作用，芹菜素(Apigenin)、山奈酚(Kaempferol)、表兒茶素(Epicatechin)、異鼠李素(Isorhamnetin)和鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)等為蘿藦重要化合物(Degree≥10)。從靶點角度來看，前列腺素合酶G/H-1(Prostaglandin G/H synthase 1)、孕激素受體(Progesterone receptor)、碳酸酐酶Ⅱ(Carbonic anhydrase 2)等為蘿藦重要靶點(Degree≥10)。Degree≥60的蘿藦化合物信息見表2，Degree≥20的蘿藦靶點信息見表3。

表1 蘿藦化合物Table 1 Metaplexis japonica compounds

圖1 化合物-靶點網絡圖Fig.1 Compound-target network紅色節(jié)點:蘿藦化合物; 圈內紅色節(jié)點:蘿藦重要化合物; 藍色節(jié)點:靶點; 節(jié)點大小與Degree相關Red node:Metaplexis japonica compounds; Red node in the circle: Important compounds of Metaplexis japonica； Blue node:Targets. Node size was related to Degree

表2 蘿藦Degree≥60的核心化合物基本信息Table 2 Basic information for Degree≥60 core compounds in Metaplexis japonica

2.2 蘿藦靶點PPI網絡的構建與分析 為了更好地理解蘿藦促進母豬泌乳的分子機制，利用STRING數(shù)據(jù)庫分析蘿藦重要靶點與缺乳相關靶點PPI關系，如圖2所示，PPI網絡共包括327個節(jié)點，直接與缺乳相關靶點連接的蘿藦化合物靶點74個，為蘿藦調控母豬泌乳的核心靶點。其中，TP53、ALB、TNF、IL-6、COMT、MAOA、POR、HTR2A、SLC6A4、SLC6A3、GPRIN1為化合物與豬缺乳共同靶點，在蘿藦調控母豬泌乳性能中起到關鍵作用。

表3 蘿藦Degree≥20的靶點基本信息Table 3 Basic information for Degree≥20 targets in Metaplexis japonica

圖2 蘿藦與母豬缺乳靶點PPI網絡圖Fig.2 PPI network of Metaplexis japonica and sow hypogalactia左側圓形節(jié)點:蘿藦靶點; 右側圓形節(jié)點:母豬缺乳靶點; 中間圓形節(jié)點:化合物與母豬缺乳共同靶點; 節(jié)點大小、顏色深淺與Degree成正比Circle nodes on the left side:Targets of Metaplexis japonica； Circle nodes on the right side：Targets of sow hypogalactia; Middle circle nodes:Common targets of compounds and sow hypogalactia. The size and color depth of the node was proportional to Degree

2.3 蘿藦核心靶點GO和KEGG富集分析 將蘿藦與缺乳直接相關的核心靶點(Degree≥40)蛋白輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，如圖3所示，GO功能富集分析得到GO條目115個(P<0.05)，生物學過程(BP)條目84個，占73%；細胞組成(CC)條目10個，占9%；分子生物學功能(MF)相關條目21個，占18%。如圖4所示，蘿藦調控母豬泌乳的核心靶點KEGG通路富集得到106條有效信號通路，其中母豬泌乳性能相關的信號通路包括雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)、催乳素信號通路(Prolactin signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)等，為蘿藦調控母豬泌乳性能重要信號通路網。

2.4 蘿藦核心靶點的歸經分析 利用BIOGPS數(shù)據(jù)庫對關鍵靶點(Degree≥20)定位分析，共70個靶點，保留每個基因表達量最高的組織(心臟、血液、巨噬細胞、胸腺、胰腺、腎臟、肝臟、腸等)，利用Ctyoscape

圖3 蘿藦核心靶點GO富集分析Fig.3 GO analysis of Metaplexis japonica core targets

圖4 蘿藦核心靶點KEGG通路Fig.4 KEGG pathway analysis of Metaplexis japonica core targets

軟件繪制靶點-歸經網絡圖。如圖5所示，將查找到的組織器官根據(jù)其所在系統(tǒng)進行分類，這些組織和器官主要分布在免疫系統(tǒng)(胸腺、脾、巨噬細胞、腸系膜淋巴結)、血液循環(huán)系統(tǒng)(血液、心臟、腹主動脈)、神經系統(tǒng)(腦)、消化系統(tǒng)(大腸、小腸、肝臟、胰腺)、生殖系統(tǒng)(子宮、胎盤)、運動系統(tǒng)(骨)、呼吸系統(tǒng)(肺、氣管)、泌尿系統(tǒng)(腎臟、輸尿管)。其中有24個靶點作用于免疫系統(tǒng)、20個靶點作用于消化系統(tǒng)、9個靶點作用于血液循環(huán)系統(tǒng)、7個靶點作用于泌尿系統(tǒng)。表明蘿藦促進母豬泌乳作用的靶點多作用于免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)。

圖5 蘿藦靶點-器官定位網絡Fig.5 Metaplexis japonica target-organ localization network深藍色節(jié)點:生殖系統(tǒng); 黃色節(jié)點:血液循環(huán)系統(tǒng); 粉色節(jié)點:呼吸系統(tǒng); 綠色節(jié)點:消化系統(tǒng); 橘色節(jié)點:免疫系統(tǒng); 棕色節(jié)點:神經系統(tǒng); 紫色節(jié)點:泌尿系統(tǒng); 紅色節(jié)點:運動系統(tǒng); 藍色節(jié)點:關鍵靶點Dark blue node:Reproductive system; Yellow node:Blood circulation system; Pink node:Respiratory system; Green node:Digestive system; Orange node：Immune system; Brown node：Nervous system；Purple node：Urinary system； Red node:Exercise system； Blue node:Key target

3 討論

在養(yǎng)殖生產中，母豬乳汁質量不僅是衡量哺乳母豬營養(yǎng)狀況的重要指標，更關系到出生仔豬的健康狀況。因此，有效防控母豬產后缺乳的發(fā)生可提高養(yǎng)殖業(yè)的經濟效益和養(yǎng)殖者的積極性。在獸醫(yī)臨床中常用補氣養(yǎng)血類中藥，如當歸、川芎、白芍、地黃、黃芪、阿膠等，兼以通乳類中藥，如王不留行，治療母豬產后乳量不足。研究顯示，在妊娠母豬生產前后飼料中添加補氣養(yǎng)血類中藥可防控產后氣血不足引起的母豬產后缺乳現(xiàn)象[11]。中藥蘿藦的催乳應用歷史悠久，喂食鮮草可增加產后母豬乳量。蘿藦具有一定研究與開發(fā)價值，通過網絡藥理學虛擬篩選蘿藦調控母豬泌乳的物質基礎和靶點，可為其在動物營養(yǎng)、中獸醫(yī)領域應用和開發(fā)提供基礎，為中獸藥、中藥飼料添加劑的研究拓展新思路。

3.1 蘿藦促進母豬泌乳的藥效物質基礎分析 在進行潛在靶點預測分析時，文獻多將打分值(z-score)降序排列后取z-score>0.5作為化合物的重要靶點蛋白[12]，本試驗獲得的相關靶點較多，故以z-score>0.9為參數(shù)，篩選蘿藦化合物的重要靶點蛋白。經分析顯示，蘿藦含有C21甾體、萜類、黃酮類、木脂素類等化合物，其中芹菜素(Apigenin)、山奈酚(Kaempferol)、表兒茶素(Epicatechin)、異鼠李素(Isorhamnetin)和鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)等為蘿藦重要化合物，在下乳通乳、補氣補血、抗炎作用中起到不同程度的作用。芹菜素具有抗氧化和保護血管的作用，可通過調節(jié)體內膽固醇的代謝，促進膽固醇吸收、轉化和逆向轉運，降低血脂水平和加速血液循環(huán)，從而促進肥胖母豬產后乳汁分泌[13]。Zhong等研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚具有抑制STAT3和IL-6表達的作用，為桔梗促進乳汁分泌的重要物質基礎[14]。表兒茶素可通過抑制iNOS的合成減少NO的釋放，從而發(fā)揮抗炎作用[15-16]。異鼠李素具有抗腫瘤、降血脂、降血壓、抗炎癥和抗氧化的作用[17]，可抑制炎癥因子IL-1β和IL-6的分泌，降低iNOS活性和NO含量[18]，發(fā)揮抑制炎癥反應作用，是維持乳腺健康和高效泌乳的有效成分。鄰苯二甲酸二丁酯可提高泌乳中期母豬乳腺上皮細胞p-Akt和cyclin D1的表達，誘導PRLR、STAT5基因表達增多[19]，通過誘導催乳素與其受體結合，促進母豬乳腺上皮細胞泌乳。綜上所述，蘿藦主要通過多種化合物的多靶點、多作用通路共同實現(xiàn)治療產后母豬乳汁分泌的目的，芹菜素、山奈酚、表兒茶素、異鼠李素和鄰苯二甲酸二丁酯等是蘿藦促進母豬泌乳的重要物質基礎。

3.2 蘿藦促進母豬泌乳的靶點分析 在GeneCards數(shù)據(jù)庫以關鍵詞“Lactation disorders”和“Hypogalactia”檢索，獲得直接與缺乳相關靶點連接的蘿藦化合物靶點共327個，文獻多以推理分數(shù)(Inference score)、關聯(lián)分數(shù)(Relevance score)>20篩選缺乳相關靶點[20]，本試驗為探討其關鍵靶點，參考該域值進行篩選缺乳相關靶點，篩選后共獲得74個直接與缺乳相關靶點連接的蘿藦化合物靶點。本試驗結果顯示，TP53、ALB、TNF、IL-6、COMT、MAOA、POR、HTR2A等靶點為蘿藦直接作用于母豬缺乳的關鍵靶點。TP53是蘿藦與母豬產后缺乳疾病共同靶點，可以使癌細胞凋亡，發(fā)揮抗癌作用，同時可以調節(jié)機體正常的生命活動[21]。ALB 是血液循環(huán)中的主要循環(huán)蛋白，轉運多種內源性和外源性化合物，還是一種多功能的蛋白質載體，多用于藥物靶向[22]。TNF具有抗腫瘤、抗病毒、激活免疫細胞，誘發(fā)炎癥反應作用，在機體自穩(wěn)、防御反應中起到重要作用。TNF還是一個重要的內源性致熱原，是不同病因所致發(fā)熱機制中的一個共同環(huán)節(jié)[23]。IL-6促炎癥細胞因子可視為研究缺乳的定性指標[24]，缺乳發(fā)生時血清IL-6會明顯升高，通過抑制IL-6可以促進乳腺炎癥的改善和乳汁分泌的增加。COMT具有基因多態(tài)性，可顯示不同的活性，因而決定不同的兒茶酚雌酮的分解速度，可將兒茶酚雌酮甲基化為可溶于水的代謝產物排出體外，在與雌激素刺激有關的乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌等婦科腫瘤的發(fā)病過程中起到重要的作用[25-26]。MAOA抑制劑Clorgyline可定向改變乳腺癌細胞的生長、遷徙、侵襲[27]。POR為機體內質網膜上對多種內源、外源物質的代謝至關重要的一種酶[28]，可參與和調控膽固醇、性激素和毒素等內源和外源物質的代謝[29]。HTR2A(5-羥色胺2A受體)可以調節(jié)5-羥色胺(5-HT)，5-HT是參與調節(jié)胃腸道運動和分泌功能的重要神經遞質，可以調節(jié)情緒、食欲、睡眠等，并能調節(jié)血液循環(huán)，因此在母豬飲食中添加含HTR2A的藥物，可預防其因氣血瘀滯或肝郁氣滯等原因導致的產后缺乳[30]。此外，5-HT可以使乳腺組織呈高度泌乳狀態(tài)，具有促進乳汁分泌的作用[31]。這些核心靶點主要富集在多種激素調節(jié)、能量代謝和細胞增殖等通路網，包括雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)、催乳素信號通路(Prolactin signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)等。催乳素信號通路是哺乳中最重要的通路，可以由催乳素激活，其最具代表性的作用是能夠誘導細胞上皮生長和刺激產后乳汁分泌。綜上所述，蘿藦可通過TP53、ALB、TNF、IL-6、COMT、MAOA、POR、HTR2A等多靶點調節(jié)母豬能量與營養(yǎng)代謝、激素水平、情緒狀態(tài)等，其促進泌乳的作用機制可能與調控催乳素信號通路和雌激素信號通路有關。

綜上所述，蘿藦主要通過芹菜素、山奈酚、表兒茶素、異鼠李素作用TP53、ALB、TNF、IL-6、COMT、MAOA、POR、HTR2A等靶點調節(jié)免疫、改善血液循環(huán)促進產后母豬泌乳。