仔豬細菌性腹瀉病原菌的分離鑒定與耐藥性分析

吳 楊，閆艷新，孫虎芝，潘 強，2，任慧英，，張 燦

(1. 青島諾安百特生物技術有限公司，山東 青島 266000 ； 2. 青島特種食品研究院，山東 青島 266109 ；3. 青島農業大學動物醫學院，山東 青島 266109)

仔豬腹瀉病是一種多發于斷奶期或哺乳期仔豬的消化系統疾病，是引起仔豬死亡的重要原因之一，嚴重影響了生豬養殖的正常進行，常常給養殖場造成巨大的經濟損失。引起仔豬腹瀉的原因主要分為2種：傳染性因素和非傳染性因素。非傳染性因素包括養殖環境、飼料條件等導致仔豬缺乏營養或者引起仔豬發生應激反應的因素；傳染性因素包括細菌性腹瀉和病毒性腹瀉2種，細菌性腹瀉包括大腸桿菌引起的黃白痢、沙門菌引起的仔豬副傷寒、產氣莢膜梭菌引起的紅痢、豬痢疾密螺旋體引起的豬痢疾等[1]，引起病毒性腹瀉的病原包括偽狂犬病毒、豬輪狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒等。近年來，細菌感染引起仔豬腹瀉成為危害生豬養殖的一大問題，同時，由于抗菌藥的濫用，多重耐藥菌株的出現導致仔豬腹瀉的治療愈發困難。本試驗收集大量腹瀉仔豬的肝臟或腸道內容物樣品，對其病原菌進行分析，旨在為細菌性仔豬腹瀉的預防和治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 2019年1月—2020年5月收集了來自濰坊、煙臺和青島地區具有一定規模的養豬場患有腹瀉的仔豬的肝臟或腸道內容物樣品共計1 014份，其中肝臟53份，腸道內容物961份。

1.2 主要試劑材料 SS瓊脂、蛋白胨、牛肉浸粉、瓊脂粉、脫纖維綿羊血、MH瓊脂、胰蛋白胨大豆瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯，均購自青島海博生物有限公司；2 ×TaqMaster Mix (Dye Plus)、DL 2 000 Plus DNA Marker，均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；特異性引物由北京華大基因科技有限公司合成。

1.3 病原菌分離鑒定 無菌取肝臟樣品于SS瓊脂平板劃線，37 ℃培養18 h；取腸道內容物于血瓊脂平板劃線，置于37 ℃厭氧培養18 h。根據平板上菌落形態進一步鑒定不同的細菌，挑取SS平板中紅色且有玫紅色突起的菌落鑒定大腸桿菌，挑取透明或半透明菌落鑒定沙門菌；挑取血瓊脂平板上有雙層溶血環的菌落鑒定產氣莢膜梭菌。

1.4 細菌特異性PCR鑒定 煮沸法提取DNA后，用特異性引物進行分離菌株的PCR鑒定，引物序列、擴增片段長度及退火溫度見表1。25 μL PCR反應體系：2×TaqMaster Mix(Dye Plus)12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min；退火溫度根據引物不同可作更改。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像觀察條帶。

表1 細菌特異性鑒別引物Table 1 Bacteria specific differential primers

1.5 大腸桿菌常見毒力基因鑒定 將臨床分離的大腸桿菌進行9種常見毒力基因[2]的PCR鑒定，引物序列、擴增片段長度及退火溫度見表2。PCR反應體系及反應條件同1.4，退火溫度根據引物不同可作更改。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀成像觀察條帶。

表2 9種大腸桿菌常見毒力基因引物Table 2 9 common virulence gene primers of E.coli

續表

1.6 致病性大腸桿菌藥物敏感性試驗 根據歐洲抗菌藥敏感性試驗委員會(European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing,EUCAST)標準，使用紙片擴散法測定致病性大腸桿菌的藥物敏感性[3]。將菌懸液濁度調整至0.5麥氏濁度，接種于MH瓊脂培養基，15 min內將10種常用藥物藥敏紙片放置于培養基表面，35 ℃恒溫培養18 h后測量抑菌圈直徑，判斷細菌的藥物敏感性。

2 結果

2.1 病原菌分離鑒定 從987份樣品中分離到大腸桿菌，分離率為97.34%(987/1 014)；35份樣品中分離到沙門菌，分離率為3.45%(35/1 014)；4份樣品中分離出產氣莢膜梭菌，分離率為0.39%(4/1 014)。表明在山東的養殖場中，引起細菌性仔豬腹瀉的病原菌主要是大腸桿菌。

2.2 大腸桿菌常見毒力基因鑒定 對分離出的987株大腸桿菌進行9種常見毒力基因的鑒定。共檢測出169株大腸桿菌含有毒力基因，毒力基因的攜帶率為17.12%。致病性大腸桿菌中黏附素的主要類型為K88(47.34%)和F18ac(31.95%)，毒素類型主要為LT1(48.52%)和ST2(31.36%)，見表3。

表3 9種毒力基因型大腸桿菌分離率Table 3 Isolation rates of 9 virulence genotypes of E. coli

2.3 致病性大腸桿菌藥物敏感性試驗 對987株大腸桿菌中鑒定出攜帶毒力基因的169株大腸桿菌，進行10種常用藥物的藥敏試驗，結果如表4和圖1～2所示，169株大腸桿菌對10種常用藥物均有不同程度的耐藥性，耐藥率均達到60%以上，并且出現多重耐藥現象，超過80%的菌株具有7重及以上的耐藥性，有35株大腸桿菌對10種抗生素均耐藥。

表4 169株大腸桿菌分離株的耐藥率Table 4 Drug resistance rates of 169 E.coli isolates

圖1 大腸桿菌分離株的藥物敏感性Fig.1 Drug sensitivity of E.coli isolates

圖2 169株大腸桿菌多重耐藥情況Fig.2 Multiple drug resistance of 169 E.coli isolates

3 討論

近年來，由于生豬養殖規模的不斷擴大，仔豬腹瀉時有發生，且在危害生豬養殖的疾病中處于首位。引起仔豬腹瀉的原因較為復雜，細菌性、病毒性以及病毒和細菌混合感染都是導致仔豬腹瀉的主要原因，并且細菌感染引起的仔豬腹瀉發病率處于逐年上升的態勢，本試驗調查山東各地區引起仔豬腹瀉的流行菌株并分析其耐藥性，可以為生豬養殖提供一定的指導，防止造成更大的經濟損失。

本試驗采集的1 014份仔豬腹瀉樣品中分離到了1 026株病原菌，其中大腸桿菌檢出率最高(97.34%)，同時還分離到了沙門菌(3.45%)和產氣莢膜梭菌(0.39%)，檢出率相對較低。李珍珍[1]報道的蘭州地區仔豬腹瀉樣品病原菌分離結果以大腸桿菌(93.33%)和產氣莢膜梭菌(90%)為主，說明山東地區與蘭州地區仔豬腹瀉病的發病因素不同，山東地區以大腸桿菌引起的仔豬黃白痢為主，而蘭州地區以產氣莢膜梭菌和大腸桿菌混合感染引起的仔豬紅痢為主。大腸桿菌、沙門菌和產氣莢膜梭菌均為常見腸道菌群[4]，僅在養殖條件發生惡化導致仔豬腸道菌群失衡，免疫下降時引起腹瀉。

大腸桿菌腸毒素以及志賀毒素在各地區流行株中存在一定的差異性。本試驗發現在青島、煙臺和濰坊等山東地區以LT1和ST2為主要的毒素類型。陳祥等[5]報道在華東部分地區毒素基因以ST1和ST2為主；石大麗[6]報道了廣西部分地區大腸桿菌毒素基因主要為ST2；王春江等[7]的研究表明在陜西地區大腸桿菌毒素基因的主要類型是ST1；楊宇[8]報道了浙江等地區大腸桿菌主要毒素基因是ST1。表明腸毒素基因在各地區的流行存在地域差異性。同時，本試驗中分離到的含有毒力基因的大腸桿菌分離株普遍含有腸毒素基因，產腸毒素性大腸桿菌是致病性大腸桿菌中最主要的類型[9]，具有極高的危害性。產腸毒素性大腸桿菌可定植在仔豬的空腸和回腸中，在繁殖過程中不斷分泌腸毒素，進而引起仔豬腹瀉，甚至導致仔豬死亡，給養殖業造成巨大的經濟損失，因此對產腸毒素性大腸桿菌進行控制是目前亟需關注的問題。

本試驗發現在青島、煙臺和濰坊等山東地區，大腸桿菌黏附素基因以K88為主；沈麗萍等[10]報道了上海地區主要大腸桿菌黏附素為K99；唐樹霄[11]報道了江蘇地區大腸桿菌主要黏附素為K88、K99、F41；石大麗[6]報道的廣西地區主要的大腸桿菌黏附素為K88和K99；王春江等[7]報道的陜西地區大腸桿菌主要黏附素為K99。表明近年來大腸桿菌黏附素在各地區流行具有多樣性。本試驗中大腸桿菌分離株的K99檢出率相對其他地區較低，但不同的黏附素類型均能導致仔豬腹瀉的發生。K99黏附素可以附著在仔豬腸道黏膜表面，K99的表達常常受到環境因素的影響，例如透氣程度、細胞的生長速率等[12]；F41黏附素在O9和O8型大腸桿菌中常常與K99黏附素結合在一起，它的表達也受多種因素影響，但目前位置對F41鞭毛結構等的研究還不明確[13]；K88黏附素是腸毒素性大腸桿菌最常見的黏附素類型，主要分為ac、ab和ad三個類型[14]，K88ac是3種K88黏附素中最常被檢測到的，K88和987P黏附素受體均位于小腸的上皮細胞中，K88的受體多為脂多糖，987P的受體一般是糖蛋白或糖脂[15]。

選擇10種常用藥物進行藥敏試驗發現，169株致病性大腸桿菌均為多重耐藥菌株，且有80%以上的菌株為7重及以上耐藥菌株，對所有藥物耐藥率均在60%以上，說明山東地區養殖場抗菌藥耐藥嚴重，與國內其他地區耐藥情況有所不同[16-17]，說明我國不同地區養殖場的用藥類型不同。與往年山東地區相關報道相比，本試驗結果顯示致病性大腸桿菌的耐藥率有所上升[18]，說明抗菌藥使用情況未得到改善。濫用抗菌藥治療會增加細菌的耐藥性，合理用藥及尋求新的細菌性疾病解決方案勢在必行。