響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助法提取奇亞籽中咖啡酸及其抗氧化性測定

侯笑林,項立譞,李明珠,馮金曉

響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助法提取奇亞籽中咖啡酸及其抗氧化性測定

侯笑林,項立譞,李明珠*,馮金曉

青島工學(xué)院食品工程學(xué)院, 山東 青島 266300

咖啡酸是天然的抗氧化劑，在化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，其具有多種生物活性，未來也可作為食品添加劑在食品領(lǐng)域得到應(yīng)用。本研究采用超聲波輔助乙醇法提取奇亞籽中咖啡酸，通過單因素試驗及響應(yīng)面優(yōu)化試驗對咖啡酸的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時對咖啡酸進(jìn)行抗氧化性研究。結(jié)果表明：當(dāng)乙醇濃度為82%，提取時間為26 min、提取溫度為62 ℃、料液比為1:20（g?mL-1）時，奇亞籽中咖啡酸提取量為656.475 mg?g-1。咖啡酸對DPPH自由基和羥基自由基清除能力隨著咖啡酸濃度的增加而提高，清除能力高于對照品VC，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.25 mg?mL-1時，最高清除率分別為69.18%和75.32%，具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

奇亞籽; 咖啡酸; 抗氧化性

奇亞籽是僅次于玉米、大豆的第三大糧食作物[1]，富含人體必需脂肪酸及多種抗氧化活性成分，并含有豐富的膳食纖維、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等[2]，在抗氧化[3]、調(diào)節(jié)血脂代謝、抑制肥胖、改善心血管[4]等方面發(fā)揮了重要作用。咖啡酸廣泛分布于茵陳、菜薊、金銀花等多種中藥植物中，屬于酚酸類化合物，具有抗菌、抗炎[5]、降脂降糖、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞損失保護(hù)[6]、利膽止血及抗氧化[7]等藥理作用。因其可以影響食物的色澤、穩(wěn)定性、風(fēng)味、營養(yǎng)價值從而在食品加工領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用，近年來逐漸成為研究的熱點，其在化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域也備受青睞[8]。目前，國內(nèi)關(guān)于奇亞籽的研究主要集中在食品的加工、奇亞籽蛋白及多糖的提取以及奇亞籽油的加工工藝優(yōu)化、品質(zhì)及性能提升等方面[9]，而關(guān)于奇亞籽中其他活性成分的提取及性能研究則鮮有報道。試驗探究超聲波輔助乙醇提取法提取奇亞籽中的咖啡酸，通過響應(yīng)面法對咖啡酸的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對咖啡酸的抗氧化性進(jìn)行測定，以期為咖啡酸應(yīng)用于食品抗氧化領(lǐng)域，延長食品保存期，服務(wù)于區(qū)域農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奇亞籽：安徽省沂澤生物科技有限公司；95%乙醇：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；DPPH：合肥巴斯夫生物科技有限公司；L-抗壞血酸：上海埃彼化學(xué)試劑有限公司；水楊酸：上海埃彼化學(xué)試劑有限公司；硫酸亞鐵：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品：潤友化學(xué)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1.3 試驗方法

1.3.1 咖啡酸的提取及測定（1）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備精密稱取咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品2.000 g，置于50 mL的棕色容量瓶中，加乙醇溶液定容至刻度，搖勻，制成濃度為0.04 g?mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密吸取咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入乙醇溶液定容至刻度，分別稀釋為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg?mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液于棕色量瓶中，在325 nm處測定其吸光度值，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。

（2）樣品溶液的制備及測定將奇亞籽放入粉碎機(jī)進(jìn)行干法粉碎，過60目篩。準(zhǔn)確稱量奇亞籽細(xì)粉2.00 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精確加入80%的乙醇溶液20.00 mL，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%乙醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，離心，取上清液，過濾，濾液置棕色量瓶中，即得樣品溶液，在325 nm處測定其吸光度值，得出咖啡酸濃度。

（3）奇亞籽中咖啡酸含量的計算方法咖啡酸提取量（mg?g-1）=×/×100

為咖啡酸質(zhì)量濃度（mg?mL-1）；為提取液體積（mL）；為奇亞籽質(zhì)量（g）。

（4）奇亞籽中咖啡酸提取單因素試驗設(shè)計以咖啡酸提取量為評價指標(biāo)，研究不同乙醇濃度、提取溫度、提取時間及料液比對奇亞籽中咖啡酸提取量的影響。每個水平設(shè)置3次重復(fù)。

（5）奇亞籽中咖啡酸提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用Design Expert軟件Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計[11,12]，對奇亞籽中咖啡酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)提取工藝。

表 1 響應(yīng)面試驗因子水平表

1.3.2 咖啡酸抗氧化性測定（1）咖啡酸DPPH?清除作用測定取不同質(zhì)量濃度樣品溶液4.0 mL于試管中，依次加入2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液，25 ℃水浴中反應(yīng)20 min，在517 nm處測定吸光度(Ai)。以蒸餾水做空白。以相同濃度VC作對比。每個濃度設(shè)置3次重復(fù)。

常用者為頭孢克洛（希刻勞）、頭孢呋辛，對革蘭陽性球菌的活性與第一代相仿或略差，對部分革蘭陰性桿菌亦具有抗菌活性。

清除率%=[1-(1-2)/3]×100%

1：4.0 mL樣液+2.0 mL DPPH對應(yīng)吸光度值；2：4.0 mL樣液+2.0 mL 95％的乙醇對應(yīng)吸光度值；3：4.0 mL蒸餾水+2.0 mL DPPH對應(yīng)吸光度值。

（2）咖啡酸?OH清除作用測定根據(jù)Fenton反應(yīng)體系模型，在反應(yīng)體系中加入具有清除?OH的物質(zhì)，與水楊酸競爭?OH，使有色物質(zhì)生成量減少。在相同體積反應(yīng)體系中加入不同濃度的奇亞籽咖啡酸溶液，用蒸餾水做空白，在510 nm處測定吸光度，計算出不同濃度奇亞籽咖啡酸清除?OH的能力。以相同濃度VC作對比。每個濃度設(shè)置3次重復(fù)。

清除率/%=[1-(1-2)/3]×100%

1：0.5 mL水楊酸-乙醇+1.0 mL樣液+0.5 mL Fe2SO4++5.0 mL H2O2對應(yīng)吸光度值；2：0.5 mL水楊酸-乙醇+1.0 mL樣液+0.5 mL蒸餾水+5.0 mL H2O2對應(yīng)吸光度值；3：0.5 mL水楊酸-乙醇+1.0 mL蒸餾水+0.5 mL Fe2SO4+5.0 mL H2O2對應(yīng)吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

以咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程為=0.9336-0.0013，2=0.9997。結(jié)果表明，咖啡酸的濃度在0.2～1.0 mg?mL-1范圍內(nèi)與所測得的吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇溶液濃度對奇亞籽咖啡酸提取量的影響如圖1所示，隨著乙醇溶液濃度逐漸增加，溶劑極性逐漸降低，物質(zhì)間氫鍵更容易被破壞，使得咖啡酸提取量隨著乙醇溶液濃度的增大而增加，在85%時提取效果最好。但隨著乙醇溶液濃度繼續(xù)增大，由于一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分溶出，與咖啡酸形成競爭作用，從而導(dǎo)致乙醇溶液濃度在85%～95%范圍內(nèi)呈下降趨勢。因此咖啡酸適宜提取乙醇溶液濃度為85%。

圖 1 乙醇濃度對咖啡酸提取量影響

2.2.2 提取溫度對奇亞籽咖啡酸提取量的影響如圖2所示，溫度升高有助于提高底物相溶性，并改善傳質(zhì)，從而使咖啡酸溶解度變大，因此咖啡酸提取量隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)增加趨勢，且在60 ℃時達(dá)到最大值。若溫度繼續(xù)升高，由于咖啡酸中大量的羧基、雙鍵和酚羥基在長時間高溫下易分解、氧化和異構(gòu)化，使得咖啡酸提取量逐漸下降。因此咖啡酸適宜提取溫度為60 ℃。

圖 2 提取溫度對咖啡酸提取量的影響

2.2.3 提取時間對奇亞籽咖啡酸提取量的影響如圖3所示，在超聲波和熱效應(yīng)的綜合作用下可加快細(xì)胞壁的破裂，使得咖啡酸與溶劑充分接觸，咖啡酸提取量在20～25 min提取時間范圍內(nèi)隨著時間的延長而增加，在25 min時達(dá)到最高值；但長時間超聲處理，隨著響應(yīng)的反轉(zhuǎn)，空化效應(yīng)的削弱或消失以及咖啡酸的氧化分解，使得咖啡酸提取量呈下降趨勢。因此咖啡酸適宜提取時間為25 min。

2.2.4 料液比對奇亞籽咖啡酸提取量的影響

圖 3 提取時間對咖啡酸提取量的影響

圖 4 料液比對咖啡酸提取量的影響

如圖4所示，料液比較小時，分子擴(kuò)散速度慢，隨著料液比的增加，分子擴(kuò)散速度加快，咖啡酸提取量呈現(xiàn)增加趨勢，并在1:20時達(dá)到最高。當(dāng)達(dá)到傳質(zhì)平衡，即使溶劑用量繼續(xù)增加，咖啡酸提取量也基本不變。考慮到實際生產(chǎn)過程中的成本問題，確定咖啡酸適宜提取料液比為1:20。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

表 2 響應(yīng)面分析試驗方案與結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計，對奇亞籽中咖啡酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果見表2。以咖啡酸提取量為響應(yīng)值，應(yīng)用Design Expert軟件進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到回歸模型參數(shù)和方差分析，結(jié)果如表3所示，得到多元二次回歸方程：咖啡酸提取量=655.95-1.66+1.23+1.04+0.34-0.015+0.053+0.060-0.075-0.028+0.013-2.662-2.762-2.132-2.912。

表 3 回歸方程各項的方差分析

注：*:<0.05,**:<0.01

由表3可知，回歸模型的<0.0001，表明超聲輔助乙醇法提取咖啡酸提取量與四個因素之間的回歸方程極顯著。模型失擬項>0.05，不顯著，說明該單因素試驗結(jié)果和數(shù)學(xué)模型模擬良好，可以利用該方程確定奇亞籽中咖啡酸的提取工藝。根據(jù)值和值可以看出，各因素對咖啡酸提取量的影響大小依次為：乙醇濃度>提取溫度>提取時間>料液比。一次項及二次項的值均小于0.001，達(dá)到極為顯著水平，表明這些因素對咖啡酸提取量的影響極大，且考察因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。根據(jù)回歸方程，做出響應(yīng)面圖和等高線圖，結(jié)果見圖5。

通過軟件Design-Expert7.0求解方程，得到咖啡酸提取的最佳工藝為：乙醇濃度82%、提取時間26 min、提取溫度62 ℃、料液比1:20，此時咖啡酸提取量為656.475 mg?g-1。

2.4 咖啡酸抗氧化性研究

2.4.1 奇亞籽咖啡酸對DPPH?清除率的影響由圖6可知，隨著質(zhì)量濃度的變大，咖啡酸對DPPH?的清除率呈線性增加，且均高于對照品VC，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.25 mg?mL-1時，咖啡酸的清除率為69.18%，而VC的清除率為49.24%。

圖 6 咖啡酸對DPPH?清除率影響

2.4.2 奇亞籽咖啡酸對?OH清除率的影響

圖 7 咖啡酸對羥基自由基清除率影響

由圖7可知，咖啡酸對羥基自由基有較好的抑制作用，清除率隨咖啡酸質(zhì)量濃度的增大而升高，呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，清除能力高于對照品VC，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.25 mg?mL-1時，咖啡酸的清除率為75.32%，而VC的清除率為64.26%，咖啡酸抗氧化能力更強(qiáng)。

3 結(jié)論

（1）經(jīng)過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗得到奇亞籽中咖啡酸的最佳提取工藝為乙醇濃度82%、提取時間26 min、提取溫度62 ℃、料液比1:20，此時咖啡酸提取量為656.475 mg?g-1；

（2）對在最優(yōu)提取條件下獲得的咖啡酸進(jìn)行抗氧化性測定表明，咖啡酸對DPPH自由基和羥基自由基清除能力隨著咖啡酸濃度的增加而提高，清除能力高于對照品VC，具有較強(qiáng)的抗氧化性。

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Caffeic Acid Extracted from Chia Seeds by the Response Surface Method Optimized with Ultrasonic-assisted and Its Antioxidant Activity

HOU Xiao-lin, XIANG Li-xuan, LI Ming-zhu*, FENG Jin-xiao

266300,

Caffeic acid is a natural antioxidant that is widely used in cosmetics and medicine. As a safe and effective natural product, caffeic acid has a variety of biological activities, and can also be used as a food additive in the food field in the future. Caffeic acid was extracted from Chia seeds by ultrasonic assisted ethanol method. The extraction process of caffeic acid was optimized by single factor test and response surface optimization test, and the antioxidant activity of caffeic acid was studied. The results showed that when the ethanol concentration was 82%, the extraction time was 26 min, the extraction temperature was 62℃ and the solid-liquid ratio was 1:20 (g?mL-1), the extraction amount of caffeic acid from Chia seeds was 656.475 mg?g-1. The scavenging ability of caffeic acid on DPPH radical and hydroxyl radical increased with the increase of the concentration of caffeic acid, and the scavenging ability was higher than that of the control substance VC. When the mass concentration reached 0.25 mg?mL-1, the highest scavenging rates were 69.18% and 75.32%, respectively, indicating that caffeic acid had strong antioxidant ability.

Chia seed; caffeic acid; antioxidant activities

TS209

A

1000-2324(2022)06-0906-07

2022-02-12

2022-03-04

青島工學(xué)院科研計劃項目(2022KYJH002).

侯笑林(1983-),女,碩士研究生,研究方向:天然產(chǎn)物活性成分提取分離研究. E-mail:190834051@qq.com

Author for correspondence. E-mail:limingzhu@qit.edu.cn

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.015