小麥脅迫相關(guān)蛋白基因TaSAP12-D的耐鹽性分析

王亦學(xué) 郝曜山 張歡歡 董艷輝 王曉清 吳慎杰

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030031）

鹽脅迫是影響作物生長發(fā)育和產(chǎn)量的主要非生物脅迫。隨著全球氣候變化以及不合理的灌溉，鹽漬化土壤面積不斷擴大，鹽漬化程度不斷加劇，嚴重制約作物的生長，造成經(jīng)濟產(chǎn)量的下降。培育耐鹽作物是抵御鹽脅迫的一種可行途徑［1-2］。小麥（Triticum aestivumL.）是我國重要的糧食作物之一，但在生產(chǎn)過程中，鹽脅迫會造成小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，制約著小麥的安全生產(chǎn)［3］。因此，提高小麥對鹽脅迫的適應(yīng)性，對于小麥的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)至關(guān)重要，其中發(fā)掘和利用小麥耐鹽基因是改良小麥適應(yīng)鹽脅迫的前提和基礎(chǔ)。

脅迫相關(guān)蛋白（stress associated proteins，SAPs）是一類具有A20/AN1 鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白，在植物中主要參與逆境脅迫的響應(yīng)［4］。近年來，已對許多植物中的脅迫相關(guān)蛋白基因進行了分離與功能驗證。最早研究的脅迫相關(guān)蛋白基因是水稻（Oryza sativaL.）的OsiSAP1基因，在高鹽、干旱及低溫條件下，過量表達該基因的煙草具有較高的萌發(fā)率和幼苗鮮重［5］。玉米（Zea maysL.）ZmAN13表達一個具有A20/AN1 鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白，該基因的表達受低溫脅迫誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)該基因（ZmAM3）擬南芥對低溫脅迫的耐受能力增強，卻對高鹽和干旱脅迫更加敏感［6］。擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtSAP5參與調(diào)控高溫脅迫相關(guān)基因的表達，該基因敲除突變體在高溫脅迫條件下，幼苗的存活率顯著降低［7］。AtSAP10可以增強擬南芥對鎳、錳、鋅等重金屬以及高溫脅迫的耐受性，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因擬南芥具有較高的幼苗鮮重與根長［8］。另外，在高粱［9］、番茄［10］、苜蓿［11-12］、香蕉［13］、蘋果［14］、獐毛［15-16］等植物中均有關(guān)于SAP基因的報道，且這些基因都參與了逆境脅迫的響應(yīng)。

目前已有小麥SAP基因功能研究的相關(guān)報道，包括TaSAP1、TaSAP2、TaSAP5、TaSAP7-A和TaSAP17-D。其中，TaSAP1可以提高擬南芥幼苗對滲透脅迫和高鹽脅迫的耐受能力；TaSAP2可以提高擬南芥幼苗的抗?jié)B透脅迫能力，進一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)TaSAP1和TaSAP2基因的擬南芥苗中參與逆境調(diào)控的多個脅迫應(yīng)答基因上調(diào)表達［17］；TaSAP5可以增強擬南芥及小麥的抗旱性，且正常條件下轉(zhuǎn)TaSAP5的擬南芥和小麥與對照植株相比，無顯著形態(tài)和生長差異［18］；TaSAP7-A可以增強擬南芥對滲透脅迫和高鹽脅迫的敏感性，而且加速了離體葉片的葉綠素降解［19］；TaSAP17-D通過上調(diào)滲透脅迫相關(guān)基因表達，提高了擬南芥幼苗的耐鹽性［20］。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所景蕊蓮課題組先前運用HMMER軟件搜索到小麥基因組中包含A20/AN1 結(jié)構(gòu)域的SAP 基因家族候選成員共23 個，利用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測候選基因的表達模式，篩選出響應(yīng)高鹽脅迫的候選基因TaSAP12-D。基于此，本研究通過在擬南芥中過量表達TaSAP12-D基因來驗證其生物學(xué)功能，同時檢測部分鹽脅迫響應(yīng)基因的表達，旨在為小麥耐鹽性方面的遺傳改良提供理論依據(jù)和基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料及其培養(yǎng)

使用小麥品種旱選10 號（來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所景蕊蓮課題組）進行基因克隆及表達模式分析。挑選籽粒飽滿的小麥種子置于培養(yǎng)皿中，加去離子水后置于光照培養(yǎng)箱中水培，溫度為23℃，光周期為12 h 光照/12 h 黑暗。在萌發(fā)期和幼苗期取樣，包括胚芽、葉和根，用于基因的組織表達分析。待幼苗長至一心一葉期進行NaCl 處理，先將培養(yǎng)皿中的去離子水傾倒干凈，后將250 mmol·L-1的NaCl 溶液加入培養(yǎng)皿中并浸沒幼苗的根部，分別于加入溶液后0、0.5、1、3、6、9和12 h取幼苗的葉片用于鹽脅迫條件下的基因表達分析。上述樣品取樣后迅速放入液氮中速凍，貯于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｊ褂脭M南芥哥倫比亞0 型（Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia 0）進行基因的遺傳轉(zhuǎn)化，使用煙草（Nicotiana benthamiana）進行基因編碼蛋白的亞細胞定位，培養(yǎng)條件為23 ℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.2 目的基因的克隆與序列分析

根據(jù)HMMER軟件搜索到的TaSAP12-D參考序列設(shè)計特異性引物TaSAP12-D-F和TaSAP12-D-R，以小麥cDNA為模板，用TransStart Fast PfuDNA Polymerase進行目的基因的克隆。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。使用在線分析軟件ProtParam tool（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測目的基因編碼蛋白的分子量及等電點。目的基因編碼的氨基酸序列提交到NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLASTP 比對，獲得其他物種的同源序列，使用DNAMAN 和MEGA6軟件分別進行多重序列比對和同源性分析。

1.3 目的基因的表達模式分析

設(shè)計qRT-PCR引物TaSAP12-D-RT-F和TaSAP12-D-RT-R，以小麥Actin基因為內(nèi)參，分析目的基因在不同組織及鹽脅迫條件下的表達模式。按照SYBRPremix Ex TaqII試劑盒（TaKaRa，日本）的說明進行操作。反應(yīng)體系為15μL：cDNA 1.5μL、2×SYBRPremix Ex Taq7.5μL、ROX Reference Dye 0.3μL、5μmol·L-1正反向引物各0.3 μL，ddH2O 補至15 μL。使用ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀（ABI，美國）進行擴增，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性120 s；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，45個循環(huán)。采用2-△△CT法計算目的基因的相對表達量［21］。

1.4 亞細胞定位

利用重組載體pCAMBIA1300-TaSAP12-D-GFP在煙草葉片中進行亞細胞定位。利用引物TaSAP12x-D-F 和TaSAP12k-D-R，以1.2 中克隆的目的基因為模版進行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件同1.2，將目的基因引入XbaI 和KpnI 酶切位點，雙酶切后將目的基因（不含終止子）構(gòu)建到植物表達載體pCAMBIA1300的多克隆位點內(nèi)，采用熱激法將其轉(zhuǎn)化到GV3101 農(nóng)桿菌中，震蕩培養(yǎng)至OD 值為1 時收集菌體，重懸后注射煙草葉片，培養(yǎng)2 d后觀察熒光信號。

1.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性分析

利用1.4 中包含目的基因的農(nóng)桿菌進行擬南芥的轉(zhuǎn)化。采用蘸花法［22］對盛花期的擬南芥進行侵染，經(jīng)潮霉素篩選和qRT-PCR 檢測，獲得T3代轉(zhuǎn)基因純合株系，選取目的基因表達量相對較高的3 個株系用于耐鹽性分析。將野生型（wild type，WT）、轉(zhuǎn)空載體植株（vector control，VC）和轉(zhuǎn)基因植株（L1、L2 和L3）的擬南芥種子用10%的NaClO 溶液消毒處理15 min，再用無菌水沖洗7～8 次，播種于MS 培養(yǎng)基（Murashige and skoog culture medium）及添加150 mmol·L-1NaCl 的MS培養(yǎng)基上，4 ℃春化處理2 d，隨后在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d后觀察植株生長情況，計算植株存活率，每個處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥鹽脅迫響應(yīng)基因的表達分析

為揭示目的基因在鹽脅迫條件下的作用機制，以擬南芥Actin基因為內(nèi)參，將正常條件培養(yǎng)10 d 和鹽脅迫處理10 d的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片和對照植株葉片作為試驗材料，采用qRT-PCR 對鹽脅迫相關(guān)應(yīng)答基因AtP5CS1、AtRD29A、AtLEA、AtSOS1、AtNHX1和AtHKT等的表達模式進行分析。

表1 試驗中使用的引物Table 1 Primers used in the experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 TaSAP12-D的克隆及序列分析

根據(jù)HMMER 軟件搜索小麥D 基因組數(shù)據(jù)庫得到目的基因的參考序列，設(shè)計特異性引物，從小麥品種旱選10 號中擴增目的基因。序列分析表明，該基因序列全長519 bp，編碼172 個氨基酸，命名為TaSAP12-D，其編碼的蛋白在N 端有1 個A20 結(jié)構(gòu)域，在C 端有1 個AN1結(jié)構(gòu)域，屬于SAP蛋白最常見的組合類型，預(yù)測其蛋白分子量為18.41 kDa，等電點為9.21。

將TaSAP12-D 的氨基酸序列提交到NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行BLASTP 比對，獲得其他物種的同源序列。利用DNAMAN 進行多重序列比對，結(jié)果顯示TaSAP12-D與其他植物中的A20結(jié)構(gòu)域和AN1結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列高度相似（圖1-A）。利用MEGA6進行同源性分析，TaSAP12-D 可與其他單子葉植物的SAP 劃分為一類，包括大麥（Hordeum vulgare）、谷子（Setaria italica）、水稻和高粱（Sorghum bicolor），其他雙子葉植物的SAP 劃分為另一類（圖1-B）。

圖1 TaSAP12-D的多重序列比對（A）與同源性分析（B）Fig.1 Multiple alignments（A）and homology analysis（B）of TaSAP12-D

2.2 TaSAP12-D的亞細胞定位

為了解TaSAP12-D 在細胞中的表達部位，將TaSAP12-D 與GFP 進行融合。構(gòu)建融合表達載體pCAMBIA1300-TaSAP12-D-GFP，將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中并注射煙草葉片，以空載體pCAMBIA1300-GFP 作為對照，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號。結(jié)果表明TaSAP12-D在細胞核和細胞質(zhì)中均有表達（圖2）。

圖2 TaSAP12-D的亞細胞定位Fig.2 Subcellular localization of TaSAP12-D

2.3 TaSAP12-D的表達模式分析

為揭示TaSAP12-D在小麥不同組織的表達模式，分別選取了萌發(fā)期的胚芽、根，以及幼苗期的葉、根進行qRT-PCR。結(jié)果顯示，TaSAP12-D在萌發(fā)期和幼苗期的胚芽、葉、根中均有表達，但在幼苗期的葉中表達量最高，其表達量是幼苗期根部表達量的3.7 倍；在萌發(fā)期的根部表達量最低，胚芽的表達量是根部的2.4 倍（圖3-A）。用NaCl 對小麥幼苗進行鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)TaSAP12-D的表達水平隨時間呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在處理1 h 時達到高峰，約為對照的4.1 倍，表明TaSAP12-D參與了高鹽脅迫響應(yīng)（圖3-B）。

圖3 TaSAP12-D在不同組織（A）和鹽脅迫下（B）的表達Fig.3 Expression of TaSAP12-D in different tissues（A）and under salt stress treatment（B）

2.4 過表達TaSAP12-D增強擬南芥的耐鹽性

對轉(zhuǎn)TaSAP12-D擬南芥進行正常條件培養(yǎng)和鹽脅迫處理14 d，在MS培養(yǎng)基上野生型、轉(zhuǎn)空載體植株（VC）和轉(zhuǎn)基因擬南芥（L1、L2和L3）均能正常生長，且長勢基本一致，說明TaSAP12-D并未對擬南芥的生長產(chǎn)生影響；在添加150 mmol·L-1NaCl的MS培養(yǎng)基上，野生型和轉(zhuǎn)空載體植株的葉片發(fā)黃，甚至變白死亡，而轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片僅少部分發(fā)黃和變白死亡（圖4-A）。利用qRT-PCR檢測T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥純系中TaSAP12-D的表達量，測得3 個轉(zhuǎn)基因擬南芥純系中TaSAP12-D的表達量依次是野生型（WT）的36、50 和42 倍（圖4-B）。存活率統(tǒng)計顯示，野生型和轉(zhuǎn)空載體植株的存活率分別為34.2%和37.5%，兩者無顯著差異；而3 個轉(zhuǎn)基因擬南芥的存活率依次為81.7%、86.7%和83.3%，極顯著高于野生型植株（圖4-C），并且與轉(zhuǎn)基因擬南芥中TaSAP12-D的表達量變化趨勢一致，說明過表達TaSAP12-D增強了擬南芥的耐鹽性。

圖4 轉(zhuǎn)TaSAP12-D擬南芥的耐鹽性分析Fig.4 Analysis of Salt-tolerance in TaSAP12-D transgenic Arabidopsis

2.5 轉(zhuǎn)TaSAP12-D 擬南芥鹽脅迫響應(yīng)基因的表達分析

為揭示TaSAP12-D在鹽脅迫條件下的作用機制，采用qRT-PCR 檢測與鹽脅迫相關(guān)應(yīng)答基因的表達情況。結(jié)果表明，在鹽脅迫下，滲透調(diào)節(jié)基因，如脯氨酸合成的關(guān)鍵基因（Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因P5CS1）、脫水誘導(dǎo)基因（RD29A）、胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白基因（LEA）的表達量極顯著增高，是WT 的3.1～13.3 倍；離子轉(zhuǎn)運基因，如鹽超敏感基因（SOS1）、Na+/H+轉(zhuǎn)運蛋白基因（NHX1）、高親和性鉀離子轉(zhuǎn)運蛋白基因（HKT）的表達量同樣顯著或極顯著增高，是WT 的1.5～3.2 倍（圖5）。由此推測，TaSAP12-D在鹽脅迫條件下，可能通過調(diào)控上述兩類基因的表達，一方面緩解滲透脅迫，另一方面調(diào)節(jié)離子平衡，從而增強轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。

圖5 轉(zhuǎn)TaSAP12-D擬南芥鹽脅迫相關(guān)基因的表達Fig.5 Expression of salt-stress relative genes in TaSAP12-D transgenic Arabidopsis

3 討論

為抵御外界不良環(huán)境，植物在長期進化過程中，從形態(tài)建成以及生理代謝途徑等方面形成了一系列復(fù)雜的防御機制，以保證其正常的生長和繁衍［23-24］。當植物遇到逆境時，外界的脅迫信號會傳遞到植物體內(nèi)，從而改變遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，啟動脅迫相關(guān)基因的表達，來緩解脅迫帶來的傷害［25-26］。本研究從小麥D基因組中克隆得到脅迫相關(guān)蛋白基因TaSAP12-D，其編碼的蛋白在N 端和C 端分別含有1 個A20 結(jié)構(gòu)域和1 個AN1 結(jié)構(gòu)域，屬于SAP 蛋白最常見的組合類型，先前報道的TaSAP1、TaSAP2和TaSAP5也屬于此組合類型［17-18］。

蛋白質(zhì)在細胞中的定位反映了其在細胞中行使功能的部位。TaSAP12-D 的亞細胞定位顯示，其在細胞核和細胞質(zhì)中均有分布，這與TaSAP5、TaSAP7-A 和TaSAP17-D 的亞細胞定位結(jié)果相一致［18-20］。有文獻報道，部分A20/AN1型的SAP蛋白具有E3泛素連接酶功能［18，27-28］，因此推測TaSAP12-D 可能作為轉(zhuǎn)錄因子在細胞核內(nèi)發(fā)揮功能，或者泛素化降解某類蛋白，在細胞質(zhì)中進行蛋白質(zhì)翻譯后的修飾。基因的時空表達與其生物學(xué)功能密切相關(guān)。已有報道發(fā)現(xiàn)，TaSAP17-D的表達水平受鹽脅迫誘導(dǎo)［20］。本研究中，組織表達分析顯示，TaSAP12-D在幼苗期的葉中表達量高，因此選擇在幼苗期進行鹽脅迫處理，對葉片中TaSAP12-D的表達水平進行分析，結(jié)果表明其在鹽脅迫條件下表達量同樣上調(diào)，暗示其在應(yīng)對鹽脅迫中發(fā)揮功能。

土壤中過多的鹽離子常常會導(dǎo)致植物生長發(fā)育緩慢，植株矮小甚至死亡，即鹽脅迫是影響植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因素之一［29］。高濃度的鹽離子一方面影響植物根系對水分的吸收，產(chǎn)生滲透脅迫；另一方面會破壞植物細胞中的離子平衡，產(chǎn)生離子毒害。在鹽漬化的土壤中，作物難以正常生長，利用鹽漬化土地資源的有效措施之一就是挖掘作物中的耐鹽基因資源，從而提高作物的耐鹽性，培育出耐鹽新品種［30］。耐鹽基因資源一般包括調(diào)節(jié)基因和功能基因兩大類［31］。調(diào)節(jié)基因在早期表達，可以通過調(diào)控和啟動下游的多個代謝途徑來行使生物學(xué)功能，因而得到廣泛的關(guān)注。本研究將TaSAP12-D基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，并未發(fā)現(xiàn)該基因?qū)M南芥的生長產(chǎn)生影響；但在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片僅少部分發(fā)黃和變白死亡，存活率顯著高于野生型和轉(zhuǎn)空載體植株，說明過表達TaSAP12-D增強了擬南芥的耐鹽性。前人研究表明，TaSAP1可以提高擬南芥幼苗的耐鹽能力，同時參與逆境調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的多個重要脅迫應(yīng)答基因上調(diào)表達［17］。TaSAP17-D同樣可以增強擬南芥的耐鹽性，且滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因上調(diào)表達，推測其耐鹽性的增強與滲透調(diào)節(jié)能力的提高有關(guān)［20］。本研究中，轉(zhuǎn)TaSAP12-D擬南芥中鹽脅迫相關(guān)應(yīng)答基因AtP5CS1、AtRD29A、AtLEA、AtSOS1、AtNHX1和AtHKT的表達量均顯著或極顯著上調(diào)，推測TaSAP12-D可能通過調(diào)控上述兩類基因的表達來調(diào)節(jié)細胞的滲透勢和維持離子平衡，從而提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。

4 結(jié)論

本研究從小麥品種旱選10號中克隆得到TaSAP12-D基因，其編碼的蛋白在N 端和C 端分別含有1 個A20結(jié)構(gòu)域和1 個AN1 結(jié)構(gòu)域，亞細胞定位顯示其在細胞核和細胞質(zhì)中均有表達。TaSAP12-D在小麥萌發(fā)期和幼苗期的胚芽、葉、根中均有表達，但在幼苗期的葉中表達量最高，且該基因在鹽脅迫條件下表達量上調(diào)。過表達TaSAP12-D增強轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性，在轉(zhuǎn)基因擬南芥中鹽脅迫相關(guān)應(yīng)答基因AtP5CS1、AtRD29A、AtLEA、AtSOS1、AtNHX1和AtHKT的表達量均顯著或極顯著上調(diào)，推測TaSAP12-D可能通過調(diào)控上述基因的表達來增強轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。綜上所述，TaSAP12-D在應(yīng)答鹽脅迫的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中具有比較重要的作用，是改良作物耐鹽性的重要候選基因。