寬體金線蛭不同工藝提取物的抗凝溶栓活性比較研究

何盛盛 王水濤 陳姿亦 徐周熠 朱希忱 徐錦鵬 高有領(lǐng)

（浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100）

寬體金線蛭（Whitmania pigra）是我國(guó)水蛭藥材的主要原料，具有抗凝和溶栓的藥理作用，臨床上常用于治療心血管疾病［1］。在傳統(tǒng)中藥中，寬體金線蛭以整體入藥，但入藥方式存在藥力不佳、藥效不穩(wěn)定等局限性，而通過(guò)提取可以把藥效更好地發(fā)揮出來(lái)，目前已證實(shí)其提取物在抗凝血［1-2］、抗血栓［3］、抗炎［4-5］、抗纖維化［6］和抗腫瘤［7］等方面具有良好的藥理作用。

人的凝血過(guò)程通常分為內(nèi)源性凝血途徑、外源性凝血途徑和共同凝血途徑（圖1）［8］。凝血因子X(jué) 在內(nèi)源性途徑或外源性途徑作用下，被激活成為Xa，之后Xa 在Ca2+和因子V 等作用下使凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟浮Ｄ甘箍扇芾w維蛋白原變成不溶纖維蛋白，再經(jīng)過(guò)聚合、重疊及結(jié)合血細(xì)胞等凝固成血凝塊［8］，并在一定條件下，在血管內(nèi)形成栓子，部分或完全堵塞血管，從而引發(fā)栓塞性疾病。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外臨床使用的治療血栓栓塞性疾病的藥物主要包括抗凝血藥物、抗血小板藥物和纖維蛋白溶解藥物。寬體金線蛭體內(nèi)含有具有抗凝血作用的物質(zhì)，已有研究證實(shí)其作用途徑包括內(nèi)源性凝血途徑、外源性凝血途徑和共同凝血途徑［9］，即通過(guò)干擾凝血因子的激活或降低凝血酶活性，抑制血小板聚集和溶解纖維蛋白原等途徑實(shí)現(xiàn)抗凝溶栓。寬體金線蛭抗凝溶栓的活性物質(zhì)主要分為兩類，一類是具有抗凝血功能的多肽和寡肽［10-15］，另外一類是具有纖溶活性的蛋白［16-17］。寬體金線蛭活性成分復(fù)雜多樣，不同工藝提取的抗凝溶栓活性物質(zhì)存在差異，且活性物質(zhì)多為水溶性物質(zhì)，因此抗凝溶栓活性物質(zhì)受提取方法的影響。

圖1 凝血-抗凝-纖溶系統(tǒng)［8］Fig.1 Coagulation-anticoagulation-fibrinolysis system［8］

寬體金線蛭的活性成分提取方法有多種，包括水提取法［18］、有機(jī)溶劑提取法［18］、酶解提取法［19］、浸漬法［20］、滲漉法［21］和濕法超微粉碎法［22］等。其中有機(jī)溶劑提取有毒且提取率低；水提取不利于大規(guī)模的生產(chǎn)，提取過(guò)程中土腥味較重［23］。而酶解提取法主要模仿人體消化生理過(guò)程，即大分子物質(zhì)在胃腸道酸性、堿性環(huán)境和消化酶共同作用下，酶解成小分子肽、低聚糖和其他小分子物質(zhì)［24］，得到的提取物中盡可能多地保留了原材料的有效成分［25］。盡管有研究證實(shí)了寬體金線蛭水提醇沉法優(yōu)于醇提水沉法和丙酮醇沉法［26］，但另有研究報(bào)道仿生提取物比水提取物具有更好的體外溶栓活性［27］，并進(jìn)一步分析了仿生酶解液的核苷特征圖譜和肽特征圖譜［28］。雖然目前針對(duì)寬體金線蛭的提取工藝已有相關(guān)研究，但這些研究?jī)?nèi)容僅限于少數(shù)幾種提取工藝，且檢測(cè)指標(biāo)較為單一，并不能全面比較和評(píng)價(jià)不同工藝提取物的抗凝溶栓作用。因此，本試驗(yàn)通過(guò)分析不同工藝提取物的抗凝活性、纖溶活性與體外溶栓活性等指標(biāo)差異，對(duì)各提取工藝進(jìn)行較為全面的評(píng)價(jià)，并篩選合適的提取工藝，旨在為寬體金線蛭抗凝溶栓藥物研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

采用市售的螞蟥，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)斯越秀副教授鑒定為寬體金線蛭（Whitmania pigra）的干燥體，粉碎后過(guò)50 目篩。試驗(yàn)采用的主要試劑包括胃蛋白酶（1∶3 000）、胰蛋白酶（1∶250）、α-淀粉酶（1∶3 700）、脂肪酶（1∶20 000）、堿性蛋白酶（1∶200 000）、牛纖維蛋白原和凝血酶（1∶1 000）、彩虹245 plus廣譜蛋白Marker，北京索萊寶科技有限公司。活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）試劑盒、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）試劑盒和凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）試劑盒均購(gòu)于上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司。配制人工胃液時(shí)，取鹽酸9 mL，加蒸餾水稀釋至1 000 mL，配制人工腸液時(shí)，取0.2 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液250 mL，加入0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液118 mL，之后用水稀釋至1 000 mL。其余試劑均為分析純。

1.2 主要儀器和設(shè)備

Alpha 1-4 LSCplus 冷凍干燥機(jī)，德國(guó)CHRIST 公司；WH220-HT 恒溫加熱磁力攪拌器，德國(guó)WIGGENS公司；Centrifuge 5804R 高速離心機(jī)，美國(guó)EPPENDORF公司；SHZ-DⅢ抽濾機(jī)，臺(tái)州博奧真空設(shè)備有限公司；S210 pH 計(jì)，瑞士METTLER TOLEDO 公司；WIXminiPRO4 垂直電泳、Gel Dcode XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD 公司；DHG-9240A 烘箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 寬體金線蛭不同工藝提取物的制備

寬體金線蛭提取物的制備參考李濯冰等［23］和單宇等［29］的方法并略做改進(jìn)。

1.3.1 水提取法 取樣品粗粉1.0 g，按1∶20（W∶V）加入去離子水，于室溫磁力攪拌5 h，以8 000 r·min-1離心20 min，取上清液，經(jīng)過(guò)抽濾、凍干得到水提物，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酸提取法 取樣品粗粉1.0 g，按1∶20（W∶V）加入人工胃液，于室溫磁力攪拌5 h，以8 000 r·min-1離心20 min，取上清液，經(jīng)過(guò)抽濾、凍干得到酸提物，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 胃蛋白酶酶解工藝 取樣品粗粉1.0 g，按1∶20（W∶V）加入人工胃液，于40 ℃水浴處理30 min，然后加入6.67%的胃蛋白酶，磁力攪拌作用5 h后，將酶解液置于85 ℃水浴處理15 min，冷卻至室溫后，以8 000 r·min-1離心20 min，取上清液，經(jīng)過(guò)抽濾、凍干即得胃蛋白酶酶解物，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 胰蛋白酶酶解工藝 取樣品粗粉1.0 g，按1∶20（W∶V）加入人工腸液，于50 ℃水浴處理30 min 后加入酶底比為4%的胰蛋白酶，磁力攪拌作用5 h 后，將酶解液置于85 ℃恒溫水浴15 min，冷卻至室溫后，以8 000 r·min-1離心20 min。取上清液，經(jīng)過(guò)抽濾、凍干即得胰蛋白酶酶解物，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 仿生酶解工藝 取樣品粗粉1.0 g，按1∶20（W∶V）加入人工胃液，于37 ℃水浴處理30 min。加入酶底比4.17%的胃蛋白酶并攪拌均勻，置于37℃恒溫磁力攪拌器中攪拌3 h；用濃度為1 mol·L-1的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 值至6.80，再加入酶底比7.5%的胰蛋白酶，攪拌均勻，37 ℃條件下磁力攪拌2 h；取出樣品85 ℃水浴滅活15 min，冷卻至室溫。以8 000 r·min-1離心20 min，分取上清液，經(jīng)過(guò)抽濾、凍干即得仿生酶解物，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 粗酶酶解工藝 取樣品粗粉1.0 g 加至20 mL去離子水中，溶液預(yù)熱至50 ℃，作用30 min，加入pH值為8.5 的Tris-HCl 緩沖液，然后用1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH 值至8.5，并加入粗酶（堿性蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶酶活力比為1∶1∶1，總酶活為20 000 U），在50 ℃下繼續(xù)酶解5 h。將酶解液置于85 ℃恒溫水浴作用15 min，冷卻至室溫。以8 000 r·min-1離心20 min，分取上清液，經(jīng)過(guò)抽濾、凍干即得粗酶酶解物，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 脫脂工藝 取適量的寬體金線蛭粉，按1∶5（W∶V）加入石油醚進(jìn)行脫脂除雜，攪拌均勻后，封上封口膜，放于4 ℃靜置1 h。傾倒上清液，重復(fù)上述步驟。脫脂除雜2 h后，傾倒上清液，放于通風(fēng)櫥約30 min，揮干其余殘?jiān)陂g每10 min 攪拌一次，使其充分揮發(fā)。后續(xù)按上述工藝提取，為脫脂提取物。其中脫脂水提和脫脂酸提的提取溫度為37 ℃，脫脂加熱水提和脫脂加熱酸提的提取溫度為50 ℃。

1.4 蛋白含量的測(cè)定

采用雙縮脲比色法測(cè)定總蛋白含量。取1.5 g 硫酸銅和6.0 g 酒石酸鉀鈉溶于500 mL 蒸餾水中，再加入300 mL 10% NaOH 溶液，加水定容至1 000 mL。之后取一系列試管，分別加入牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 mg·mL-1）0、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6 mL，用蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，分別加入4 mL 雙縮脲試劑，室溫靜置30 min，以未加蛋白溶液的試管作為空白對(duì)照組，置于540 nm 波長(zhǎng)下比色，測(cè)得吸光度值為0、0.124、0.182、0.240、0.360、0.458。以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白含量（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程y=0.058 7x（R2=0.997 8）。精確量取各組提取液500μL，稀釋至1 mL，加水補(bǔ)充至2 mL，加入雙縮脲試劑4 mL，搖勻，室溫放置30 min于540 nm波長(zhǎng)處比色，以空白管（2 mL 蒸餾水+4 mL 雙縮脲試劑）調(diào)零點(diǎn)，重復(fù)3 次測(cè)定各組吸光度，進(jìn)而計(jì)算不同提取物中總蛋白的含量。

1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

取寬體金線蛭提取物0.05 g 溶于生理鹽水1 mL中配置成0.05 g·mL-1供試液。取供試液80μL，與5×蛋白上樣緩沖液20μL 配置成100μL 上樣液，于95 ℃水浴鍋中加熱15 min，備用。配制凝膠厚度為1.00 mm，12%分離膠和5%濃縮膠，取上述各組樣品和蛋白Marker 上樣。80 V 電泳至分離膠約15 min 后，改為100 V 電泳至凝膠底部結(jié)束。電泳后，切除凝膠多余部分，利用考馬斯亮藍(lán)染液染色1 h，用2 次脫色液洗脫凝膠各2 h，脫色至條帶清晰，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描，保存圖像。

1.6 抗凝血酶活性（antithrombin activity，AT）測(cè)定

按照《中華人民共和國(guó)藥典》［30］中的凝血酶滴定法進(jìn)行測(cè)定，取不同工藝提取物0.05 g 溶于1 mL 生理鹽水中配置成0.05 g·mL-1供試液，其中胃蛋白酶酶解物、脫脂胃蛋白酶酶解物均為0.01 g·mL-1供試液，以0.9%生理鹽水為對(duì)照組，重復(fù)測(cè)定3 次。取供試液100 μL，加入含0.5%牛纖維蛋白原的Tris-HCl 溶液200 μL 于試管中，搖勻，置水浴（37 ℃）中緩慢滴加10 U·mL-1凝血酶溶液，每分鐘加1 次，每次加5μL，滴加后將其不斷攪拌，直至試管內(nèi)溶液凝固或拉絲，記錄消耗凝血酶溶液的體積，平行測(cè)定3 次，并按下式計(jì)算凝血酶活性：

式中，U 為每1 g含凝血酶活性單位，U·g-1；C1為凝血酶溶液的濃度，U·mL-1；V1為消耗凝血酶溶液的體積，μL；C2為供試品溶液的濃度，g·mL-1；V2為供試液加入量，μL。

1.7 不同凝血途徑的抗凝活性測(cè)定

1.7.1 血漿的制備 選用健康的兔，頸動(dòng)脈取血于無(wú)菌離心管中，并與3.8%枸櫞酸鈉抗凝液（1∶9）混勻。3 500 r·min-1離心15 min，取上清液，分離出新鮮的貧血小板血漿（platelet-poor plasma，PPP）于無(wú)菌離心管。

1.7.2 活化部分凝血活酶時(shí)間測(cè)定（APTT） 活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）反映了凝血內(nèi)源性途徑，采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定。取50 μL PPP 于無(wú)菌離心管中，加入50 μL 供試液，再加入50 μL APTT 試劑，37 ℃孵育5 min，再加入50 μL 0.025 mol·L-1CaCl2溶液，并用移液槍不停攪拌，直到拉絲或者凝固，記錄時(shí)間。以生理鹽水為空白對(duì)照。

1.7.3 凝血酶原時(shí)間測(cè)定（PT） 凝血酶原時(shí)間（PT）反映了凝血外源性途徑，采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定。取50μL PPP 于無(wú)菌離心管中，加入50 μL 供試液，37 ℃孵育3 min，再加入100μL PT試劑，并用移液槍不停攪拌，直到拉絲或者凝固，記錄時(shí)間。以生理鹽水為空白對(duì)照。

1.7.4 凝血酶時(shí)間測(cè)定（TT） 凝血酶時(shí)間（TT）反映了凝血共同途徑，采用試劑盒進(jìn)行測(cè)定。取50μL PPP于無(wú)菌離心管中，加入50μL 供試液，37 ℃孵育3 min，再加入50 μL TT 試劑，并用移液槍不停攪拌，直到拉絲或者凝固，記錄時(shí)間。以生理鹽水為空白對(duì)照。

1.8 纖溶活性測(cè)定

基于譚赫等［27］的方法進(jìn)行改進(jìn)，并制作纖維蛋白原平板和纖維蛋白平板。

1.8.1 纖維蛋白原平板 用pH 值為7.4 的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）配制2%的瓊脂溶液，加熱使其完全融化，待冷卻至75 ℃左右，取20 mL瓊脂溶液與10 mL 用pH 值7.4 的PBS 緩沖液配制的0.1%的纖維蛋白原溶液混合，攪拌均勻后立即倒入滅菌后的培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，輕輕搖勻，冷卻靜置約30 min 至瓊脂完全凝固后，打出直徑為8 mm 的孔，打孔后將孔中液體吸出，備用［27］。

1.8.2 纖維蛋白平板 用pH 值為7.4 的PBS 緩沖液配制1%的瓊脂溶液，加熱使其完全融化，待冷卻至75 ℃左右，取20 mL 瓊脂溶液與8 mL 用pH 值7.4 的PBS緩沖液配制的0.5%的纖維蛋白原溶液混合，再加入1 mL 10 U·mL-1的凝血酶溶液混勻，攪拌均勻后立即倒入滅菌后的培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，輕輕搖勻，冷卻靜置約30 min至瓊脂完全凝固后，打出直徑為8 mm的孔，打孔后將孔中液體吸出，備用［27］。

1.8.3 纖溶活性 各組樣品供試液，均以0.05 g·mL-1樣品供試液每個(gè)孔加樣100 μL 進(jìn)行纖維蛋白原平板試驗(yàn)和纖維蛋白平板試驗(yàn)，生理鹽水為對(duì)照，重復(fù)3 次。將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 h，結(jié)束后取出平板。纖溶活性溶解圈面積計(jì)算方法如下：

1.9 動(dòng)物體外溶栓活性測(cè)定

參考譚赫等［27］的方法，從動(dòng)物的頸動(dòng)脈取血于50 mL 滅菌試管，置于4 ℃環(huán)境自然凝血5 h，體外制成血栓（血凝塊），將其均分，每塊為0.2 g，用生理鹽水漂洗，除去血凝塊表面粘附的血細(xì)胞和雜質(zhì)，烘干血凝塊并稱重（W1）。將血凝塊分別放入各個(gè)3 mL 供試液樣品中，生理鹽水為對(duì)照，置于37 ℃恒溫孵育36 h，之后取出血凝塊，用生理鹽水反復(fù)漂洗，烘干稱重（W2），各個(gè)組重復(fù)3 次。其中，中華鱉血試驗(yàn)供試液濃度為0.01 g·mL-1，新西蘭兔血試驗(yàn)供試液濃度為0.02 g·mL-1。血凝塊溶解率計(jì)算方法如下：

1.10 脫脂胃蛋白酶酶解提取物不同組分的抗凝纖溶活性測(cè)定

取脫脂胃蛋白酶酶解液，用10 kDa 和3 kDa 的超濾離心管進(jìn)行離心過(guò)濾，得到10 kDa 和3 kDa 膜的過(guò)濾物和截留物；再對(duì)10 kDa 的過(guò)濾物用3 kDa 膜進(jìn)行過(guò)濾，得到相應(yīng)過(guò)濾物和截留物。冷凍干燥后，稱取適量的組分配成相應(yīng)濃度的溶液，進(jìn)行抗凝活性和纖溶活性測(cè)定。

1.11 提取物對(duì)纖維蛋白原的作用

取提取物（0.05 g·mL-1）0.2 mL，對(duì)照組0.9%生理鹽水，分別加入0.2 mL 0.5%纖維蛋白原溶液（纖維蛋白原溶于pH 值7.4 的Tris-HCl 緩沖液），置于37 ℃反應(yīng)1 h，4 ℃、15 000 r·min-1離心10 min，取適量上層溶液制成待測(cè)樣品。對(duì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），用Duncan 檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白含量

由表1可知，仿生酶解提取液中蛋白含量顯著高于其他工藝提取液，水提提取液和脫脂水提提取液的蛋白含量顯著低于其他提取液。

表1 寬體金線蛭提取物的蛋白含量Table 1 Protein content of the extract from W.pigra/（mg·mL-1）

2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）

由圖2可知，水提提取物和酸提提取物均存在大分子和小分子物質(zhì)。由圖3可知，粗酶酶解提取物和胰蛋白酶酶解提取物仍有少量的大分子物質(zhì)以及大部分小分子物質(zhì)。而胃蛋白酶酶解和仿生酶解已將大分子物質(zhì)酶解為小分子物質(zhì)，脫脂預(yù)處理并未影響提取物的蛋白分布。

圖2 水提組和酸提組的提取物SDS-PAGE結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE result of water extracts and acid extracts

圖3 酶解提取物的SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE result of enzymatic hydrolysis extract

2.3 抗凝血酶活性（AT）

由表2可知，脫脂胃蛋白酶酶解提取物的AT 顯著高于其他工藝提取物，胃蛋白酶、胰蛋白酶和仿生酶解提取物的抗凝血酶活性相近。胃蛋白酶酶解提取物與脫脂胃蛋白酶酶解提取物的APTT和TT顯著高于其他工藝提取物。脫脂加熱酸提和胃蛋白酶酶解提取物的PT 顯著高于其他工藝提取物。此外，由于酸提提取物pH值過(guò)低，無(wú)法進(jìn)行AT測(cè)定。

表2 寬體金線蛭提取物的抗凝活性Table 2 The anticoagulant activity of the extracts of W. pigra

2.4 纖溶活性

2.4.1 寬體金線蛭提取物對(duì)纖維蛋白原的纖溶活性 由表3可知，在相同劑量下（0.05 g·mL-1），只有酸提組和胃蛋白酶酶解組有纖溶活性，且酸提組的纖溶活性顯著高于胃蛋白酶酶解組。

表3 寬體金線蛭提取物的纖溶活性（纖維蛋白原）Table 3 Fibrinolytic activity（fibrinogen）of the extracts of W. pigra/mm2

2.4.2 相同生藥材在不同工藝下寬體金線蛭提取物的纖溶活性 采用相同生藥材量（0.1 g）的前提下，根據(jù)提取質(zhì)量計(jì)算提取物配置相應(yīng)的供試液，結(jié)果表明，胃蛋白酶酶解組提取物的纖溶活性顯著高于酸提組提取物（表4）。

2.4.3 寬體金線蛭提取物對(duì)纖維蛋白的纖溶活性 由表5可知，在相同劑量下，脫脂加熱水提物和脫脂仿生酶解物的纖溶活性顯著高于其他提取工藝提取物，脫脂胃蛋白酶酶解物次之。

表5 寬體金線蛭提取物的纖溶活性（纖維蛋白）Table 5 Fibrinolytic activity（fibrin）of the extracts of W. pigra/mm2

2.5 體外溶栓試驗(yàn)

由表6可知，采用中華鱉血構(gòu)建體外血栓模型，在相同劑量下，脫脂胃蛋白酶酶解、水提、脫脂水提、脫脂加熱水提、仿生酶解、脫脂仿生酶解和脫脂粗酶酶解提取物的血凝塊溶解率顯著高于酸提、脫脂酸提和脫脂加熱酸提提取物，其中，脫脂胃蛋白酶酶解提取物的血凝塊溶解率最高，脫脂酸提提取物最低。采用新西蘭兔血構(gòu)建體外血栓模型，在相同劑量下，脫脂加熱水提、脫脂水提提取物的血凝塊溶解率顯著高于酸提、脫脂酸提、脫脂加熱酸提、胃蛋白酶酶解、脫脂胃蛋白酶酶解、脫脂仿生酶解和粗酶酶解提取物。其中脫脂加熱水提提取物的血凝塊溶解率最高，脫脂水提提取物次之。

表6 寬體金線蛭提取物的體外溶栓活性Table 6 In vitro thrombolytic activity of the extracts of W. pigra

2.6 脫脂胃蛋白酶酶解物不同組分的抗凝活性和纖溶活性

2.6.1 脫脂胃蛋白酶酶解物不同組分的抗凝活性 由表7可知，分子量小于3 kDa 的組分AT 顯著高于其他組分，大于10 kDa、大于3 kDa 的組分顯著延長(zhǎng)了兔的ATPP，不同組分對(duì)兔的PT和TT無(wú)顯著影響。

表7 脫脂胃蛋白酶酶解物不同分子量組分抗凝活性比較Table 7 Comparison of anticoagulant activity of different molecular weight components in degreasing pepsin hydrolysate

2.6.2 脫脂胃蛋白酶酶解物不同組分的纖溶活性 由表8可知，通過(guò)測(cè)定脫脂胃蛋白酶酶解提取物不同組分的纖溶活性（0.1 g·mL-1）發(fā)現(xiàn)，分子量小于3 kDa的成分纖溶活性顯著高于分子量大于3 kDa 和10 kDa的成分，且顯著高于脫脂胃蛋白酶酶解物本身。

表8 脫脂胃蛋白酶酶解物不同分子量組分纖溶活性比較（纖維蛋白）Table 8 Comparison of fibrinolytic activity of different molecular weight components in degreasing pepsin hydrolysate（fibrin）/mm2

2.7 不同提取物對(duì)纖維蛋白原的作用

由圖4～7可知，水提提取物、脫脂水提提取物和脫脂加熱水提提取物均對(duì)纖維蛋白原的α肽鏈有溶解作用，但對(duì)纖維蛋白原β、γ 肽鏈無(wú)溶解作用。酸提提取物、脫脂酸提提取物和脫脂加熱酸提提取物對(duì)纖維蛋白原α、β、γ 肽鏈均無(wú)溶解作用。胃蛋白酶酶解物、脫脂胃蛋白酶酶解物、胰蛋白酶酶解物和脫脂胰蛋白酶酶解物對(duì)纖維蛋白原α、β、γ 肽鏈均無(wú)溶解作用。仿生酶解物和脫脂仿生酶解物對(duì)纖維蛋白原的α、β肽鏈有溶解作用，但對(duì)纖維蛋白原γ肽鏈無(wú)溶解作用，粗酶酶解物對(duì)纖維蛋白原的α 肽鏈有溶解作用，但對(duì)纖維蛋白原β、γ肽鏈無(wú)溶解作用。

圖4 水提提取物對(duì)纖維蛋白原的作用Fig.4 Effect of water extract on fibrinogen

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，不同提取工藝的寬體金線蛭提取物均具有抗凝活性，且對(duì)凝血的各個(gè)途徑均有所影響。其中脫脂胃蛋白酶酶解、胃蛋白酶酶解、胰蛋白酶酶解和仿生酶解提取物的抗凝活性高于其他工藝提取物。該結(jié)果與李濯冰等［23］的研究結(jié)果類似，即柳葉螞蟥的胃蛋白酶酶解提取物具有較強(qiáng)的抗凝血活性，可明顯延長(zhǎng)大鼠的凝血內(nèi)源性途徑。本試驗(yàn)中胃蛋白酶酶解提取物和脫脂胃蛋白酶酶解提取物的APTT和TT指標(biāo)顯著高于其他提取物，APTT 反映了凝血內(nèi)源性途徑，TT 反映了凝血共同途徑，說(shuō)明這兩種提取物通過(guò)內(nèi)源性途徑干擾凝血因子的激活，或者經(jīng)共同途徑抑制凝血酶的活性。另外，纖維蛋白原肽鏈N 末端的纖維肽A 和B 均為酸性肽，帶較多負(fù)電荷，在未凝血時(shí)由于同性電荷的排斥作用阻礙纖維蛋白原之間的聚合［8］。而胃蛋白酶酶解提取物和脫脂胃蛋白酶酶解提取物呈酸性，可能增強(qiáng)了纖維蛋白原之間同性電荷的排斥作用，從而促進(jìn)了抗凝血作用。除此以外，酸性過(guò)強(qiáng)也會(huì)導(dǎo)致凝血酶失活，并使纖維蛋白原變性，析出白色沉淀，之后再加入凝血酶也不具有凝固作用［9］。SDS-PAGE結(jié)果表明，胃蛋白酶解和仿生酶解之后的提取物中含有更多的小分子多肽，該提取物的抗凝血酶活性顯著高于其他提取物，表明小分子多肽對(duì)于抑制凝血酶活性具有重要作用。

圖5 酸提提取物對(duì)纖維蛋白原的作用Fig.5 Effect of acid extract on fibrinogen

從纖溶活性結(jié)果可知，除胰蛋白酶酶解提取物外，不同工藝的提取物均具有纖溶活性。酸提提取物和胃蛋白酶酶解提取物可能與纖溶酶作用類似［27］，也可能是提取物較強(qiáng)的酸性溶解了纖維蛋白原和纖維蛋白。水提組、仿生酶解組和粗酶酶解的提取物對(duì)纖維蛋白原的α 肽鏈有直接溶解作用，但對(duì)纖維蛋白原平板無(wú)纖溶作用，這一現(xiàn)象與譚赫等［27］的研究結(jié)果相一致。

圖6 胃蛋白酶酶解物、胰蛋白酶酶解物對(duì)纖維蛋白原的作用Fig.6 Effect of pepsin hydrolysate and trypsin hydrolysate on fibrinogen

圖7 仿生酶解酶解物、粗酶酶解酶解物對(duì)纖維蛋白原的作用Fig.7 Effect of biomimetic enzymatic hydrolysate and crude enzymatic hydrolysate on fibrinogen

相對(duì)其他提取物，水提、脫脂水提、脫脂加熱水提、仿生酶解和脫脂仿生酶解提取物均表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外溶栓活性，這與提取物對(duì)纖維蛋白的纖溶活性結(jié)果相一致。原因可能是脫脂提高了蛋白活性物質(zhì)的水解作用，在水解或酶解作用下釋放更多活性物質(zhì)。胰蛋白酶酶解組的溶栓活性可能通過(guò)抗凝血活性實(shí)現(xiàn)，而酸提組和胃蛋白酶酶解組的提取物可能通過(guò)抗凝血活性和類似纖溶酶的纖溶活性作用來(lái)溶解血栓。

動(dòng)物類藥材發(fā)揮作用的主要成分為小分子肽類［31］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脫脂胃蛋白酶酶解提取物的不同分子量成分均有抗凝纖溶活性，表明具有抗凝纖溶的成分并非是單一的物質(zhì)。通過(guò)分析指標(biāo)抗凝活性（AT），發(fā)現(xiàn)分子量小于3 kDa的組分AT值最大，纖溶活性結(jié)果也與AT保持一致。這與丁月珠等［32］關(guān)于胰蛋白酶酶解物的研究結(jié)果并不一致，該結(jié)果表明大于10 kDa的組分具有較好的抗凝活性，且主要對(duì)共同凝血途徑起作用。不相一致的原因較復(fù)雜，可能受到酶的種類和酶的用量影響。要明確分子量小于3 kDa 的組分的抗凝溶栓機(jī)制，則需進(jìn)一步分離純化。此外，本試驗(yàn)中大于10 kDa 的組分APTT 值最大，預(yù)示著該組分主要對(duì)內(nèi)源性凝血途徑起作用。

本試驗(yàn)中水提提取物、脫脂水提提取物和脫脂加熱水提提取物對(duì)纖維蛋白原的α 肽鏈具有溶解作用，但對(duì)β 和γ 鏈作用相對(duì)較弱。這與朱正光等［33］的研究結(jié)果相一致，該研究表明寬體金線蛭的水煎液可以水解纖維蛋白原，且主要以α肽鏈為主。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，寬體金線蛭的不同工藝提取物均具有抗凝溶栓的藥理作用，酶解提取物優(yōu)于水提提取物和酸提提取物，脫脂處理有利于活性物質(zhì)的提取，其中胃蛋白酶酶解提取物效果最佳，并且脫脂胃蛋白酶酶解物小分子多肽成分具有最佳的抗凝血酶活性和纖溶活性。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用寬體金線蛭的藥理作用提供了理論依據(jù)。