正交試驗法和響應面法優選蒲公英根甾醇提取

陳倩,王建芳,曹讓,楊培志

正交試驗法和響應面法優選蒲公英根甾醇提取

陳倩,王建芳,曹讓,楊培志*

西北農林科技大學草業與草原學院, 陜西 楊凌 712100

優化超聲波浸提蒲公英根甾醇的工藝條件。試驗控制1.00 g樣品用20 mL乙醇在超聲波清洗機里進行浸提，設計正交試驗和響應面試驗研究甾醇提取率隨著乙醇濃度、超聲提取時間、超聲提取溫度三個因素水平變化而變化的規律。正交優化分析得出最佳提取工藝下，能提出甾醇含量為46.01 mg/g，此時乙醇濃度為80%，提取時間為20 min，提取溫度為60 ℃。響應面分析結果為乙醇濃度87.42%、提取時間10.83 min、提取溫度59.97 ℃，這時每克蒲公英根提取甾醇的含量最高為67.26 mg。該結果表明響應面法工藝條件下得到的蒲公英根甾醇提取率高于正交試驗所得。

蒲公英; 甾醇; 化合物分離與提取

蒲公英（Hand.-Mazz）是一種多年生草本植物，該植株含有黃酮類、酚酸類、甾醇類和多糖類等有效物質，具有豐富的藥理活性，整株皆可入藥。其藥理功效有抑菌消炎、調節血糖、抗衰老、增強免疫力、抑制腫瘤等，除此之外，蒲公英還富含蛋白質、脂肪酸、氨基酸、維生素及微量元素，是一種藥食兼用的植物[1-4]。蒲公英甾醇具有抗高膽固醇和抗氧化[5]、抗炎[6,7]、抗菌[8]、調節免疫[9]、抑制癌細胞[10]等多種藥理功效[10-14]。此外，甾醇在食品、保健品、化妝品等各個不同的鄰域均有一定的應用,故本試驗研究甾醇的提取工藝具有重要的實際意義[15]。近年來對植物甾醇的提取研究也越來越多，但對蒲公英植物甾醇提取的研究較為少見，在蒲公英甾醇的提取工藝上的優化研究更是少之又少，由于人們對蒲公英價值的逐步開發，蒲公英種植技術也逐漸成熟,優化蒲公英甾醇提取工藝的研究可以得到一種更高效的提取方法，從而有利于之后相關產品的研究開發及應用[16]。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

供試材料：蒲公英根采于西北農林科技大學草業與草原學院試驗地（自2018年7月種植，種植兩年半后于春季生長期內采摘得到），在65 ℃下烘干粉碎后過60目篩裝袋以備后續使用。

試劑：甾醇標品（HPLC≥98%）購于索萊寶科技有限公司；FeCl3?6H2O、濃硫酸、磷酸、無水乙醇（均為AR）等試劑均從西北農林科技大學草業與草原學院實驗室獲取。

1.2 儀器與設備

分光光度計（V-1000），上海翱藝公司、超聲波清洗機（SB25-12DT），寧波新芝生物科技公司、電子分析天平（PX224ZH/E），奧豪斯儀器（常州）公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備精確稱取樣品1.00 g放于50 mL的具塞離心管中，加入一定濃度的乙醇溶劑20 mL，設置超聲波清洗機的溫度和時間一定，將取出的樣品趁熱過濾到50 mL容量瓶中，濾液和濾渣用相應濃度的乙醇溶劑清洗3-5次后定容搖勻得到待測液，試驗設置3個重復進行測定。

1.3.2 待測液中甾醇含量測定精確稱取甾醇標準樣品3500 μg溶解于無水乙醇溶劑，再定容于25 mL容量瓶中，此時標準溶液的濃度為140 μg/mL，甾醇含量采用硫磷鐵顯色劑法測定[17]。由此可得：=0.0044-0.0222，2=0.9929。此時1.00 g蒲公英根樣品中甾醇含量（mg）按下式計算：

表示樣品總甾醇含量（mg/g），表示由標準曲線所得試樣濃度（μg/mL），表示試樣體積（mL），表示稀釋倍數，表示試樣重量（g）

1.3.3 正交試驗設計根據試驗開始前期所得到的單因素試驗結果，選取提取時間、提取溫度和乙醇濃度3個主要影響因素，采用正交試驗的方法，設置3因素3水平正交表L9(34)進行試驗，其中料液比為1：20 g/mL，提取次數為1次，各因素和水平條件如下[18]。

表 1 L9（34）正交試驗因素水平

1.3.4 響應面試驗設計將各個因素水平按照如下表格里的因素水平用Design-expert12軟件進行Box-Behnken模型試驗，按響應面法共設計了17組試驗，對乙醇濃度、超聲提取時間和提取溫度3個因素進行改進，以蒲公英根甾醇提取率為響應面，確定最優提取條件[19]。

表 2 響應面因素水平

1.3.5 數據分析處理采用Excel對數據進行記錄分析，通過SPSSAU設計正交試驗并得出處理結果,用Design-expert12軟件進行響應面設計及分析。

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果分析

由下表3蒲公英根甾醇正交試驗方差分析結果可得，本試驗選取的三個因素都對蒲公英根甾醇提取產生極大影響，將影響的主次分別排序如下：乙醇濃度(%)>提取溫度(℃)>提取時間(min)，即A>C>B（按甾醇提取率比較）。正交方差分析得出甾醇提取的正交試驗最佳方案為A2B2C3，即乙醇濃度80%，溫度60 ℃，時間20 min。在該條件下，每克蒲公英根中可以提出46.01 mg的甾醇。利用三因素方差分析方法研究水平A、B、C對甾醇提取的影響，由下表4可知，因素A、Ｂ、Ｃ對蒲公英根甾醇的提取均可產生極顯著性影響。

表 3 正交試驗結果

表 4 正交方差分析結果

2.2 響應面法試驗結果分析

以蒲公英根甾醇提取率作為試驗分析的響應值，用Design-expert12軟件模擬甾醇提取模型，得到回歸方程：=57.75+1.28-0.5212+10.85+0.9875+5.90-3.34-6.102-1.142-5.522（2=0.8545）。對蒲公英根甾醇提取做響應面方差分析如下，該次模擬出的模型中=4.57（0.010.05），此結果表明響應面分析得到的二次回歸方程具有顯著性。該模型中失擬項=1.85，=0.2788>0.05，證明失擬項不顯著，2=0.8545>0.80,表明響應值85.45%的變化都能夠被該模型預測出來，變異系數（CV）=11.51（%），表明用響應面法分析蒲公英根中甾醇提取率并建立模型與預測具有可行性，模擬出的二次回歸方程中所有的二次項系數值均為小于零，說明該模型存在頂點（最大值），頂點表示最大的甾醇提取值，由下圖1也可以相應得出響應值存在穩定的頂點。

表 5 響應面方差分析結果

由下圖1可以得出：通過Design-Expert12軟件預測出的甾醇的最優提取工藝為乙醇濃度為87.42%，提取時間10.83 min，提取溫度59.97 ℃，此時每克蒲公英根中可提取出67.26 mg的甾醇。

圖 1 不同因素下的三維曲面

3 討 論

正交試驗和響應面分析法是基于建立兩種不同的模型來對試驗水平進行分析的方法，正交試驗能得出不同因素不同水平之間的最佳組合，但其只能分析離散型的數據,范圍相對來說較小，且分析出的數據精度較低, 預測出的結果相對較差[20-24]。響應面法以數學模型構建二次回歸方程，該回歸方程精確度高，能夠合理預測出最佳的有效結果。與正交試驗相比，響應面分析法不僅能夠分析試驗設置的水平內的最佳組合，還能找出除試驗設置水平以外的其它最佳組合，綜合比較之下得出響應面法優化出的甾醇最優提取工藝較正交試驗得出的結果更優[25-28]。本試驗可以得出蒲公英甾醇的最優提取方案，但未涉及甾醇的純化及應用方面。試驗采用超聲波法對蒲公英根甾醇進行提取，與傳統的醇提、回流相比，可以縮短甾醇的提取時間，除此之外，超聲法提取甾醇操作簡便可行、在試驗中提取料液雜質成分較低、提取出的有效物質比較容易分離和純化,且該方法提取工藝簡便，可以大量普及使用[29]。超聲波提取法由于其具有的提取高效、快速、節能的優點，在行業內的發展前景非常廣闊。

4 結 論

綜上所述，用濃度80%的乙醇在60 ℃的超聲波清洗機中提取20 min，可得到正交試驗最佳結果，此時蒲公英根甾醇提取率為4.60%，即每克蒲公英根樣品中最高可提得甾醇含量為46.01 mg/g。響應面法分析蒲公英根甾醇提取數據可得：當乙醇濃度為87.42%，提取時間10.83 min，提取溫度59.97 ℃時，蒲公英根甾醇模擬得到的提取率高于正交試驗模擬出的結果，此時的得到的最佳結果為6.73%，此時最高能提到甾醇含量為67.26 mg/g，即響應面分析得到的甾醇提取率比正交試驗得到的高2.13%。對模擬出來的結果進行驗證后發現得到的甾醇提取率為6.33%，與模型結果相似，差異不顯著，0.05。在具體實踐時應根據實際需要選擇相應的方法。

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Sterol Extracting fromRoot by the Optimal Orthogonal Test and Response Surface Methodology

CHEN Qian, WANG Jian-fang, CAO Rang, YANG Pei-zhi*

712100,

Optimization of process conditions for ultrasonic extraction ofroot sterols. Experimentally controlled 1.00 g samples were extracted with 20 mL of ethanol in an ultrasonic cleaner. Orthogonal and response surface tests were designed to investigate the pattern of sterol extraction rate with the changes in the levels of three factors: ethanol concentration, ultrasonic extraction time, and ultrasonic extraction temperature. The orthogonal optimization analysis concluded that under the best extraction process, the sterol content was 46.01 mg/g, and the ethanol concentration was 80%, the extraction time was 20 min, and the extraction temperature was 60 ℃. The results of the response surface analysis were 87.42% ethanol concentration, 10.83 min extraction time and 59.97 ℃ extraction temperature, and the highest sterol content of 67.26 mg per gram ofroot extracted. This result suggested that the sterol extraction rate ofroot obtained under the process conditions of response surface method was higher than that obtained from the orthogonal test.

Hand.-Mazz; Sterol; Compound isolation and extraction

S326

A

1000-2324(2022)06-0913-05

2022-07-10

2022-09-15

陳倩(1998-),女,碩士在讀,草種質與逆境生物學研究方向. E-mail:2938293578@qq.com

Author for correspondence. E-mail:yangpeizhi@126.com

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.016