牛卵巢膜細胞和大黃體細胞差異表達基因的篩選

范若楠孟金柱楊曉馬曉婉肖麗琳王水蓮

牛卵巢膜細胞和大黃體細胞差異表達基因的篩選

范若楠,孟金柱,楊曉,馬曉婉,肖麗琳王水蓮*

湖南農業大學 動物醫學院, 湖南 長沙 410128

為探索牛卵巢膜細胞（TCs）和大黃體細胞（LLCs）的差異表達基因并揭示其中潛在的生理關系，從NCBI中GEO（GENE EXPRESSION OMNIBUS）數據庫中獲取GSE83524芯片數據，并利用R軟件limma包中的DESeq2進行數據分析，以篩選出TCs和卵巢黃體中LLCs之間的差異性表達基因；使用DAVID軟件對上述所獲得的差異性表達基因分別進行GO功能富集分析和KEGG信號通路分析；利用String數據庫和Cytoscape軟件構建了差異表達基因之間的蛋白互作網絡（PPI），并通過Cyto-Hubba插件中的MCC算法篩選出連通度最大的前10位的關鍵基因，結合數據庫查找出卵泡發育相關的候選基因。結果顯示，經DESeq2分析后，共獲得差異性表達基因228個（上調基因143個，下調基因85個）；GO功能富集分析結果顯示，富集到生物學過程、細胞組分及分子功能的差異表達基因分別占比33．8%、55．7%和10．5%；KEGG信號通路分析共獲得18條信號通路，其中，HTLV-I感染通路中基因富集最多（16個）；PPI網絡互作分析并篩選出了連通度最大的前10位的關鍵基因；進一步通過數據庫查找發現、、、和分別在卵泡發育過程中發揮著重要的作用。本研究結果為進一步探究卵泡膜細胞黃體化以及牛卵泡發育的分子機制奠定基礎。

牛; 細胞; 基因表達

卵泡膜細胞（Thecal Cells，TCs）是存在于雌性哺乳動物卵泡中的一種生殖細胞[1]。TCs起源于卵巢中的成纖維樣基質細胞[2]，可在黃體生成素（Luteinizing Hormone，LH）的刺激下合成雄激素，進一步被轉運到顆粒細胞（Granulosa cells, GCs），在卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone，FSH）的協同作用下，將雄激素轉化為雌二醇（Estrogen，E2），從而誘導卵母細胞成熟[3]。哺乳動物卵泡成熟并排卵后，會形成一種內分泌腺——黃體(Corpus Luteum，CL)，其主要由卵泡TCs和GCs分化形成，CL內的黃體細胞又分為大黃體細胞（large luteal cells, LLCs）和小黃體細胞（small luteal cells, LLCs），在奶牛和綿羊卵巢的研究中發現，LLC和SLC均有分泌孕酮(Progesterone，P)的能力，且LLC的孕酮分泌量是SLC的20倍[4-6]，但其具體的調控機制尚不清楚。關于細胞類型特異性受體和類固醇生成酶已有文獻報道[7]，但是不同細胞類型之間基因表達的差異仍鮮有報道。

洪小曼等[8]對妊娠期前后的母牛進行特異性轉錄組研究發現，排卵前其體內的CL數量存在顯著性增多，并且在TCs中發現許多新的可以調控LH的基因，如在妊娠前后，TCs中的CYP19A1基因表達明顯上調。孟金柱等[9]研究了顆粒細胞和黃體細胞的差異基因表達，篩選出5個與GCs增殖和卵泡黃體化相關的差異表達基因。但上述研究主要集中在顆粒細胞和LLCs或TCs之間的關系，尚未存在學者對TCs與LLCs之間的細胞基因差異表達方面的研究。張華[10]等研究顯示，在黃體化過程中，卵泡膜細胞會有一個快速增殖過程，在LH的作用下膜細胞與顆粒細胞會失去原有的形態形成黃體，但對于卵泡膜細胞黃體化的機制尚不清楚。因此，本研究基于GEO數據庫GSE83524芯片數據，利用生物信息學方法獲取LLCs和TCs間的差異表達基因，對卵泡膜細胞黃體化的重要基因進行生物信息學分析，為卵泡膜細胞黃體化機制研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 芯片數據

本研究中使用的與牛卵泡發育相關的表達譜數據選自GEO數據庫（www．ncbi．nlm．nih．gov/geo），并下載了GSE83524芯片數據，其中包含了牛優勢卵泡的3個TCs樣本和牛黃體的3個LLCs樣本。

1.2 差異表達基因篩選

利用R語言中的limma包中的DESeq2進行數據分析，篩選存在于牛卵泡中TCs和卵巢黃體中LLCs之間的差異性表達基因，閾值設定為FPKM≥2，|1b差異倍數|≥1，校正后的<0.01。

1.3 GO及KEGG信號通路分析

使用DAVID在線軟件（https://david．ncifcrf．gov/）對上述所獲得的TCs和LLCs之間的差異性表達基因進行了GO功能富集分析，將差異表達基因按功能分為生物學過程、細胞組分和分子功能3類，并利用KEGG進行通路分析。

1.4 蛋白相互作用網絡（PPI）的構建和關鍵基因的選取

利用String數據庫和Cytoscape軟件構建了差異表達基因之間的蛋白互作網絡（PPI），利用Cyto-Hubba插件中的MCC算法篩選出連通度最大的前10位的關鍵基因，并通過Uniprot（https://www．uniprot．org/）及Gene card（https://www．genecards．org/）數據庫對上述獲取的TCs與LLCs之間的差異表達基因進行功能查找，找出與卵泡發育相關的候選基因。

2 結果與分析

2.1 差異表達基因的篩選

根據R軟件中的DESeq2分析結果顯示，試驗獲得了143個上調基因，85個下調基因，共計228個差異表達基因（圖1）。

圖 1 牛卵巢膜細胞與大黃體細胞差異表達基因層次聚類圖和火山圖

2.2 差異表達基因GO功能富集分析

通過DAVID軟件對TCs和LLCs間228個差異表達基因進行GO功能富集分析結果顯示（圖2），33.8%的總差異表達基因與生物學過程有關，分別富集在34個組分里，主要與RNA聚合酶II啟動子的轉錄負調控、DNA模板化的轉錄負調控和細胞增殖調節相關。55.7%總差異表達基因的與細胞組分有關，分別富集在14個組分里，其中細胞質、細胞核和細胞外外分泌體富集的基因最多。10.5%總差異表達基因與分子功能相關，分別富集在10個組分，主要富集在轉錄因子活性和生長因子活性等功能上，并且其中存在CYP19A1，其可參與類固醇激素的生物合成，在卵泡發育過程中起了至關重要的作用[11]。

圖 2牛卵巢膜細胞與大黃體細胞差異表達基因GO功能注釋分析

2.3 差異表達基因KEGG信號通路分析

為了獲得與卵泡TCs增殖和黃體化相關的信號通路，用DAVID軟件對獲得的差異表達基因進行KEGG信號通路分析，結果如圖3所示，共獲得18條信號通路。其中，HTLV-I感染通路上基因富集最多，有16個基因。而參與PI3K/AKT信號通路的13個基因，結合熱圖分析，有5個基因（NR4A1，TNN，PRLR，IL6，CDKN1A）表達上調，8個基因（GHR，COL1A1，COL1A2，COL6A3，JAK3，PDGFRA，COL3A1）表達下調，其中，已有研究證明PRLR，COL1A1這些基因與卵泡發育相關，通過參與PI3K/AKT信號通路來影響黃體生成以及卵泡發育[12]。

圖 3 牛卵巢膜細胞與大黃體細胞差異表達基因KEGG信號通路分析

2.4 PPI網絡互作分析

用String軟件分析228個差異表達基因的PPI網絡互作，利用Cytoscape軟件的可視化分析產生的PPI互作數據，并利用MCC算法篩選出連通度最大的前10位的關鍵基因（圖4、圖5），即：UBE2C、ANLN、PBK、CENPF、BUB1B、CDKN3、ASPM、KIF11、CDC20、MKI67

圖 4 牛卵巢膜細胞與大黃體細胞差異表達基因PPI網路互作分析

圖 5 牛卵巢膜細胞與大黃體細胞關鍵基因PPI網路互作分析

2.5 卵泡發育相關的候選基因篩選

進一步通過Uniprot和Gene Card等數據庫搜索發現、、、、、、、、等基因都在一定程度上在卵泡發育過程中起著關鍵作用（表1）。

表 1 牛卵泡發育相關候選基因

3 討論

卵泡是雌性動物中卵母細胞成熟和生長發育的必要環境[13]。CL則是決定哺乳動物成功妊娠的關鍵內分泌器官[14]。目前對卵泡發育的研究表明，黃體由卵泡分化而來，卵泡中的顆粒細胞和膜細胞分別分化為黃體中的大黃體細胞和小黃體細胞[15]。孟金柱的研究表明在顆粒細胞黃體化過程中PRLR、SPARCL1、INHA、GREB1、CYP19A1五個基因起了重要作用[9]，其中PRLR、INHA、GREB1、CYP19A1與本研究結果相同，說明這四個基因無論是在顆粒細胞黃體化或者膜細胞黃體化過程中均有重要作用，但尚未有研究明確表明膜細胞黃體化的機制。

在黃體化過程中，雌激素及雄激素分泌量下降，LH、催乳素（PRL）和生長因子受體的表達升高，其中E2是主要胚胎信號[16]，可以促進顆粒細胞的增殖[17]，當顆粒細胞分化為LLCs時，大量前列腺素F2α（PGF2α）受體（PTGFR）就會得到表達，抑制垂體分泌LH[9]；且已有文獻證明PTGFR與卵泡發育密切相關[18]。此外，郭淑華[19]等也發現在黃體化過程中，前列腺素 F2α(PGF2α)的含量會大幅上升。排出的卵子若不能受精形成受精卵，PGF2α就會與LLCs中PTGFR結合，誘導黃體溶解、退化，使卵泡的發育得以繼續[20]。參與卵巢功能的基因的表達還包括芳香酶;CYP19A1，芳香酶是參與雄激素轉化為雌激素的關鍵酶，在卵泡生長發育過程中CYP19A1起了關鍵作用[21]。

本研究利用GEO數據庫GSE83524來分析LLCs與TCs的轉錄組數據，在兩種細胞中得到了228個差異表達基因，其中，表達上調的基因有143個，表達下調的基因有85個。CYP19A1，GREB1是篩選出差異倍數最高的前十個基因中與乳腺癌有關的基因，其中有研究表明，GREB1是通過與染色質結合激活雌激素受體α（EstrogenReceptor，ER），對ER介導的轉錄至關重要，因為它穩定了ER與其他輔因子之間的相互作用，在三種異種移植腫瘤中顯示出GREB1-ER相互作用，并使用定向蛋白質-蛋白質方法，發現GREB1-ER相互作用在一半的ER+原發性乳腺癌中[22]。COL1A1也被證明與乳腺癌有關，COL1A1細胞表達可促進乳腺癌轉移，是乳腺癌新的預后生物標志物和潛在治療靶點，特別是在ER+患者中[12]。

PI3K/Akt信號通路與卵巢功能相關，包括原始卵泡募集、顆粒細胞增殖、黃體存活和卵母細胞成熟[23]。本試驗分析了GO、KEGG信號通路及PPI網絡的相互作用，共有13個基因在此通路中扮演了重要角色。胚胎著床期間的子宮內膜合成的PRL是卵巢調節網絡中的一個重要因素，子宮內膜上存在的PRLR可以為胚泡著床提供適宜的微環境，以此來提高子宮內膜容受性，因此，PRL及其受體是胚泡著床和妊娠維持所必須的[24]。

綜上所述，已經可以證明、、、和等基因在卵泡膜細胞的黃體化過程中發揮了重要作用。

4 結論

本研究對牛TCs與LLCs之間的差異表達基因進行生物信息學分析，發現和等基因可能在卵泡膜細胞黃體化過程中發揮重要作用，為進一步探究牛卵泡發育的分子機制奠定基礎。在后續研究中，需要使用Q-PCR等實驗技術來進一步驗證，有助于更加深入的分析卵泡發育的分子機制。

[1] 趙園園,吳震洋,安清明,等.牛優勢卵泡顆粒細胞與膜細胞中生殖激素合成相關基因的篩選與分析[J].西北農林科 技大學學報(自然科學版),2021,49(7):11-19

[2] 謝光斌,朱磊磊,王勇.卵泡膜細胞與卵巢功能的調控[J].國際婦產科學雜志,2012,39(1):13-17

[3] Perego MC, Morrell BC, Zhang LN,. Developmental and hormonal regulation of ubiquitin-like with plant homeodomain and really interesting new gene finger domains 1 gene expression in ovarian granulosa and theca cells of cattle [J]. Journal of Animal Sscience, 2020,98(7):1-12

[4] Trevisol E, Mogollon HD, Ackermann CL,. Partial luteolysis during early diestrus in cattle downregulates VEGFA expression and reduces large luteal cell and corpus luteum sizesand plasma progesterone concentration [J]. Theriogenology, 2020,158:188-195

[5] 徐靖博.miR-126在牛黃體不同發育時期表達規律及其功能[D].長春:吉林大學,2013

[6] 朱寶長.兩種黃體細胞的內分泌功能及其調節[J].中國獸醫科技,1988(10):57-59

[7] Romereim SM, Summers AF, Pohlmeier WE. Gene expression profiling of bovine ovarian follicular and luteal cells provides insight into cellular identities and functions [J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2016,439:379-394

[8] Christenson LK, Gunewardena S, Hong X,. Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes [J]. Mol Endocrinol, 2013,27(7):1153-1171

[9] 孟金柱,吳震洋,安清明,等.牛黃體細胞與卵泡顆粒細胞差異基因的篩選[J].中國獸醫學報,2021,41(6):1187-1194

[10] 張華.5-HT對離體培養的山羊黃體細胞生長的影響[D].楊凌:西北農林科技大學,2011

[11] 孟金柱.牛卵泡發育相關基因表達的研究[D].太谷:山西農業大學,2014

[12] Liu J, Shen JX, Wu HT,. Collagen 1A1 (COL1A1) promotes metastasis of breast cancer and is a potential therapeutic target [J]. Discovery Medicine, 2018,25(139):211-223

[13] Hummitzsch K, Anderson RA, Wilhelm D,. Stem cells, progenitor cells, and lineage decisions in the ovary [J]. Endocrine Reviews, 2015,36(1):65-91

[14] Kaczynski P, Baryla M, Goryszewska E,. Estradiol-17β regulates expression of luteal DNA methyltransferases and genes involved in the porcine corpus luteum function in vivo [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021,22(7):225-236

[15] 陳靜波.牛妊娠期黃體形態結構及卵母細胞體外胚胎生產的研究[D].楊凌:西北農林科技大學,2003

[16] Garverick HA, Polge C, Flint AP. Oestradiol administration raises luteal LH receptor levels in intact and hysterectomized pigs [J]. Journal of Reproduction and Fertility, 1982,66(1):371-377

[17] 蘇行,蘭剛,胡深強,等.雌二醇對鵝等級卵泡顆粒細胞的效應分析[J].農業生物技術學報,2021,29(11):2166-2176

[18] 李鵬飛,孟金柱,景炅婕,等.轉錄組測序篩選牛卵泡發育相關基因及其表達差異分析[J].中國農業科學,2018,51(15):187-195

[19] 郭淑華.哺乳動物黃體發生的分子機制[J].濰坊學院學報,2009,9(4):90-95

[20] Chou CH, Meiyou C. The effect of steroid hormones on ovarian follicle development [J]. Vitamins and Hormones, 2018,107:155-175

[21] Serge C, Sonia B, Sophie L,. Reproductive system: aromatase and estrogens [J]. Molecular and Cellular Endocrinology, 2002,193(1):137-143

[22] Hisham M, Clive D, Aurelien A,. Endogenous purification reveals GREB1 as a key estrogen receptor re gulatory factor [J]. Cell Reports, 2013,3(2):342-349

[23] Adhikari D, Liu K. Molecular mechanisms underlying the activation of mammalian primordial follicles [J]. Endocrine Reviews, 2009,30(5):438-464

[24] 程玲慧,曹云霞.催乳素、孕酮、雌二醇及其受體對早期胚胎發育的影響[J].實用婦產科雜志,2011,27(4):307-309

Screening of Differentially Expressed Genes in Ovarian Theca Cells and Large Luteal Cells of Cattle

FAN Ruo-nan, MENG Jing-zhu, YANG Xiao, MA Xiao-wan, XIAO Li-lin, WANG Shui-lian*

410128,

To explore the potential physiological relationship between bovine ovarian theca cells (TCs) and large luteal cells (LLCs), we analyzed the differentially expressed genes between the two cells using bioinformatics. The GSE83524 chip data was obtained from the GEO (GENE EXPRESSION OMNIBUS) database in NCBI. Then, R DESeq2 in R software limma was employed to screen differentially expressed genes between TCs and LLCs from GSE83524 chip data. Next, DAVID software was used to analyze GO function enrichment and KEGG signal pathway of the differentially expressed genes obtained; The protein interaction network (PPI) between differentially expressed genes was constructed using String database and Cytoscape software. Finally, the top 10 key genes with the highest connectivity were screened through the MCC algorithm in the Cyto Hubba plug-in and Candidate genes related to follicular development were found according to the database. The results showed that 228 differentially expressed genes (143 up-regulated genes and 85 down-regulated genes) were obtained through DESeq2 analysis; The results of GO function enrichment analysis showed that the differentially expressed genes of biological processes, cell components and molecular functions accounted for 33.8%, 55.7% and 10.5% respectively; The results of KEGG signal pathway analysis showed that 18 signal pathways were obtained, mainly focusing on HTLV-I infection pathway. Further analysis of the top 10 key genes screened from PPI network interaction analysis showed that PRLR, COL1A1, INHA, GREB1 and CYP19A1 played an important role in follicular development. These results provide a basis for exploring the molecular mechanism of TCs and the development of LLCs.

Bovine; cell; gene expression

S823

A

1000-2324(2022)06-0900-06

2022-10-18

2022-11-07

國家自然科學基金(31672507);湖南省自然科學基金(2020JJ4359);湖南農業大學雙一流建設項目(SYL201802017)

范若楠(1999-),女,碩士研究生,主要從事動物生殖方面的研究. E-mail:2291498777@qq.com

Author for correspondence. E-mail:wangshuilian1234@126.com

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.014