一株高效促生菌株的分離篩選與發酵條件初探

杜洪波,鞏杰,高婷,李傳榮

一株高效促生菌株的分離篩選與發酵條件初探

杜洪波,鞏杰,高婷,李傳榮*

山東農業大學林學院, 山東 泰安 271018

為篩選能有效促進植物生長的促生細菌，從山東省泰安市泰山山脈常年生長植株根際土壤中分離獲得一株芽孢桿菌TG-5。通過形態學特征和16S rRNA分析，將其鑒定為蘇云金芽孢桿菌（）。采用NBRIP培養基對溶磷能力進行測定，結果表明：蘇云金芽孢桿菌TG-5對磷酸鈣培養基溶磷效果較好，與對照相比，該菌株溶磷效率是其他菌株3倍以上，最高達10.7倍以上。通過對該菌株固體發酵條件初探，發現發酵培養基主要成分玉米粉和大豆粉的最佳配比為2:3、碳氮源分別為玉米粉和大豆粉時生物量最大。上述試驗證明蘇云金芽孢桿菌TG-5具有較好的促生應用潛力，可進一步擴大培養。

土壤微生物; 蘇云金芽孢桿菌; 分離; 發酵條件

微生物群落的多樣性、相對豐度和活性在土壤有機質分解、養分循環、系統穩定性和抗干擾能力中起著核心作用[1-5]。鑒定植物相關細菌、分析它們與宿主的相互作用以及了解這些相互作用促進兩種生物生存的方式對于制定保護這些植物的策略至關重要[6]。

土壤微生物是陸地生態系統中植物多樣性和生產力的重要驅動因素[7]。粗略估計，大約25%的植物依賴于營養不良的天然土壤中的固氮細菌[8]。PGPR還可以改變根系結構、形態、導水率和激素狀態，并可以釋放與壓力積累滲透相關的各種揮發性化合物（如谷氨酸、脯氨酸和肽），殺死病原體[9,10]。根際土壤是農田生態系統中動態而復雜的元素[11]。共生菌存在于所有植物中，這種關系可能是植物抗逆性的關鍵因素。事實上，植物對環境的局部適應是由密切相關的PGPR之間的遺傳分化驅動的[12]。在沒有細菌的情況下移植各種植物物種是出了名的困難[13]，這種困難支持了細菌對植物生長的重要性，包括在壓力條件下[14]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株的分離本文用于分離菌株的土壤采集自中國山東省泰安市泰山山脈的作物根際土壤。無菌條件下取作物根際土5 g，溶于45 mL無菌蒸餾水中，220 r/min，振蕩培養30 min。吸取1 mL土壤懸浮液與9 mL的無菌水混勻，即得10-1稀釋液，再取1 mL·10-1的稀釋液與9 mL的無菌水混勻，即得10-2稀釋液，依稀類推，制備10-3、10-4、10-5、10-6和10-7等一系列稀釋液。用移液器吸取100 μL的土壤稀釋液于各分離培養基平板中央，涂布器涂抹均勻，37 °C恒溫培養1～3 d。細菌分離采用LB固體培養基，選用的稀釋度為10-4、10-5和10-6；真菌分離采用馬丁氏培養基，選用的稀釋度為10-3、10-4和10-5；放線菌分離采用高氏一號培養基，選用的稀釋度為10-4、10-5和10-6。

1.1.2 培養基無機磷篩選培養基(g/L)：葡萄糖10.0，酵母提取物0.5，磷酸鈣5.0，硫酸銨0.5，氯化鉀0.2，硫酸鎂0.1，硫酸錳0.000 1，硫酸亞鐵0.000 1；

IAA培養基(g/L)：牛肉膏3.0，蛋白胨5.0，NaCl 5.0，色氨酸1.0。

1.1.3 主要試劑和儀器酵母提取物、牛肉浸膏、氯霉素、磺胺、氟苯尼考，麥克林公司；慶大霉素、氯霉素、IAA標準品、1-氨基環丙烷羧酸標準品，Sigma公司。

DNA提取試劑盒，北京擎科生物工程有限公司。

梯度PCR儀，Thermo Fisher Scientific公司。

高速冷凍離心機，Sigma公司。

火焰原子吸收光譜儀，耶拿公司。

紫外分光光度計，島津企業管理(中國)有限公司。

1.2 高效促生菌株的篩選

采用苯胺藍、羧甲基纖維素鈉、愈創木酚、固氮、溶磷、解鉀實驗作為篩選條件，只有同時滿足三種及以上的作為高效促生菌株備選。

1.3 生理生化及形態鑒定

將篩選出促生菌株接種于LB固體培養基上，37 ℃培養48 h后觀察菌落并進行顯微鏡檢，然后按照《伯杰氏系統細菌學手冊》[15]進行生理生化鑒定。

1.4 菌株生理生化鑒定

在營養瓊脂固體平板37 ℃恒溫培養30 h，記錄菌落的大小、顏色、形狀、透明度、濕潤程度以及表面邊緣隆起程度等。根據《伯杰細菌鑒定手冊》[15]和《微生物學實驗教程》[16]，對菌株進行革蘭氏染色和芽孢染色，吲哚乙酸產生，甲基紅、VP、明膠酶、淀粉酶、苯丙氨酸脫氫酶、氧化氫酶、尿素酶、蛋白水解酶、β-半乳糖苷酶等常規生理生化的特征鑒定。

采用艾科瑞公司的細菌基因組DNA提取試劑盒進行菌株基因組DNA的提取。以提取的DNA作為模板，以細菌的通用引物27F/1492R對菌株的16S rRNA基因進行PCR擴增。將PCR產物送往北京擎科生物科技有限公司進行測序，測序結果在NCBI blast進行對比，通過軟件MEGA-X進行序列相似性分析，并構建系統發育樹。

1.5 菌株生長條件優化

1.5.1 發酵培養基中最佳C、N、無機鹽的篩選以標準配方的LB液體培養基作為對照，將LB液體培養基中的酵母提取物（碳源）分別換成等量（5.0 g·L-1）的可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和玉米粉，其他物質不變，制備不同碳源的發酵培養液，每250 mL三角瓶裝100 mL，按照2%種子液接種量，將供試菌株接種于不同碳源的發酵培養液中，30 ℃，180 r·min-1搖床上振蕩24 h，測定發酵反應液的OD 600值，每個碳源培養液重復3次，篩選出最佳C源。利用同等重量（10 g·L-1）尿素、黃豆粉、(NH4)2SO4、牛肉膏、豆餅代替LB培養基中的氮源（胰蛋白胨），發酵反應條件同C源的篩選，篩選出最佳氮源[17]。

利用重量（10.0 g·L-1）ZnSO4、FeSO4·7H2O、K2HPO4、MgCl2、Ca(NO3)2代替LB培養基中的無機鹽（NaCl），發酵反應條件同C源的篩選，篩選出最佳無機鹽。

1.5.2 培養條件的篩選與優化以1.5.1優化后的培養液為液體發酵最佳培養基，依次對培養基中pH 值、接種量、培養溫度、轉速及培養時間進行篩選與優化，每個處理3次重復。設置pH值為：6.0、7.0、和8.0，250 mL三角瓶中裝100 mL發酵培養基，種子液按接種量1%、2%、5%，180 r·min-1，30 ℃，振蕩培養24 h，根據發酵反應液OD600值，確定最佳pH值；在確定發酵反應最佳pH值后，將發酵反應溫度設置為：30 ℃、37 ℃、39 ℃，250 mL三角瓶中裝100 mL發酵培養基，種子液按接種量1%，180 r·min-1振蕩培養24 h，根據OD600值，篩選最佳反應溫度；在確定最佳pH值和反應溫度下，在確定最佳pH值、溫度和裝液量后，接種量設置為下列梯度：1%、2%、5%，30 ℃，180 r·min-1，培養24 h，根據不同處理OD600值，篩選最佳接種量；在確定最佳pH值、溫度、裝液量和接種量后，轉速設置為：180 r·min-1、200 r·min-1、220 r·min-1，培養24 h，根據不同處理OD600值，篩選最佳轉速。

1.5.3 液體發酵培養基組分的優化

表 1 培養基組分的正交實驗因素與水平

1.6 菌株發酵過程中溶解無機磷能力測定

將待檢測菌株活化后，以1%比例接種于以磷酸鈣作為唯一磷源的液體無機磷篩選培養基，37 ℃、180 r/min振蕩培養5 d后開始取樣，4000 r/min離心10 min，取上清液檢測可溶性磷濃度。實驗中的對照為蘇云金芽孢桿菌，購自乳山韓威生物科技有限公司，上清液中的磷濃度采用鉬銻抗比色法[18-22]檢測。

1.7 雙抗生素菌株的篩選

刮取2環PGPR菌株新鮮培養物，接種到不含利福平的LB液體培養基中，30 ℃，200 r/min培養24 h，作為種子液。將種子液以2%（體積比）的接種量接種到含5 μg/mL利福平(Rifampicin)的LB液體培養基中，搖瓶培養24 h；將該培養液以2%的接種量接種到含10 μg/mL利福平的LB液體培養基中，搖床培養24 h；依次類推，使利福平的濃度逐漸由5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL、150 μg/mL直至增加到300 μg/mL，培養得到抗利福平的菌株。將得到的抗利福平菌株接種到含300 μg/mL利福平和5 μg/mL氯霉素（Chloramphenicol）的LB液體培養基中，對同時抗利福平和氯霉素的雙抗菌株進行篩選，篩選過程中，LB液體培養基中利福平的濃度為300 μg/mL，氯霉素濃度的遞加及篩選方法與抗利福平菌株的篩選方法相同，最終獲得同時抗利福平和氯霉素的雙抗標記菌株。

1.8 數據統計

采用EXCEL2003和SPSS23.0軟件對數據進行統計分析。采用單因素（one-way ANOVA）和Duncan法進行方差分析和多重比較（=0.05），方差不齊的則采用非參數Kruskal-Wallis法進行差異顯著性檢驗（=0.05）。表中數據為平均值±標準誤差。

2 結果與分析

2.1 菌種的分離與篩選

從LB固體培養基和PDA固體培養基共分離處92株菌。通過苯胺藍、羧甲基纖維素鈉、愈創木酚、固氮、溶磷、解鉀實驗作為篩選條件，同時滿足三種及三種以上條件者為目標菌株，獲得TG-5菌株[23]。

2.2 目標菌株鑒定

形態學鑒定顯示：TG-5該菌革蘭氏染色陽性，在LB培養基上37 ℃培養24 h后，單菌呈乳白色、不透明、不規則、隆起、邊緣波狀。顯微鏡觀察發現，菌落為圓形或者橢圓形，淡黃色，邊緣不規則，不透明微隆起呈滴蠟狀。蘇云金桿菌菌體在顯微鏡下呈紫色橢圓形桿狀，大小為（1.2～1.8）μm×（3.0～5.0）μm，呈短鏈或者長鏈狀排列，芽孢為橢圓形，靠近中間生長，芽孢囊微膨大。

2.3 生理生化特征

表 2 TG-5生理生化鑒定結果

2.4 菌株的分子生物學鑒定

TG-5的16S rRNA基因序列以登錄號RID-8MG9P79F013 QUERY-39355保存在NCBI數據庫中，初步鑒定該菌為蘇云金芽孢桿菌[24,25]。

圖 1 TG-5的16S rRNA基因序列

2.5 菌株生長特性

2.5.1 發酵培養基中最佳C、N、無機鹽[26,27]

圖 2 不同碳源吸光度變化

圖 3 不同氮源吸光度變化

圖 4 不同無機鹽吸光度變化

圖 5 不同培養時間吸光度變化

2.5.2 培養條件的篩選與優化

圖 6 不同接種量對吸光度的影響

圖 7 不同溫度對吸光度的影響

圖 8 不同pH值對吸光度的影響

圖 9 不同轉速對吸光度的影響

2.5.3 正交實驗培養基組分的優化

表 2 培養基各組分比優化的正交試驗結果

其中，1值：每個因素下對應水平為1的實驗結果的和；2就是每個因素下對應水平為2的實驗結果的和；是每個因素下的最大值減最小值。

2.6 菌株發酵過程中溶解無機磷能力測定

圖 10 不同菌株解磷吸光度變化

其中，T0為目標菌株TG-5；T1為蘇云金桿菌；T2為地衣芽孢桿菌；T3為解淀粉芽孢桿菌；T4為枯草芽孢桿菌

2.7 雙抗生素菌株的篩選

將篩選的雙抗標記菌株在不含利福平和氯霉素的LB固體培養基和LB液體培養基中，交替培養3～5代，再分別回接到含利福平300 μg/mL和氯霉素300 μg/mL的LB液體培養基中培養，以證實菌株耐藥穩定性，最終獲得能夠穩定遺傳并且同時抗利福平和氯霉素的雙抗標記菌株用于以后實驗。

3 討論與結論

蘇云金芽孢桿菌在殺蟲促生功能與代謝產物上都不盡相同，因此，準確的分類鑒定對其在農林生產中的應用具有重要意義[28]。在研究蘇云菌株促生潛力之前必先清楚不同碳源對菌株生物量的影響以免造成混淆以及在制劑生產過程中不必要的煩擾。通過形態學來確定蘇云菌的分類地位向來是研究者的一個難題，因為同一屬的不同菌種，特別是相近種在形態學上的差別不大。單從形態特征等方面去確定蘇云菌的種間分類地位，其鑒定結果的準確性很難令人信服。因此，本研究在形態學比對的基礎上，采用16sRNA基因序列分析作為輔助鑒定手段，提高了菌株TG-5鑒定的準確性。國內外大量的研究結果表明，蘇云菌的殺蟲作用具有廣譜性，集定殖能力強和多種拮抗機制并存等優勢。篩選出的培養基中添加玉米粉與黃豆粉時，生物量最大。篩選出的培養基中分別添加氯化鈣、硫酸亞鐵、磷酸鋁3種無機氮源時，三者對生物量的影響不顯著，因此選用氯化鈣[29-32]。上述試驗說明蘇云金芽孢桿菌TG-5所使用發酵材料較為廉價易得，可進行大量擴繁，投入生產，具有制成促生制劑的潛力。蘇云金芽孢桿菌TG-5是從山東省泰安市干旱瘠薄山地根際土壤中分離得到的一株具有良好促生作用的菌株，其對鉀長石粉和枸溶性磷有良好的活化作用，對作物形態學指標具有較明顯的促生作用，所使用的固體發酵材料廉價易得。綜上，該菌株具有較好的促生應用潛力。但田間情況復雜，蘇云菌群體的定殖能力和生存能力受到一定的限制，其促生效果不穩定。因此，有關該菌株對作物植物促生的作用機理以及在田間的定殖能力和生防效果還有待于進一步試驗和研究。

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Isolation and Screening of a High-efficiency Growth-promoting Strain and Preliminary Exploration for Fermentation Conditions

DU Hong-bo, GONG Jie, GAO Ting, LI Chuan-rong*

271018,

In order to screen the growth-promoting bacteria that can effectively promote plant growth, aTG-5 was isolated from the rhizosphere soil of perennial plants in Taishan Mountains, Tai'an City, Shandong Province. It was identified asby morphological features and 16SrRNA analysis. The phosphorus-dissolving ability of NBRIP medium was measured. The results showed thatTG-5 had better phosphorus-dissolving effect on calcium phosphate medium. 10.7 times or more. Through preliminary exploration of the solid fermentation conditions of this strain, it was found that the optimum ratio of the main components of the fermentation medium, corn meal and soybean meal, was 2:3, and the biomass was the largest when the carbon and nitrogen sources were corn meal and soybean meal, respectively. The above experiments proved thatTG-5 has good growth-promoting application potential and can be further expanded.

Soil microbe;; isolation;fermentation condition

S154.34

A

1000-2324(2022)06-0825-07

2022-03-20

2022-04-12

山東省林業科技創新項目(2019LY005)

杜洪波(1982-),男,博士研究生,專業方向恢復生態學. E-mail:843029963@qq.com

Author for correspondence. E-mail:chrli@sdau.edu.cn

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.002