四氫嘧啶生物合成與應用研究進展

孫曉康,張艷艷,張曉元,劉飛

四氫嘧啶生物合成與應用研究進展

孫曉康,張艷艷,張曉元,劉飛1*

山東省藥學科學院, 山東 濟南 250101

四氫嘧啶是一種保護微生物免受高鹽、高滲透壓和紫外線輻射等惡劣環境的環狀氨基酸衍生物。作為微生物重要的次級代謝產物，四氫嘧啶在生物保護、化妝品、臨床醫學、環境修復和新能源應用等領域具有廣闊的應用前景。本文綜述了四氫嘧啶生物合成途徑與降解途徑、生物合成方法、生物學功能及應用、分離純化工藝，并對四氫嘧啶開發和工業化應用進行展望。

四氫嘧啶; 生物合成; 研究進展

四氫嘧啶(1,4,5,6-四氫-2-甲基-4-嘧啶羧酸)是由好氧、化學異養和嗜鹽細菌在高滲透條件下合成與積累的一種相容性溶質，分子量142.16 Da，分子式C6H10N2O2（如圖1）。四氫嘧啶的分子結構攜帶多個羧基和環狀氨基，分子表面電荷分布密集，形成強烈的靜電勢，能使細胞內的游離水結構化，具有很強的水分子絡合能力。作為嗜鹽微生物最常見的相容性溶質，四氫嘧啶平衡細胞內外滲透壓、抵御高滲透壓的沖擊，在高溫高壓、冷凍干燥和輻射等逆境因素下，對細胞、蛋白質、酶和核酸的結構與功能起到保護作用。四氫嘧啶的保護作用可通過“優先排斥機制”解釋[1]，即四氫嘧啶不直接與水溶液中的大分子相互作用，而是被優先排除在蛋白質表面周圍的水化殼外，增加大分子的水化作用，從而防止其變性。因此，四氫嘧啶在生物保護、化妝品、臨床醫學、環境修復和新能源應用等領域具有廣闊的應用前景。

圖1 四氫嘧啶分子結構

由于日益嚴格的環保要求，促使國內外研究者通過綠色安全的生物技術生產四氫嘧啶成為重要的發展趨勢。本文綜述了四氫嘧啶的生物合成及應用研究，為天然活性成分四氫嘧啶的開發和應用提供參考。

1 四氫嘧啶生物合成途徑與降解途徑

四氫嘧啶的生物合成途徑屬于天冬氨酸的支路代謝途徑[2]（如圖2），L-天冬氨酸在天冬氨酸激酶(Ask)和L-天冬氨酸-β-半醛脫氫酶(Asd)的共同催化下生成L-天冬氨酸-β-半醛(ASA)。以ASA為底物，經過三步酶促反應合成四氫嘧啶。首先，通過2,4-二氨基丁酸氨基轉移酶(diaminobutyric acid aminoransferase, EctB)催化生成L-2,4-二氨基丁酸(L-2,4-diaminobutyrate, DABA)；其次，在2,4-二氨基丁酸乙酰基轉移酶(diaminobutyric acid acetyltransferase, EctA)的催化條件下，將DABA乙酰化生成N-乙酰-L-2,4-二氨基丁酸(N-acetyl-L-2,4-diaminobutyrate, ADABA)；最后，四氫嘧啶合成酶(ectoine synthase, EctC)催化ADABA發生環化縮合反應形成四氫嘧啶。

Schwibbert K等[3]在對DSM 2581T基因組分析的基礎上，首次描述四氫嘧啶的降解途徑。四氫嘧啶在四氫嘧啶水解酶(DoeA)、N-乙酰-L-2,4-二氨基丁酸脫乙酰酶(DoeB)、L-2,4-二氨基丁酸轉氨酶(DoeD)和天冬氨酸半醛脫氫酶(DoeC)的共同催化反應中轉化為L-天冬氨酸。

圖2 四氫嘧啶生物合成途徑和降解途徑

2 四氫嘧啶生物合成方法

目前，四氫嘧啶傳統的工業化生產主要采用“細菌擠奶”工藝進行制備。嗜鹽菌在高滲透壓誘導條件下迅速合成四氫嘧啶，然后在低滲透壓沖擊條件下釋放細胞內的四氫嘧啶，四氫嘧啶在該過程反復循環的合成與釋放，從而達到細胞內外滲透壓平衡。

Sauer T等[4]首次利用“細菌擠奶”技術生產四氫嘧啶，使用鹽單胞菌DSM 142在高鹽培養基（15% NaCl）中發酵，然后收集菌體轉入低鹽培養基（3% NaCl）進行沖擊并迅速釋放胞內的四氫嘧啶，之后將細胞重新轉移至高鹽培養基誘導合成四氫嘧啶，然后再次低滲沖擊，并釋放四氫嘧啶。經過9次重復循環后，四氫嘧啶的最終產量為3.3 g/L。姚倩倩[5]曾報道W2菌株能夠耐受11輪高/低滲透壓反復沖擊，且合成量與釋放量無明顯下降，經過12輪沖擊后，四氫嘧啶的產量有所降低，四氫嘧啶的釋放量達到5.21 g/L。

然而，生物合成四氫嘧啶的高鹽培養基不僅對發酵罐造成腐蝕，而且也會增加下游純化的難度和廢水處理的成本。另外，由于高滲透壓和低滲透壓的反復沖擊，菌體的生長速度減慢，從而降低四氫嘧啶的產量。針對“細菌擠奶”工藝的不足，國內外學者通過以下幾個方面進行改造：①篩選高產原始菌株，優化發酵工藝條件，在低鹽濃度下實現四氫嘧啶的高產；②傳統誘變育種；③構建基因工程菌株，利用轉基因非嗜鹽菌（大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌）異源合成四氫嘧啶，避免生產四氫嘧啶對高鹽條件依賴，簡化下游產品純化過程，提高四氫嘧啶產量。

2.1 篩選高產原始菌株

作為細胞內產物，四氫嘧啶的產量與生物總量有關。為了獲得高生產率，需要優化培養條件。Zhang LH等[6]利用DSM 5928在含0.5 mol/L NaCl的10 L發酵罐內分批發酵，四氫嘧啶的產量達到6.9 g/L，表明鹽單胞菌DSM 5928在較低NaCl濃度下有效合成四氫嘧啶。Lang YJ等[7]優化發酵工藝，在10 L發酵罐中以0.5 mol/L NaCl、80 g/L谷氨酸鈉和pH7.0分批發酵DSM 5928，四氫嘧啶的最高產量達8.21 g/L。鹽單胞菌BCRC 17875[8]也被用于四氫嘧啶生產，通過優化攪拌速度和培養基組成，最終以谷氨酸鈉為底物獲得13.96 g/L四氫嘧啶，產率為0.29 g/L/h。

2.2 傳統誘變育種

在最佳培養基和培養條件下，采用人工誘變使鹽單胞菌基因突變，改變其遺傳結構和功能，篩選出產量高、性能優良的突變菌株。目前，紫外誘變是一種應用較多的人工誘變技術。

田磊[9]采用9輪循環紫外誘變鹽單胞菌sp.XH26，發酵培養40 d后，四氫嘧啶的產量較原始菌株提高了2倍以上，均表現出良好的穩定性，其中，突變菌HU09－32的產量高達1351.09 mg/L±17.69 mg/L，是原始菌株的2.9倍。王冠鳳等[10]采用紫外和亞硝基胍相結合的方法誘變海神鹽單胞菌BAA-805，經篩選獲得突變菌株UN-2，通過補料分批發酵制備四氫嘧啶，與原始菌株對比，四氫嘧啶的產率提高了53.8%。

2.3 構建基因工程菌株

近年來，為了滿足日益增長的商業需求，研究者通過合成生物學消除基因調控，人工控制基因表達，以典型工業菌株(如大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌)作為底盤細胞，成功地實現了低鹽環境下異源高效生產四氫嘧啶，為下一代工業生物技術提供理論基礎。

2.3.1四氫嘧啶在大腸桿菌中的異源合成由于大腸桿菌生長速度快，產量高，具有良好的遺傳背景，可獲得多功能質粒載體，易于擴大生產規模，因此常被用作異源生物轉化的載體菌株。

He YZ等[11]將伸長鹽單胞菌的四氫嘧啶基因成功導入大腸桿菌BW25113中，在阿拉伯糖誘導啟動子的作用下獲得異源合成四氫嘧啶的大腸桿菌重組菌株。以天門冬氨酸和甘油為直接底物的全細胞生物催化工藝中，24 h內可生成25.1 g/L的四氫嘧啶，經過多輪生物轉化，最終四氫嘧啶的產量高達63.4 g/L。該技術為四氫嘧啶的生物合成提供了一種可行的方法，具有大規模工業化生產的潛力。Ning YK等[12]引入的基因簇，敲除內源基因和，利用Ptrc取代基因的啟動子，構建一株以大腸桿菌W3110為基礎無需添加天冬氨酸的產四氫嘧啶菌株。發酵培養30 h后，四氫嘧啶終產量為25.1 g/L。然而，這些關鍵基因的缺失損害了細胞的生長，導致細菌活力降低。

2021年Wang Y等[13]在無關鍵基因缺失的情況下，構建一株以大腸桿菌BL21 (DE3)為宿主高效生物合成四氫嘧啶的重組菌株。通過質粒將的基因簇導入不同的大腸桿菌菌株，利用核糖體結合位點（RBS）序列組合優化對異源基因改造，進一步組合過表達谷氨酸棒桿菌天門冬氨酸激酶突變體(G1A, C932T)和天門冬氨酸半醛脫氫酶以增加前體的供應后，在搖瓶培養中四氫嘧啶產量從0.2 g/L增加到5.5 g/L，采用補料分批發酵，以葡萄糖為唯一碳源，通過合理代謝調控與精準發酵條件控制，四氫嘧啶的終產量增加至60.7 g/L。與四氫嘧啶原始菌株相比，重組菌株具備強適應度、繁殖速度快、高生產力及不易發生菌株退化等優點。

前期雖然可以通過微生物工程菌株發酵生產四氫嘧啶，但仍存在葡萄糖轉化率和四氫嘧啶生產效率較低的問題。Zhang H等[14]首先通過引入基因簇并消除賴氨酸合成分支和副產物代謝途徑，利用代謝工程技術構建二株高效重組大腸桿菌ET08和ET11。然后，通過優化營養元素和分析轉錄水平得出，硫酸銨作為最佳氨基供體有效促進四氫嘧啶的合成。隨后，優化和的拷貝數來提高四氫嘧啶的產量，充足的EctB為后續的生物合成步驟形成強大的驅動力，重組大腸桿菌ET11 (=1:2:1)搖瓶發酵四氫嘧啶的產量提高至12.9 g/L。當氨基作為供體時，采用分批補料發酵，ET11獲得四氫嘧啶的產量高達53.2 g/L。與以往的研究相比，全細胞催化在底物產率上似乎有一定的優勢，但需要額外添加甘油和天冬氨酸，導致額外的底物和細胞成本較高。因此，該技術為開發高產四氫嘧啶的生產工藝提供了理論基礎，也可用于生產其他高價值氨基酸衍生物。

2.3.2四氫嘧啶在谷氨酸棒狀桿菌中的異源合成谷氨酸棒狀桿菌（，）是異源生產四氫嘧啶的理想宿主，在生產賴氨酸和谷氨酸等氨基酸方面有著悠久歷史。由于賴氨酸和四氫嘧啶生物合成共用ASA作為前體，因此賴氨酸生產菌株可以轉化為生產四氫嘧啶的宿主。大量ASA前體化合物可通過過表達反饋抑制天冬氨酸激酶用于生物合成四氫嘧啶和賴氨酸。此外，缺乏大腸桿菌的降解途徑，從而避免四氫嘧啶消耗和副產物形成。

由于產賴氨酸菌株LYS-1表達一種抗反饋抑制的天冬氨酸激酶(LysCT311I)，可以合成大量的ASA，是理想四氫嘧啶生物合成菌株。Becker J等[15]利用系統代謝工程，通過啟動子表達控制下整合密碼子優化合成基因簇，進一步改造堿性谷氨酸棒狀桿菌菌株的基因組，并對天冬氨酸激酶進行突變，保證ASA的充足供應。選擇編碼二氨基庚二酸脫氫酶的基因作為整合區，降低碳通量，該基因在氨水平較高時，將大部分代謝通量轉移到賴氨酸生物合成途徑的脫氫酶分支。為進一步阻止賴氨酸產生，敲除編碼賴氨酸的基因，阻斷賴氨酸分泌，在低鹽(0.03 M鹽)條件下培養工程菌株ECT-2，最終積累4.5 g/L四氫嘧啶，產率為0.28 g/L/h。Pérez-García F等[16]報道異源表達DM1729分泌四氫嘧啶的生物合成途徑。通過刪除調節基因和乳酸脫氫酶基因以改善葡萄糖代謝，低鹽(0.01 M鹽)補料分批發酵工程菌株Ecto5 (DM1729ΔsugRΔldhA)，最終獲得四氫嘧啶產量為22 g/L，產率0.32 g/L/h。

Gie?elmann G等[17]利用組合質粒文庫，對谷氨酸棒狀桿菌進行工程改造，使其在低鹽條件下通過轉錄平衡異源生產四氫嘧啶。首先，刪除基因以阻斷賴氨酸的分泌。其次，采用轉錄平衡策略，促使高產的四氫嘧啶。與之前使用一個啟動子控制基因表達的策略不同，該研究使用19個合成啟動子和3個連接子元素，建立包含185,193個突變體的表達文庫，協調和的共表達。最后，通過高通量篩選獲得谷氨酰胺opt在0.03 M鹽濃度發酵56 h，積累65 g/L四氫嘧啶，產率為1.16 g/L/h，比之前報道的重組菌opt的效價高3倍。Jiang A等[18]利用代謝工程和插入式阻遏文庫策略，在谷氨酸棒狀桿菌中實現了四氫嘧啶的高效生產。首先，將的簇引入K02；其次，對代謝工程進一步優化，包括刪除競爭途徑(敲除和)和糖酵解抑制因子(敲除)，以及增強前體供應(過表達Ecasd和CglysCS301Y)。最終，設計兩個阻遏文庫平衡代謝通量，以提高四氫嘧啶產量。最佳菌株CB5L6在5 L生物反應器中補料分批發酵的產量為45.52 g/L，是原菌株的1.79倍。首次利用plug-in阻遏文庫對谷氨酸棒狀桿菌進行代謝產物構建，為構建微生物細胞工廠提供理論指導。

3 四氫嘧啶的分離提取工藝

諸多研究涉及提高四氫嘧啶產量的方法，然而，關于大規模生產四氫嘧啶的下游工藝卻受到很少關注。四氫嘧啶存在嗜鹽菌胞內，必須通過粉碎菌體或浸泡溶脹的方式釋放四氫嘧啶，隨之破碎產生的蛋白等雜質增加了分離純化的難度。近年來，大多通過膜技術過濾、活性炭脫色、電滲析脫鹽、離子交換樹脂吸附、濃縮醇沉、冷凍結晶、干燥等步驟來獲取四氫嘧啶純品。

謝希賢等[19]采用雙濾膜（微濾膜和超濾膜）去除發酵液中的菌體、部分蛋白和色素，使用陽離子交換樹脂吸附，再經氨水洗脫、活性炭脫色、濃縮醇沉，重結晶及干燥獲得四氫嘧啶晶體。初期利用膜技術雖然能耗低，但膜孔易被菌體和蛋白阻塞，縮短膜的使用壽命，經濟效益降低。譚琳等[20]為實現簡易的純化工藝，獲取高收率、高純度的四氫嘧啶成品，通過構建重組表達載體導入大腸桿菌，利用L-阿拉伯糖誘導表達并進行全細胞催化生產四氫嘧啶，經聚酰胺吸附純化，濃縮醇沉，重結晶及干燥得到高高純度的四氫嘧啶。

產品提取方法的類型對下游加工操作產生很大影響，Chen R等[21]利用陶瓷膜過濾、電滲析脫鹽，然后再由陽離子交換樹脂洗脫、粗產品萃取和三次精制，最后，從水中進一步結晶獲得四氫嘧啶純品。其中陽離子交換和粗產品萃取的平均回收率分別為95%和96%，而在過濾和脫鹽過程中分別存在19%和15%的損失率。結合三次精制母液獲得最終產品的總收率和純度平均分別為43%和98%以上。然而，影響生產效率的關鍵因素不是產量，而是提取粗產品所用的時間，該步驟整體花費24～72 h。為提高四氫嘧啶的結晶收率，李珍愛等[22]提出有機試劑溶析結晶四氫嘧啶濃縮液方案，分析了溶析劑、料液濃度、溶析劑的添加量及攪拌速率對收率的影響。結果表明，在300 r/min的攪拌速率中，6倍發酵液體積的丙酮溶析結晶獲得300 g/L四氫嘧啶，一次結晶收率高達94%以上，與降溫結晶相比，產率提高40%以上，最終重結晶及干燥后純度可達99%以上。

為實現大規模生產高純度和高產量的工業級四氫嘧啶，采用合成生物學方法構建相應的生產菌種，優化生產工藝、降低生產成本、提高合成效率，形成完整的工業技術方案。

4 四氫嘧啶生物學功能及應用

作為一種天然滲透壓補償性溶質，由于四氫嘧啶具有良好的耐受性和安全性，因此在生物保護、化妝品、臨床醫學、環境修復和新能源等領域，已被開發多種外用產品，具有廣泛的應用前景。

4.1 生物保護應用

四氫嘧啶通常不僅保持滲透活性，而且保護細胞、酶和小型水生無脊椎動物免受脫水、干燥、加熱和冷凍等惡劣環境脅迫。

4.1.1細胞保護四氫嘧啶與水分子緊密結合，被優先排除在水合物屏蔽之外，導致細胞膜流動性增強，從而有利于細胞應對極端條件，如高溫或低溫、有毒物質和滲透壓改變等。

不同類型的細胞在高溫作用下容易產生伴侶蛋白，如熱休克蛋白(Hsp)，可以修復錯誤折疊的肽段。四氫嘧啶在肽鏈生物合成過程中具有分子伴侶的作用，可以指導新生肽鏈按特定方式正確折疊，在治療與蛋白錯誤折疊相關疾病中發揮著重要作用。Buommino E等[23]報道，用四氫嘧啶孵育的熱應激角質形成細胞具有更高水平的Hsp70，并抑制促炎信號產生。四氫嘧啶是低溫保存的有效介質。Bissoyi A等[24]研究表明從人臍帶血中分離出來的單個核細胞的低溫保護培養基，其有效成分包括羥乙基淀粉、四氫嘧啶和輔酶Q10，單個核細胞存活率高達93%。Sun H等[25]報道，四氫嘧啶作為冷凍保護劑用于人內皮細胞系HPMEC-ST1.6R或間充質干細胞的冷凍保存，并在低溫中被用作有毒二甲基亞砜(DMSO)的替代品。

四氫嘧啶具有保護細胞防御某些有毒化合物的性能。Bownik A等[26]研究發現，四氫嘧啶預孵育毒素單體的細胞毒性比同時加入細胞懸液毒素單體的毒性要小，這表明四氫嘧啶阻礙毒素單體的展開，從而阻止了細胞膜跨膜孔的形成。

4.1.2穩定酶活性研究表明，四氫嘧啶增加維持水合作用的酶穩定性，從而降低蛋白質變性的敏感性[27]。然而，這種氨基酸衍生物并不直接與蛋白質表面相互作用，而是形成一個分子網，將水分子固定在大分子附近。此外，Roychoudhury A等[28]研究表明，四氫嘧啶可減少因溫度快速變化而引起的酶變性。不僅延長乳酸脫氫酶(LDH)和磷酸果糖激酶的活性，而且增加雙鏈DNA核糖核酸酶和聚合酶在高溫下的穩定性。

Kolp S[29]報道，四氫嘧啶保護大分子不受蛋白質水解劑的影響。例如，用四氫嘧啶處理過的抗體不易被胃蛋白酶降解。此外，四氫嘧啶可以抑制HIV的復制，也可穩定逆轉錄病毒載體，用于基因治療[30]。

4.1.3保護無脊椎動物早期研究發現四氫嘧啶通過抑制熱休克蛋白Hsp70、過氧化氫酶活性和NO自由基對大水蚤起保護作用[31]。此外，經四氫嘧啶處理的大水蚤比未處理的對照組更能抵抗消毒劑甲醛和過氧化氫。與單獨暴露于H2O2的甲殼類動物相比，暴露于H2O2+ECT組合的水蚤顯示死亡率降低，心率和胸肢活動的抑制減弱，GSH/GSSG比率降低較少，CAT活性和NOx水平的刺激較低。因此，四氫嘧啶可以作為不同形式脅迫敏感食用物種運輸的穩定劑。

4.2 化妝品應用

四氫嘧啶不僅是細胞中主要的滲透壓調節劑，而且可以保護蛋白質、細胞膜和人體組織不受過敏原、紫外線、熱和干燥的影響，因此已成為化妝品的理想成分。四氫嘧啶被廣泛用于保濕面霜中，可達持久保濕，防止表皮脫水，其效果優于磷脂酰膽堿。由于其對B16-F0和A2058黑色素瘤細胞系的黑色素合成以及細胞酪氨酸酶活性有抑制作用，因此，在相對較低濃度(500 μmol/L)下[32]，四氫嘧啶也可用作增白劑。四氫嘧啶還能緩解皮膚炎癥，目前被推薦用于治療中度特異性皮炎[33]。

Grether-Beck S等[34]報道，四氫嘧啶降低人類角質形成細胞中UVA誘導的神經酰胺信號應答，保護成纖維細胞的線粒體DNA免受UVA破壞，刺激熱休克蛋白的產生，從而抑制促炎細胞因子的釋放，保護上皮細胞的細胞膜，并防止皮膚受到紫外線的傷害，以達到去皺抗衰的效果。

總之，在化妝品方面，四氫嘧啶具有長效保濕、抗氧化、抗炎、美白以及減少紫外線照射引起的皮膚雀斑或曬斑等作用，其應用逐漸擴展至防曬、保濕、潔面、彩妝、眼部和毛發護理等領域。

4.3 臨床醫學應用

除了作為滲透保護劑、生物功能穩定劑和皮膚保護劑外，四氫嘧啶也是潛在疾病的治療藥物，包括抗炎、抑制神經退行性疾病等臨床醫學應用。

四氫嘧啶可有效緩解炎癥，臨床研究[35,36]表明四氫嘧啶通過抑制納米顆粒觸發的細胞信號傳導和IL-8誘導，顯著降低納米顆粒誘導的肺部中性粒細胞炎癥及繼發性疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺病和冠心病等。四氫嘧啶還可保護回腸黏膜免受缺血和再灌注損傷，這是小腸移植術后常見的并發癥。炎癥反應的緩解與改善腸道屏障和減少細胞因子的產生有關。使用四氫嘧啶作為抗組胺藥對過敏患者進行附加治療，可加速傷口愈合，緩解過敏癥狀。

最近研究表明[37,38]，四氫嘧啶抗炎治療被應用于不同劑型，包括含四氫嘧啶的乳霜、鼻噴霧劑、滴眼液和咽喉噴霧劑，分別用于治療特異性皮炎、過敏性鼻炎和鼻竇炎、干眼癥和急性咽炎。以四氫嘧啶為基礎的不同劑型在臨床中表現出良好的耐受性和安全性，對于希望避免與藥物治療相關局部反應和副作用的炎癥患者，它可能是一種可行的替代品。

臨床常見的病理過程如淀粉樣蛋白的形成和聚集可誘發神經退行性疾病。Kanapathipillai M等[39]報道，四氫嘧啶可以干擾疏水作用和π-π鍵的相互作用，抑制淀粉樣蛋白形成，延緩阿爾茨海默病發展。因此，四氫嘧啶在臨床上用于預防阿爾茨海默病、傳染性海綿狀腦病和帕金森氏病等神經退行性疾病。

4.4 環境修復應用

土壤鹽漬化是造成全球農業用地流失和作物產量降低的主要環境因素之一。高鹽脅迫主要通過損害光合活性和光合產物的分配來影響植物生長。有關研究表明將四氫嘧啶合成基因簇克隆至煙草細胞中，成功提高鹽堿地植物的存活率[40]。四氫嘧啶主要通過兩種途徑增強煙草的耐鹽性。首先，通過維持根部在高鹽環境成活，發揮持續吸收水分及運輸的功能；其次，通過增加蒸騰作用提高葉片氮源供應，從而提高光合作用效率。Moghaieb R等[41]構建轉基因番茄，在鹽脅迫條件下，轉基因番茄的過氧化物酶活性提高，丙二醛濃度降低，轉基因番茄根部的四氫嘧啶合成被促進，導致根部光合產物的庫活性加速，細胞膜穩定性增強，光合速率增加。

4.5 新能源應用

微生物燃料電池（MFC）是一種通過微生物作為催化劑氧化有機或無機物質發電的裝置。該技術可以將廢水回收、污泥減量和良性廢水的產生結合起來，是一種新型的廢水處理方法。Zeng F等[42]報道，在30 g/L NaCl環境下，將四氫嘧啶直接添加到雙極單室MFC的發電基質中，可以提高陽極微生物的耐鹽性和發電能力。結果顯示TP-MFC在穩定期產生的平均電壓為439.3 mV，比普通MFC產生的電壓高55.2%。此外，TP-MFC在72 h的脫氮率為63.4%，比普通MFC提高了38.4%。由此可見，四氫嘧啶賦予高鹽環境中微生物菌群的耐鹽性，從而對微生物燃料電池在高鹽有機廢水處理中的應用具有重要意義。

5 展 望

四氫嘧啶進入國內外市場引起較高的關注度，2020年全球四氫嘧啶市場銷售額達到了2000萬美元，預計未來將保持平穩增長的態勢，到2027年市場規模將接近3000萬美元，年復合增長率（CAGR）為6.6%，且價格高達1000美元/kg，市場前景非常廣闊。

由于四氫嘧啶的分子結構攜帶一個手性碳原子，限于化學合成法存在立體構型選擇性低、副產物多等缺點，使得下游純化過程更加困難，最終導致四氫嘧啶的產量和純度降低。然而使用生物法制備四氫嘧啶具有特異性高、綠色環保和工藝簡單等優點，可以實現工業化生產，利用微生物生產四氫嘧啶受到眾多關注。在最近幾十年中，為了滿足日益增長的商業規模生產需求，在分批發酵、連續發酵、補料分批發酵和細菌擠奶過程中對四氫嘧啶的高產率生產進行生物技術研究。相關研究主要集中于菌株優選和發酵工藝與條件的優化。諸如，傳統誘變育種存在的主要問題是有益突變體頻率較低，難以有效控制變異的方向和性質。因此提高誘變效率，快速鑒定并篩選突變體，探索定向誘變的途徑，成為目前課題研究的重要方向。

隨著功能基因組學和合成生物學的快速發展，在非嗜鹽底盤中導入和表達四氫嘧啶生產途徑獲得高產量，而合理調節嗜鹽底盤的通量是下一代四氫嘧啶工業生產的一個重要策略。盡管研究已證實轉基因大腸桿菌可以有效合成四氫嘧啶，但Dong Y等[43]報道負責四氫嘧啶吸收的脯氨酸運輸系統ProP和ProU可能有效地將四氫嘧啶泵出。然而，ProP和ProU缺陷突變體也可以泵出四氫嘧啶，表明這一過程中應該有其他的外排系統參與。此外，排除了大腸桿菌通過非特異性機械敏感通道排出四氫嘧啶的可能性。因此，大腸桿菌分泌四氫嘧啶的機制有待進一步研究，甚至有一些限制可能會阻礙大腸桿菌系統有效地使用過表達異源基因，如密碼子的偏頗使用、蛋白質的溶解度、mRNA的穩定性和二級結構。由于異源蛋白中稀有密碼子的存在而導致氨基酸取代或幀移突變，最終形成無效產物。因此，為了提高產量和避免傳統生物工藝的缺陷，對菌株改良和產生最佳的嗜鹽和非嗜鹽重組生產菌株仍需進一步的努力。

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Research Progress in Biosynthesis and Application of Ectoine

SUN Xiao-kang, ZHANG Yan-yan, ZHANG Xiao-yuan, LIU Fei1*

,250101,

Ectoine is a cyclic amino acid derivative that protects microorganisms from harsh environments such as high salt, high osmotic pressure and ultraviolet radiation. As an important secondary metabolite of microorganisms, Ectoine has broad application prospects in the fields of biological protection, cosmetics, clinical medicine, environmental remediation and new energy applications. In this paper, the synthesis and degradation pathway, biosynthesis method, biological function and application, separation and purification process of ectoine are reviewed, and the development and industrial application of ectoine are prospected.

Ectoine; biosynthesis; research progress

O611.61

A

1000-2324(2022)06-0976-08

2022-08-10

2022-09-07

山東省重大科技創新工程(2021ZDSYS07);濟南市高校院所創新團隊項目(2019GXRC038)

孫曉康(1994-),女,碩士研究生,工程師,主要從事生物藥物研究. E-mail:1774190401@qq.com

Author for correspondence.E-mail:liufei@sdaps.cn

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.028