太子參連作根際土壤中3株真菌的分離鑒定及其生物學特性研究

周丹,朱梅,韋雪嬌,胡華林,程搏幸*

太子參連作根際土壤中3株真菌的分離鑒定及其生物學特性研究

周丹1,朱梅1,韋雪嬌1,胡華林2,程搏幸1*

1. 貴州師范學院生物科學院, 貴州 貴陽 550018 2.貴州醫科大學省部共建藥物植物功效與利用國家重點實驗室/貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室, 貴州 貴陽 550014

本文對太子參連作根際土壤分離培養的3株真菌進行分子生物學鑒定，并從溫度、pH、碳源及光照等方面對其生物學特性影響進行了研究。結果表明，通過對菌株形態進行觀察和結合系統發育樹進行分析，初步判斷菌株A為卵形球托霉(，菌株F為赭綠青霉()，菌株L為尖孢鐮刀菌（)。菌株A在以D-果糖為碳源、溫度30 ℃、pH 11、連續黑暗培養條件下生長良好。菌株F在以糊精為碳源、溫度25 ℃、pH值5和6、12 h光暗交替培養條件下生長良好。菌株L以α-乳糖為碳源，溫度條件為25 ℃，堿性條件下，連續黑暗或12 h光暗培養條件下，生長較好。

太子參; 土壤微生物; 生物學特性

太子參（）為石竹科植物，其異葉偽繁縷的塊根為主要經濟部位，被國家衛生部登記“可用于保健食品的中藥材名錄”[1]。至被貴州省列為重點中藥材特色產業以來，種植面積迅速增加，持續位居全國第一[2]。太子參產業快速發展的同時，由于土地資源有限，連作成為太子參種植的主要方式，使得太子參種植過程中真菌病害頻發，從而導致其連作障礙加劇，嚴重的影響了太子參的產量和品質[3]。連作導致作物土壤真菌增加，其指示真菌已經成為目前的研究熱點[4,5]。高慧芳等[6]已從不同的太子參連作樣地根際土壤中檢測出優勢屬中兩種常見真菌為致病菌，Chen J等[7]和Wu L等[8]已經證實真菌中的鐮刀菌是引起太子參連作效應的一類高致病菌。而目前太子參連作過程的真菌研究多以葉片病原真菌、土壤微生物多樣性研究為主[6,9]，對其根際土壤真菌生物學特性的報道不夠全面。根際真菌在作物生長過程中受溫度、pH、碳源等因素的影響，明確其生物學特性可為防治病害奠定基礎。鑒于根際土壤中病原真菌對太子參產業潛在的威脅，本研究從施秉縣桐木榜村太子參連作三年根際土壤中，對已篩選獲得的3株真菌進行分離鑒定和明確其種屬類型后，對其生物學特性研究，探究溫度、pH值、光照以及培養基碳源對其生長的影響，以期了解3株真菌的生長規律，為今后進一步探究太子參連作根際土壤中病原真菌或拮抗真菌在連作過程中對太子參的致病特性或拮抗特性的研究奠定基礎，也為深入開展太子參連作過程病原真菌的防治提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2020年6月從貴州省施秉縣桐木榜村太子參基地采集連作三年根際土，帶回實驗室進行分離培養。

1.2 真菌的分離純化

將根際土壤用無菌水制備為土壤懸液后，移取0.5 mL接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基上，25 ℃培養24 h。觀察并記錄菌株的菌落形態、顏色等，并對其進行分離純化后，將菌株保存于試管斜面，4 ℃下保存[10]。

1.3 真菌的鑒定

1.3.1 形態學觀察本實驗共篩選出40余株真菌純菌株。經多次純化后，將其中3株形態特征較為穩定的菌株分別接種到PDA平板上，25 ℃恒溫培養箱中培養5 d，觀察并拍照記錄菌落顏色、菌絲特征、菌落形態特征及生長情況。

1.3.2 分子生物學鑒定將純化的3株真菌分別接種于液體培養基中，置于溫度為25 ℃，轉速120 r/min的搖床內培養3 d。將菌絲球按照真菌基因組DNA提取試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）說明書提取病原菌基因組DNA。使用PCR擴增試劑盒、引物ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3）和ITS4ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）（上海生工公司合成）對所提取的菌株DNA進行擴增。PCR反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環；擴增后的PCR產物進行1.0%瓊脂電泳后，送至上海生物工程有限公司進行測序。將所得的核苷酸序列提交至blastGenBank中的序列進行同源比較，以FASTA格式下載后，用MEGA7.0軟件比較測序結果的同源性，用鄰接法構建系統發育樹。

1.4 生物學特性

1.4.1 不同溫度對菌絲生長的影響取置于25 ℃恒溫培養箱中培養5 d，菌絲生長良好的菌落平板，沿菌落邊緣用打孔器取直徑為5 mm的菌餅，分別在4、10、15、20、25、30、35、40 ℃八個不同溫度的培養箱中培養[11]，用十字交叉法測量并記錄其5 d的菌落直徑。每個處理重復5次。

1.4.2 不同pH值對菌絲生長的影響將培養基的pH值設置為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0七個梯度，用1 mol/L鹽酸和氫氧化鈉將PDA培養基調到不同pH值。使用直徑為5 mm的打孔器，沿置于25 ℃恒溫培養箱中培養5 d的菌落平板邊緣打取菌餅，接種于不同pH值的PDA培養基上，置于25 ℃恒溫培養箱中培養5 d養[12]，測量及培養方法同1.3.1，每個處理重復5次。

1.4.3 不同碳源對菌絲生長的影響本實驗以麥芽糖、D-果糖、α-乳糖、糊精、蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉為供試碳源，按比例配制不同碳源類型培養基[13]。取于25 ℃恒溫培養5 d的菌落平板，沿菌落邊緣用打孔器取直徑為5 mm的菌餅，接種到不同碳源培養基上，培養及測量方法同1.3.1，每個處理重復5次。

1.4.4 不同光照對菌絲生長的影響用打孔器沿菌落邊緣取出直徑為5 mm的菌餅，接種至PDA培養基平板中，培養及測量方法同1.3.1，每個處理重復5次。在全光、12 h光暗交替和黑暗條件下培養5 d[11,14,15]。

2 結果與分析

2.1 形態學觀察

2.1.1 形態學觀察如圖1所示，3株菌株在PDA培養基上培養7 d的情況。菌株A菌落正面為白色，背面略呈放射輪紋狀。中間菌絲濃密，邊緣質地薄且呈半透明狀；菌落近圓形，氣生菌絲半透明，絨毛狀平鋪，透明圓形孢子囊。菌株F菌落正面為綠松石色，邊緣為白色，菌落表面呈粉末狀，以同心徑向環的形式向外延伸，具橫隔，氣生菌絲松絮狀。在PDA培養基上，菌株L的菌落呈圓形、隆起、絮狀，菌絲為淡粉色或淡紫色，小型分生孢子無色，卵圓形。

圖 1 菌株A, F, L在PDA培養基上的形態特征和顯微特征

注：a, b-菌落A形態；c-菌落A顯微形態；d, e-菌落F形態；f-菌落F顯微形態；g, h-菌落L形態; i-菌落L顯微形態。

Note: a,b-Morphological characteristics of A;c-Microscopiccharacteristics of A;d,e-Morphological characteristics of F; f-Microscopiccharacteristics of F; g, h-Morphological characteristics of L; i-Microscopiccharacteristics of L.

2.2 分子生物學鑒定

對菌株A、F、L的ITS片段進行特異性擴增并測序，得到的序列于BLAST中，選取同源性較高的序列，用MEGA7構建系統發育樹(圖2)。結果表明，菌株A與卵形球托霉（）同源高，菌株F與赭色青霉（）同源性高，菌株L與尖孢鐮刀菌（）基因同源性高，結合形態特征初步判斷三種菌株分別為卵形球托霉（）、赭綠青霉（）、尖孢鐮刀菌（）。

圖 2 基于ITS基因序列片段構建的菌株A,F,L系統發育樹

2.3 生物學特性

2.3.1 不同溫度對菌絲生長的影響不同溫度條件下培養5 d后，3株菌株的生長速度如圖3（<0.05），不同溫度條件下3株菌株生長量都存在顯著差異。溫度在15 ℃以下、35 ℃以上菌絲均難以生長，菌株A的最佳生長溫度為25～35 ℃，平均菌落直徑為35.9～47.8 mm，平均生長速度為7.18～9.56 mm/d，菌株F和菌株L的最佳生長溫度為20～30 ℃，菌株F的平均菌落直徑為30.2～44.8 mm，平均生長速度為6.04～8.96 mm/d，菌株L的平均菌落直徑為29.3～39.6 mm，平均生長速度為5.86～7.92 mm/d。在15～35 ℃范圍內，3株菌株菌絲生長均呈現由弱到強、再由強到弱的趨勢。

圖 3 不同溫度對菌株A, F,L菌絲生長的影響

2.3.2 不同pH對菌絲生長的影響3株菌株在不同pH條件下的菌落直徑如圖4（<0.05），在pH5～11的范圍內3株菌株均能生長。pH10和11的情況下，菌株A的菌落直徑略大于其他pH值的培養基。不同pH條件下菌株F生長具有顯著差異，且在堿性條件下生長較好。菌株L在堿性條件下平均生長速率明顯大于酸性與中性培養基，由此可知，菌株A和菌株L適于在堿條件下生長，菌株F適于在弱酸性和中性環境中生長。

圖 4 不同pH值對菌株A,F,L菌絲生長的影響

2.3.3 不同碳源對菌絲生長的影響培養5 d后，不同碳源條件下菌株A、F、L菌落生長直徑如圖5（<0.05）。根據實驗結果顯示，3株菌株在供試的七種碳源培養基菌落均生長良好。菌株A在不同碳源上的生長速率D-果糖>可溶性淀粉>糊精>麥芽糖>葡萄糖>蔗糖>α-乳糖，其中D-果糖上菌落平均生長速率為9.4 mm/d，而α-乳糖上平均生長速度為6.42 mm/d。菌株F在以糊精為碳源上平均生長速度為8.36 mm/d，在可溶性淀粉上平均生長速度為7.86 mm/d。菌株L在不同碳源條件下菌落直徑差異顯著，在不同碳源上的生長速率α-乳糖>可溶性淀粉>糊精>麥芽糖>葡萄糖>D-果糖>蔗糖，在α-乳糖平均生長速率達13.1 mm/d，而在蔗糖上的生長速率僅為6.76 mm/d。

圖 5 不同碳源對菌株A,F,L菌絲生長的影響

2.3.3 不同光照對菌絲生長的影響不同光照條件下培養5 d后株菌A、F、L菌落生長情況如圖6（<0.05）。從圖中可以看出，不同光照條件對菌株A、F、L菌落生長影響程度不同，但均能生長良好。菌株A與菌株F菌落直徑生長差異明顯，菌株A的生長速率在連續黑暗>12 h光暗交替>連續光照。菌株F在12 h光暗交替條件下菌絲生長速度最快。菌株L對光的敏感程度低于菌株A與菌株F，在12 h光暗交替和連續黑暗條件下菌生長量無顯著差異，且生長速率大于連續光照條件下菌生長速率。

圖 6 不同光照條件對菌株A,F,L菌絲生長的影響

3 討 論

連作是導致太子參生長發育受阻、產量降低、品質變差、土傳病增加的主要原因之一，目前學術界關于太子參連作障的研究礙日益增多，以期為太子參事業的發展提供理論基礎。本研究針對所篩選出的3株真菌展開分子生物學鑒定與生物學特性研究，對其菌落形態和系統發育樹進行比較分析，以了解所分離菌的生長環境因子。結果表明，菌株A與卵形孢球托霉（）菌落形態相似[16]，菌株A與卵形孢球托霉（MH857761.1）同源性為96%，初步鑒定為卵形孢球托霉。菌株F與王帆等[15]所研究的赭綠青霉在形態學和生物學特性上具有很高的相似性，與赭綠青霉（）（MT072050.1）同源性高達99%，初步鑒定為赭綠青霉。本研究同時參考了國內報道的三七根腐病、設施韭菜根腐、甘草根腐病等研究報道尖孢鐮刀菌的形態特征[17-21]，以及對系統發育樹分析發現，菌株L與菌株（）（MW513784.1）同源性高達99.8%，初步鑒定菌株L為尖孢鐮刀菌。并結合國內相關報道，卵形孢球托霉報道了因其產生乳酸使石灰石中Ca、Mg等離子溶出，從而對石灰石產生侵蝕作用[16]。赭綠青霉對棉鈴蟲幼蟲、家蠶幼蟲及柑橘全爪螨雌有一定的生防作用[19]。鐮刀屬菌則被報道為多數作物的主要致病菌之一，嚴重影響作物的產量及品質。如，汪靜等[22]在三七根腐病的研究中發現其中一株致病菌為尖孢鐮刀菌；肖榮鳳等[23]研究發現導致太子參根腐病病原菌為尖孢鐮刀菌。因此，可初步推測本次所分離的卵形孢球托霉和尖孢鐮刀菌侵染太子參后具有一定的致病性，而赭綠青霉可能對太子參的蟲害存在一定防治作用，且從太子參根際土壤中分離篩選出卵形孢球托霉和赭綠青霉屬首次報道。

對于一種連作障礙嚴重的作物，明確其連作過程根際土壤真菌物種的同時，了解其生物學特性是開展連作障礙機理和緩解效應研究的前提，不僅可以明確其真菌在環境種的適應能力，也有利于了解連作障礙發生與環境因素之間的聯系。本試驗不同溫度、pH值、碳源和光照條件下對3株真菌生長情況進行了了解，發現3株菌株對營養要求均不嚴格，在所有供試培養基上均可生長。關于菌株A的生物學特性研究報道較少，本研究發現其以D-果糖為碳源時生長速度最快，最適生長溫度25～35 ℃，適合在堿性條件下生長。本研究得出菌株F的生長速度最快的碳源為糊精，與前人研究差異較大[15]，這可能是赭綠青霉在不同環境下利用碳源的差異較大；最適生長溫度為25 ℃，適宜于弱酸性和中性環境中生長。關于菌株L的生物學特性研究，研究者們認為其適宜多種碳源[17,24]，但少有關注以糊精為碳源的生長情況，本研究得出其在糊精為碳源培養基也能較好的生長，但α-乳糖為最佳碳源；其適宜培養溫度與敬雪敏等[24]研究結果基本一致，適宜于堿性條件。同時，3株菌株在三種光照條件下均能較好生長，說明光照對其的生長影響較小。

本研究通過菌落形態和系統發育樹對太子參連作三年根際土壤中3株真菌進行了初步鑒定，并通過生物學特性試驗初步明確了3株真菌菌絲的最適條件，對其生活習性有了初步的了解，為今后進一步探究太子參連作根際土壤中病原真菌或拮抗真菌在連作過程中對太子參的致病特性或拮抗特性的研究奠定基礎，也為深入開展太子參連作過程病原真菌的防治提供一定的理論依據。但卵形孢球托霉和尖孢鐮刀菌對太子參的侵染機制，以及赭綠青霉對太子參是否具有生防作用還有待于進一步研究。

4 結 論

（1）通過對菌株形態進行觀察和結合系統發育樹進行分析，初步判斷菌株A為卵形球托霉()，菌株F為赭綠青霉()，菌株L為尖孢鐮刀菌（)；

（2）菌株A在以D-果糖為碳源、溫度30 ℃、pH值11、連續黑暗培養條件下生長良好。菌株F在以糊精為碳源、溫度25 ℃、pH值5和6、12 h光暗交替培養條件下生長良好。菌株L以α-乳糖為碳源，溫度條件為25 ℃，堿性條件下，連續黑暗或12 h光暗培養條件下，生長較好。

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Isolation, Identification and Biological Characteristics of Three Fungi from Continuous Cropping Rhizosphere Soil of

ZHOU Dan1, ZHU Mei1, WEI Xue-jiao1, HU Hua-lin2, CHENG Bo-xing1*

1.550018,2.550014,

Three strains of fungi isolated from Continuous Cropping RhizosphereSoil ofwere identified by molecular biology, and the effects of temperature, pH, carbon source and light on their biological characteristics were studied. The results showed that strain A was identified asand strain F was identified asby morphological observation and phylogenetic tree analysis. Strain L was. Strain A grew well under continuous dark culture condition with D-fructose as carbon source, temperature 30 ℃, pH 11. Strain F grew well under the condition of alternating light and dark culture with dextrin as carbon source, temperature 25℃, pH 5, 6, 12 h. Strain L grew well with α-lactose as carbon source under the condition of 25 ℃, alkaline, continuous dark or 12 h light dark culture.

;soil microbe;biological characteristics

S154.3

A

1000-2324(2022)06-0839-06

2022-10-21

2022-12-21

貴州省科技廳計劃項目(黔科合支撐[2021]一般245);貴州省青年科技項目(黔教合KY字[2021]242);貴州師范學院“大地論文工程”科研成果(貴師院發[2020]99號);食用菌黑腹果蠅綠色防控關鍵技術研究(黔科合支撐[2019]2334)

周丹(1979-),女,碩士,高級實驗師,主要從事連作障礙工作. E-mail:zhoudan_213@163.com

Author for correspondence. E-mail:kama225cbx@126.com

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.004