2019—2020山東小麥區試品系55個基因的等位基因分布

李 瑋 張 敏 宋國琦 李玉蓮 高 潔 程敦公 李豪圣，* 李根英，*

（1 山東省農業科學院作物研究所/農業農村部黃淮北部小麥生物學與遺傳育種重點實驗室/小麥玉米國家工程實驗室，山東 濟南 250100；2 青島農業大學農學院，山東 青島 266109）

小麥（Triticum aestivumL.）是我國三大糧食作物之一，同時是我國北方最重要的口糧作物［1］。不斷培育高產優質的小麥品種是小麥生產的基礎，對增強種業競爭力，保障我國糧食安全具有十分重要的意義。山東是全國小麥生產第二大省，據山東統計年鑒數據顯示，2019年山東省小麥播種面積400.18 萬公頃，總產量255.29 萬噸［2］。優良品種是保障小麥生產的基礎，山東省小麥品種審定區域試驗代表了山東小麥育種的最新進展和育種方向。對區試品系進行分析，在了解山東小麥育種特點和變化基礎上，可以為品種改良提供參考。

區試參試品系常被育種家作為親本材料進行雜交組配，前人對區試品系的研究較多，對河北、河南、山東和四川4 個省份的75 份小麥區試品系和78 份國家冬小麥區試品系的抗條銹病鑒定結果表明，四川省區試品系條銹病抗性較好，其他區試品系相對較差［3-4］，可能與四川省條銹病自然發病較重，而北方省份自然發病較輕有關。對山東省和河南小麥區試品系的品質性狀進行研究，發現達到國家優質強筋標準的品系較少，主要限制指標是穩定時間［5-6］。王步云等［3］研究認為河北、河南、山東小麥區試品系的遺傳相似性較高；宋曉霞等［7］也認為黃淮南片小麥區試品系遺傳基礎狹窄；而高曉慧等［8］分析表明黃淮南片麥區78 個小麥品系遺傳距離變幅較大，可能與所選材料不同有關。對國家區試參試品系產量相關性狀研究表明，品系年際間產量變幅大，整體穩步增加，生育期和千粒重與產量關聯度最大［7，9-10］。以上研究主要集中在產量、品質、抗病性等表型性狀，對品系所攜帶的優異等位基因關注相對較少。

2016年Rasheed 等［11］發表了70 個小麥競爭性等位基因特異聚合酶鏈式反應（kompetitive allele specific polymerase chain reaction，KASP）功能標記，涉及小麥適應性、產量、品質和抗逆性等性狀，對之前小麥中已開發KASP 功能標記進行了系統總結。2019年Khalid等［12］報道小麥KASP 功能標記的數量已增加至124 個，為小麥功能基因的鑒定和育種奠定了基礎。隨后KASP 標記逐漸在我國開始應用。鄒景偉等［13］對120 份小麥品種（系）的株高等15 個基因進行了KASP標記檢測，認為對常規手段育成的高代品系進行KASP標記輔助選擇可作為一種重要的分子育種策略。單子龍等［14］、王志偉等［15］和Zhang 等［16］分別對河北、云南、寧夏的小麥品種（系）進行了KASP 標記檢測，結果表明不同基因的優異等位變異占比差異較大，明確了優異等位基因的載體材料，為各省小麥品種改良提供了參考。Zhao等［17］對來自全球的1 152份小麥材料的47個基因進行了KASP 標記分析，明確了已被育種選擇的36 個優異等位基因，促進了小麥分子育種發展。上述前人研究均主要關注小麥品種，但對區試品系的分析較少。

為了明確已知功能基因在區試品系中利用情況，并為親本選配和后代輔助選擇提供參考，本研究對2019—2020年山東省區試高產組和強筋組的品系進行64 個KASP 標記的分子檢測，旨在為利用分子標記輔助選擇，為促進小麥精準化育種，提高小麥育種效率奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為2019—2020年山東省小麥區域試驗參試品系，共計126 份（表1），其中高產組111 份（含對照品種濟麥22，高產區試品系編號前兩位為GQ），強筋專用組15 份（含對照品種濟南17，強筋區試品系編號前兩位為QQ）。上述材料均于2019年11月播種于山東省農業科學院濟南試驗基地。

表1 參試品系Table 1 Tested wheat lines

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取 采用簡化的高鹽低pH 法，試驗步驟參考文獻［18］。

1.2.2 KASP 標記檢測與分析 KASP 標記檢測反應體系、程序參考高潔等［18］的方法。KASP 標記名稱、來源和對應基因詳見表2，引物由青島擎科生物技術有限公司合成。KASP 反應結束后用PHERAstar 熒光讀板儀（英國LGC 公司）檢測熒光信號，然后導入儀器自帶的Kluster Caller軟件進行分型。

1.2.3 優異等位基因 大光周期基因和春化基因的優異等位基因和生態區有關，本研究中將所檢測材料中光周期和春化基因中占優勢的等位基因作為優異等位基因，其他基因的優異等位基因在分子標記開發時已給出。詳見表2。

表2 KASP標記信息Table 2 KASP marker details

表2（續）

2 結果與分析

2.1 KASP標記檢測概況

本研究共檢測了64 個KASP 標記，其中43 個標記分型效果較好，可以將全部樣品明顯分成藍色（FAM）和紅色（HEX）兩種基因型，相同基因型內個體較集中（圖1-a）。15個標記分型效果尚可，雖可將待測樣品分成兩種基因型，但相同基因型內個體較分散，基因型間距離較近（圖1-b）。6個標記分型存在問題，其中GluA1.1_1883、PPOD1_SNP、PODA1_462_SNP、COMT3B_882_SNP和TaGS-D1 5個標記檢測到較多的雜合基因型（綠色）與高代品系多為純合的結果不符（圖1-c），TaGS2B1_1936有41個未知基因型數據點（粉色），推測與引物結合位點存在變異有關（圖1-d）。

本研究中單個標記的缺失數據點一般為0～3 個，除TaGS2B1_1936 外，平均每個標記的缺失數據點為1.1 個。共有20 個標記全部樣品均為一種等位基因，主要涉及抗病、千粒重、春化和光周期相關基因。其他大部分標記的等位基因呈兩極分化，以其中一種等位變異占多數（圖2）。

2.2 產量相關基因檢測結果

1RS：1BL_6110 用于檢測1B/1R 易位，1B/1R 易位系共有13 份（占比10.32%），這些品系均來自高產組。Rht-B1_SNP 和Rht-D1_SNP 用于檢測株高基因，有120份攜帶Rht-D1b矮稈等位基因，占比95.24%，其他4.76%（6份）為Rht-B1b矮稈等位基因。與千粒重相關的標記共10 個。TaGASR7-A1 H1c長粒等位基因占比100%，TaCwi-A1a、TaGW2-6B Hap-1、TaSus1-7B Hap-T高千粒重等位基因占比較高，分別是88.89%、100.00%和97.62%，其次是TaGW2-6A Hap-A、TaSus1-7A 1185-C高千粒重等位基因分別占比38.10%、41.27%，TaCwi-4A Hap-4A-T、TaGS5-3A-T高千粒重等位基因占比較低，分別為12.70%和13.49%，僅濟農CH03攜帶CKXD1a高千粒重等位基因，占比為0.79%，TaGS-D1 僅檢測到雜合和GS-D1b兩種基因型，GS-D1a高千粒重等位基因未檢測到。與穗粒數相關的標記有2個，TEF7A1_606Hap-7A-3高穗粒數等位基因占比僅為18.25%。未檢測到TaMoc-7A的Hap-H多小穗數等位基因。與生物量相關的標記有1 個，為TaGS2B1_1936。TaGS2B1_1936 的檢測結果中未知基因型比例較高（圖1-d），TaGS2B1b高生物產量等位基因占比60.32%。

圖1 KASP標記分型圖Fig.1 Genotyping diagram of KASP markers

從以上結果可以看出，參試品系主要利用的矮稈基因為Rht-D1b，與產量相關的基因除TaCwi-A1-1、TaSus1-7B、TaGW2-6B外，其他基因的利用率都不高。

2.3 品質相關基因檢測結果

結果如圖2所示，GluA1.1-1883 和Glu-D1_4777用于檢測高分子量麥谷蛋白亞基，優異等位基因Ax1/Ax2*和Glu-D1d分別占比42.86%和38.89%，如果僅統計強筋專用組的參試品系，占比分別為66.67%和80.00%。Glu-A3g_SNP 和Glu-B3g_SNP 用于檢測低分子量麥谷蛋白，低分子量谷蛋白優異等位基因Glu-A3g和Glu-B3g分別占比96.03%和15.08%。Psy1Dag、Pds-B1_2002 和Zds-A1_SNP 與黃色素含量相關，低黃色素含量等位基因有利于增加面粉白度，低黃色素含量Psy-D1a、Pds-B1b和Zds-A1a等位基因占比分別為96.03%、18.25%和19.84%。LoxB1_SNP、PODA1_462_SNP 和PPOD1_SNP 與面粉及其制品白度相關。高活性Lox-B1a等位基因和高活性Pod-A1b等位基因分別占比53.17%、56.35%。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）低活性Ppo-D1a等位基因占比22.22%。Pina-D1_INS、Pinb-D1_INS 和Pinb2-v2-3 與籽粒硬度相關，硬質等位基因Pinb-D1b、Pina-D1b和Pinb-B2b占比分別為2.38%、89.68%和78.57%。參試品系所含硬度基因以Pinb-D1位點為主。

圖2 等位基因占比Fig.2 Allele percentage

2.4 抗性相關基因檢測結果

Fhb1_KSU 與抗赤霉病有關，所有參試品系均為Fhb1-感病等位基因。Lr14a抗葉銹病等位基因Lr14+占比57.94%，檢測Lr34的標記有Lr34jagger 和C6K2C1，2 個標記的抗病等位基因占比均為0，故抗病等位基因Lr34+未檢測到，Lr46抗病等位基因Lr46+占比15.87%，岱麥7136、濟麥60 和魯研74 三個品系攜帶Lr68抗病等位基因Lr68+，占比2.38%。CU8與眼斑病有關［12］，未檢測到抗病等位基因Pch1+。Pm21_SNP與白粉病有關［12］，僅CG086 為抗病等位基因Pm21+，占比0.79%。wsnp_JD_c4438_5568170 與小麥黃花葉病有關［19］，M112 和濟麥8068 攜帶抗病等位基因Sbwm1-A，占比1.59%。Yr15_R5 是抗條銹基因Yr15的連鎖標記，抗病等位基因Yr15+未檢測到。以上結果表明，與抗病相關的已知基因位點在參試品系中含量較低。1fehw3 和TaDreb_SNP 與干旱條件下的籽粒產量有關，高表達等位基因Westonia type和高籽粒產量等位基因Dreb-B1a占比均為87.30%。PHS1-prom-222、PHS_646、SDR_SNP、Vp1B2-83 與穗發芽有關，PHS1-prom-222 和PHS_646 均是TaPHS1的標記，抗穗發芽等位基因RioBlanceo type、RioBlanceo type、Sdr-B1a、Vp-1Bc分別占比0.79%、98.41%、0.00% 和26.19%，表明部分抗穗發芽基因的利用率較低。COMT3B_882_SNP 與莖稈木質素含量有關，該標記存在雜合基因型多的問題，參試品系中僅有1份攜帶高莖稈木質素含量純合等位基因COMT3Ba，為濟農CH01。

2.5 開花相關基因檢測結果

GS100-1027IND、GS105-1117IND、TaPpdBJ001、TaPpdDD001、TaPpdDD002RI、TaPpdDI001RI與光周期相關，GS100-1027IND 和GS105-1117IND 均是Ppd-A1的標記，TaPpdDD001、TaPpdDD002RI和TaPpdDI001RI均是Ppd-D1的標記。除TaPpdBJ001（Ppd-B1）有15.87%為晚抽穗等位基因RTIndel Truncated copy外，其他位點參試品系均為相同等位基因。Exon7_C/T_Vrn-A1、Vrn1_new、Vrn-A1_9K0001、Vrn-A1b-Marq均是春化基因Vrn-A1的標記，Vrn-B1_A 和Vrn-B1_B均是春化基因Vrn-B1的標記，Vrn-D1-D1a_A 是春化基因Vrn-D1的標記。除Vrn-D1-D1a_A（Vrn-D1）有3.97%為Vrn-D1a春性等位基因外，其他位點參試品系均為相同等位基因。PRR73A1-9IND、PRR73B1-4558、TaELF3-B1、TaFT3-B1、TaMOT1-D1與開花期相關，除TaELF3-B1 Wild type早花等位基因占比僅為2.38%外，PRR-A1 Hap-I、PRR-B1 Hap-II、TaFT3-B1 G Allele、TaMOT1-D1 Wild-type早花等位基因占比均較高，分別為87.30%、84.92%、85.71%、86.51%。攜帶TaELF3-B1 Wild type早花等位基因的品系有S32、菏麥182和山農116。

3 討論

3.1 區試品系優異等位基因利用情況

1B/1R 易位系具有高產、抗病等優點，曾作為優異種質資源在世界范圍內被廣泛利用［13，23］。20世紀70年代1B/1R 易位系被引入中國，1980年豐抗2 號等第一批育成品種開始應用于生產［24-25］。王曉軍等［24］對1980—2008年間黃淮麥區育成品種（系）進行了分子標記檢測，發現66份大面積推廣品種中45.5%攜帶1B/1R易位。2020年宮文萍等［26］對來自全國的1 293份小麥品種（系）進行分子檢測，發現542份能擴增出1B/1R 易位系特異條帶，占比41.92%，表明1B/1R 易位系在黃淮麥區乃至全國被廣泛應用。本研究中僅高產組有13 份品系為1B/1R 易位系，而強筋專用組未檢測到。由此推測出由于受1RS上攜帶的抗病基因喪失抗性和黑麥堿對小麥加工品質不利影響，1B/1R 易位系在高產育種中利用率逐步降低，在優質育種中極少使用。李韜等［27］研究認為1RS 可能攜帶赤霉病擴展抗性相關基因，與Fhb1基因有累加效應，1B/1R易位系在今后高產育種中可能仍有利用價值。矮稈基因被稱為“綠色革命”基因，是高產育種的關鍵，目前生產上主要利用Rht-B1b和Rht-D1b［13，28］。本研究中參試品系攜帶的矮種基因以Rht-D1b矮稈等位基因為主，與前人的研究結果一致。產量三要素中千粒重相關基因被報道最多，本研究選用的相關標記有10 個，其中TaGASR7-A1 H1c、TaCwi-A1a、TaGW2-6B Hap-1、TaSus1-7B Hap-T優異等位基因的利用率較高（＞85%）；TaGW2-6A Hap-A和TaSus1-7A 1185-C利用率略f低，在40%左右；TaGS5-3A-T、TaCwi-4A Hap-4A-T、TaCKXD1a、TaGS-D1a利用率小于15%，有待提高。雖然千粒重相關基因的報道較多，但從小麥生長過程分析，育種家會先對穗數和穗粒數進行選擇，千粒重在收獲后才能有效選擇。育種需要綜合考慮產量三要素，因此加強對穗數和穗粒數的遺傳解析，才能利用分子標記對畝穗數、穗粒數和千粒重同步選擇，更好地滿足育種的需求。畝穗數和穗粒數基因調控復雜，研究進展緩慢。本研究僅檢測了TaMoc-A1、TEF-7A2 個與穗粒數相關的標記，其優異等位基因Hap-H和Hap-7A-3利用率均較低。

小麥品質相關基因研究開始較早，主要圍繞面粉白度、籽粒硬度和麥谷蛋白等開展。本研究中，除硬度基因和黃色素位點Psy-D1優異等位基因占比較高外，TaPds-B1b、Zds-A1a優異等位基因利用均較少。此外，脂肪氧化酶（lipoxygenase，LOX）活性與種子耐儲藏性有關，低LOX 活性可有效減輕籽粒的氧化變質，從而延長其儲藏期［29］。PPO 活性與抗穗發芽有關，PPO活性和Ppo-A1相對表達量均與發芽指數呈顯著正相關［30］。隨著人民生活水平的提高，對優質小麥提出了不同的要求。小麥黃色素中的葉黃素和玉米黃質具有保護視力、抗氧化等保健功效［31］，因此利用分子標記輔助選育高黃色素小麥有市場應用前景。高分子量谷蛋白亞基是影響面包加工品質的關鍵因素，由Glu-A1、Glu-B1和Glu-D13個位點控制，本研究成功檢測了Glu-A1和Glu-D12 個位點，而Glu-B1最復雜，有超過20 種等位基因且序列相似性較高［32］，導致分子標記開發困難，在分子育種中缺乏準確、實用的KASP 標記。低分子量谷蛋白亞基等位基因更多，也存在基因序列間相似性高、標記開發困難的問題，需要進一步研究。

倒伏、病害、干旱等因素都會導致小麥減產，保障高產的前提是提高小麥抗性。本研究中與抗病相關的優異等位基因的占比均較低，反映出已知基因在育種中利用不足，有必要加強對抗病基因Lr46+、Lr68+、Sbwm1-A、Pm21+、Pch1+、Lr34+、Yr15+、Fhb1+的利用。與抗旱相關的2 個標記優異等位基因占比較高，可能是因其與產量相關聯而被間接選擇。COMT-3B是為數不多與抗倒相關的功能基因，高莖稈木質素含量優異等位基因COMT3Ba有利于提高小麥抗倒伏性［33］。雖然單個基因的作用有限，但是隨著更多相關基因功能標記的開發，分子標記輔助選擇將在小麥抗倒育種中發揮越來越重要的作用。本研究共檢測了3 個與抗穗發芽相關位點，Vp1B1和TaSdr-B1抗穗發芽Vp-1Bc和Sdr-B1a優異等位基因占比均較低；TaPHS1位點檢測了2 個標記，一個標記優異等位基因占比較高，而另一個標記占比很低。Liu等［34］最新研究發現TaPHS1共有4 個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP），綜合4個SNP才能獲得抗性最好的等位基因，即在本研究基礎上，增加另外2 個SNP 的分子標記檢測才能對TaPHS1進行更有效的輔助選擇。

開花相關的光周期和春化基因決定了小麥品種（系）的生態適應性，因此在一定生態區域內大部分品種（系）的等位基因是一致的，只有個別位點存在差異。本研究中存在差異的位點為Ppd-B1和Vrn-D1a，僅少數品系為Ppd-B1 RTIndel Truncated copy和Vrn-D1a。而與早花相關的基因多為微效基因，對開花期有一定的調節作用，是相同生態區早熟類型的關鍵基因。本研究中除TaELF3-B1外，其他早花等位基因的比例均超過了85%，在早熟育種方面，可考慮利用優異等位基因TaELF3-B1 Wild type。

3.2 對區試品系進行分子檢測的意義

區試品系代表了區域內的育種水平，通過對區試品系的研究分析可以了解該區域的育種進展。濟麥22 是山東省小麥區試高產組對照品種，分子檢測表明濟麥22 是非1B/1R 易位系，矮稈基因是Rht-D1b，含有與產量相關的優異等位基因：TaCwi-A1a、TaCwi-4A Hap-4A-C、TaGW2-6B Hap-1、TaSus1-7A 1185-C、TaSus1-7B Hap-T、TaGASR7-A1 H1c；與品質相關的優異等位基因：Glu-A3g、Psy-D1a、Pinb-D1b、Pinb-B2b；與抗性相關的優異等位基因：Lr14+、1fehw3 RioBlanceo type、Dreb-B1a、TaPHS1 RioBlanceo type；與開花相關的優異等位基因：PRR-A1 Hap-I、PRR-B1 Hap-II、TaFT3-B1 G Allele、TaMOT1-D1 Wild-type；光周期和春化基因均為優勢基因型（優異等位基因）。在高產組中超過80%的品系與濟麥22 具有相似的等位基因組成，而差異主要在于TaGW2-6A、TaSus1-7A、Glu-A1、Glu-D1、Lox-B1、Lr14、Vp1B17 個基因。這7 個基因的優異等位變異占比不足50%，有必要在高產育種中提高利用率。濟南17 是山東省小麥區試強筋組對照品種，除與濟麥22 的絕大部分優異等位基因相同外，還含有TaGW2-6A Hap-A、TEF-7A Hap-7A-3、GluA1 Ax1/Ax2*、Pds-B1b、Lox-B1a、Lr46+優異等位基因。在強筋組中大部分基因的等位基因分布與高產組相同，區別在于強筋組均不攜帶1B/1R 易位系，TaGW2-6A、Glu-A1、Glu-D1、Lox-B1、Vp1B1的優異等位基因占比達到75%以上，表明這些基因在優質育種中已被育種家選擇；而TaGS5、TEF-7A、Glu-A3g、Pds-B1、PRR-A1、PRR-B1、Lr46優異等位基因占比在50%左右，在品質育種中需要加強選擇。雖然只有少部分參試品系能通過審定成為品種，但明確參試品系重要性狀功能基因的組成對未審定品系的改良和審定品種的育種利用均有重要意義。明確區試品系已知基因的等位基因，不僅可以指導實踐，用于親本組配，還可以在后代選擇過程中按照基因互補原則取長補短，將更多的優異等位基因聚合在一起，從而提高育種效率。

3.3 KASP標記應用

KASP 標記與需要通過凝膠電泳檢測的分子標記相比，具有快速、簡便、高通量等優勢［11］，目前已得到廣泛使用。但已開發的部分KASP 標記可能存在問題，在進行基因分型時需要謹慎。如張維軍等［35］對粒重相關的4 個KASP 標記進行了檢測，其中TaGW2-6B的分型圖中Hap-1等位基因與雜合基因型分群界限不明顯，容易產生誤判；TaGASR的分型圖僅有H1c等位基因和雜合基因型，從品種品系多為純合考慮，雜合基因型是否應為另一種等位基因需要進一步驗證。本研究選用的KASP 標記先通過23 個DNA 樣品測試，篩選分型效果好的標記再進行全部樣品檢測，但仍有部分標記存在數據點分散，雜合基因型較多和擴增失敗的問題。除受DNA 質量和濃度影響外，主要原因可能是引物結合位點特異性不足，導致非特異擴增，從而影響分型效果。從多效抗病基因KASP 標記改良［13］的結果來看，可以通過重新設計引物來改良已開發標記，從而達到更好的分型效果。

4 結論

本研究對126份山東省小麥區試品系進行了64個KASP 標記的檢測，結果表明與株高相關的Rht-D1，與千粒重相關的TaCwi-A1-1、TaGW2-6B、TaSus1-7B、TaGASR7-A1，與低分子量谷蛋白相關的Glu-A3g，與黃色素相關的Psy-D1，與硬度相關的Pinb-D1、Pinb2-V，與抗旱相關的1-feh-w3、TaDreb-B1，與抗穗發芽相關的PHS1-prom-222，與光周期相關的Ppd-A1、Ppd-B1、Ppd-D1，與春化相關的Vrn-A1、Vrn-B1、Vrn-D1，和與早花相關的TaFT3-B1、TaMOT1-D1、PRR-A1、PRR-B1優異等位基因利用率較高，其他基因的利用率較低，特別是與千粒重相關的TaGS-D1，與小穗數相關的TaMoc-7A，與抗赤霉病相關的Fhb1，與抗病相關的Lr34、Pch1、Yr15，與抗穗發芽相關的TaSdr-B1優異等位基因未檢測到。