魷魚(yú)皮膠原蛋白肽的脫色及其對(duì)風(fēng)味影響的研究

王佳圓 馬佳雯 蔡金秀 曹少謙 戚向陽(yáng)，*

（1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100）

魷魚(yú)年產(chǎn)量高，分布廣泛［1］。魷魚(yú)在加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生包括頭、足、內(nèi)臟及表皮等廢棄物，其中魷魚(yú)皮占副產(chǎn)物加工量的8%～13%［2］，但大部分魚(yú)皮都被掩埋或丟棄，不僅造成資源的浪費(fèi)，還會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染［3］。現(xiàn)有研究表明，水產(chǎn)源膠原蛋白比陸生動(dòng)物源膠原蛋白具有更高的安全性［4］，且水產(chǎn)源膠原蛋白具有抗氧化［5］、降血壓［6］、抑制惡性腫瘤細(xì)胞活性［7］等生理活性。

目前開(kāi)發(fā)的許多魷魚(yú)皮膠原蛋白制品，如助消化藥物、添加劑等，風(fēng)味色澤較差，需進(jìn)一步進(jìn)行脫色等處理才能被廣泛應(yīng)用［8］。常用的脫色方法有雙氧水法、大孔樹(shù)脂吸附法和活性炭法等。雙氧水法操作簡(jiǎn)單，脫色效果好，但因較強(qiáng)的氧化作用，對(duì)樣品理化性質(zhì)影響大，如殘留物將會(huì)影響產(chǎn)品的品質(zhì)［9］。大孔樹(shù)脂具有吸附量大、機(jī)械強(qiáng)度高、安全可靠、可再生使用等優(yōu)點(diǎn)。鄭金娃等［10］利用不同樹(shù)脂對(duì)海參多肽酶解液脫色脫腥，發(fā)現(xiàn)樹(shù)脂D380 脫色效果良好，且具有一定的脫腥能力。活性炭吸附能力強(qiáng)，微孔數(shù)量多，不僅能高效地吸附酶解液的色素［11］，還可以通過(guò)去除水中的有機(jī)物從而達(dá)到除嗅、除味的效果［12］，已被廣泛用于水產(chǎn)品的脫色去腥［13］，但再生困難且蛋白損失率較高。因此，有必要篩選出最佳脫色劑，進(jìn)一步探究樣品脫色脫腥效果。

本研究以魷魚(yú)皮膠原蛋白肽為原料，探討不同顆粒活性炭及不同樹(shù)脂對(duì)魷魚(yú)皮酶解液的脫色效果，并采用電子鼻、電子舌、氨基酸分析、感官評(píng)價(jià)等對(duì)脫色前后的膠原蛋白肽風(fēng)味進(jìn)行分析，以期為魷魚(yú)皮高附加值產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)及膠原蛋白肽的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

魷魚(yú)皮，寧波水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)；堿性蛋白酶（2×106U·g-1）、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，北京索萊寶生物科技有限公司；粉狀活性炭（粒徑200 目）、顆粒狀活性炭（粒徑20 目），上海國(guó)藥化學(xué)試劑集團(tuán)；D4006（非極性）、D152（弱酸性陽(yáng)離子）、AB-8（弱堿性陰離子）、D3520（非極性）、D380（弱堿性陰離子），鄭州和成新材料科技有限公司；細(xì)胞色素C（MW12400）、抑酞菌（MW6500）、桿菌酶（MW1450）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW451）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW189），上海源葉生物科技有限公司；谷氨酸鈉、檸檬酸、鹽酸-奎寧、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇（分析純），上海國(guó)藥化學(xué)試劑集團(tuán)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

101-2 -BS 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；UV-1750紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；Multiskan FC 酶標(biāo)儀，美國(guó)賽默飛公司；SCIENTZ-10N 冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；L-8900 全自動(dòng)氨基酸分析儀，日本日立公司；Waters e2695 型高效液相色譜儀，美國(guó)Waters 公司；PEN3便攜式電子鼻，德國(guó)Airsense 公司；ASTREE 電子舌，法國(guó)Alpha MOS公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魷魚(yú)皮膠原蛋白肽的制備 將10 g 魷魚(yú)皮與蒸餾水按1∶5 的料液比混合均勻，加入堿性蛋白酶2 555 U·g-1（0.012 8 g），在pH 值9.0、50 ℃條件下水浴酶解4.6 h，沸水鈍酶10 min 后，冰浴冷卻，8 000 r·min-1離心15 min，取上清液并定容至100 mL，得到魷魚(yú)皮膠原蛋白酶解液。

1.3.2 脫色工藝優(yōu)化

1.3.2.1 脫色材料篩選 樹(shù)脂靜態(tài)脫色試驗(yàn)：取20 mL魷魚(yú)皮酶解液倒入燒杯中，加入5%（w/v）經(jīng)預(yù)處理的5種樹(shù)脂D4006、D152、AB-8、D3520、D380，室溫下脫色1 h后，過(guò)濾，濾液用蒸餾水定容至25 mL，測(cè)定脫色率及蛋白損失率。

活性炭靜態(tài)脫色試驗(yàn)：將20 mL 魷魚(yú)皮酶解液置于50 mL 燒杯中，加入0.5%（w/v）的粉狀活性炭及顆粒狀活性炭，室溫下脫色30 min，過(guò)濾，濾液用蒸餾水定容至25 mL，測(cè)定脫色率及蛋白損失率。

1.3.2.2 活性炭脫色單因素試驗(yàn) 取20 mL 魷魚(yú)皮酶解液于燒杯中，加入粉狀活性炭脫色后，過(guò)濾，濾液用蒸餾水定容至25 mL，測(cè)定脫色率及蛋白損失率。分別考察粉狀活性炭添加量（0.05%～0.30%）、脫色時(shí)間（10～60 min）、脫色溫度（10～60 ℃）和溶液pH 值（1～6）對(duì)魷魚(yú)皮酶解液脫色效果的影響。

1.3.2.3 脫色正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取溶液pH值（A）、添加量（B）、脫色溫度（C）、脫色時(shí)間（D）進(jìn)行三因素四水平的正交試驗(yàn)L9（34），以脫色率和蛋白損失率綜合評(píng)定脫色效果。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Orthogonal test factor and level table

1.3.3 脫色率的測(cè)定 將制得的魷魚(yú)皮膠原蛋白酶解液用不同脫色劑進(jìn)行脫色，采用分光光度法測(cè)定脫色前后溶液在362 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值。按公式（1）計(jì)算膠原蛋白肽脫色率［14］：

式中，A：脫色率，%；A1：脫色前酶解液在362 nm波長(zhǎng)處的吸光度值；A2：脫色后上清液在362 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值。

1.3.4 蛋白損失率的測(cè)定 利用BCA試劑盒測(cè)定膠原蛋白酶解液脫色前后蛋白含量的變化。按照公式（2）計(jì)算蛋白損失率：

式中，W：蛋白損失率，%；W1：脫色前酶解液中蛋白含量，mg·mL-1；W2：脫色后酶解液中蛋白含量，mg·mL-1。

1.3.5 膠原蛋白肽分子量分布測(cè)定 利用高效液相色譜儀測(cè)定膠原蛋白肽分子量分布，并用GPC 軟件對(duì)其分子量分布進(jìn)行分析。色譜柱為TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；流動(dòng)相∶乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1（V/V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：UV220 nm；流速：0.5 mL·min-1；柱溫：30 ℃。稱取細(xì)胞色素C（MW12400）、桿菌酶（MW1450）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW451）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW189）標(biāo)準(zhǔn)品，用流動(dòng)相溶解配制成0.2 mg·mL-1左右的標(biāo)準(zhǔn)分子量溶液。

1.3.6 游離氨基酸組成分析 根據(jù)文獻(xiàn)［15］進(jìn)行樣品前處理，取最佳制備條件下魷魚(yú)皮酶解液凍干粉1 g，用50 mL 0.04 mol·L-1鹽酸浸提30 min，搖勻后過(guò)濾。取2 mL上清液于離心管中，加入8%磺基水楊酸2 mL，混勻，靜置15 min，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，過(guò)0.22μm膜后用全自動(dòng)氨基酸分析儀進(jìn)行分析。

1.3.7 電子鼻分析 準(zhǔn)確吸取最佳制備條件下的魷魚(yú)皮酶解液5 mL，置于20 mL頂空瓶中，密封后于50 ℃水浴鍋中加熱15 min，取出后將針頭插入頂空瓶上端進(jìn)行檢測(cè)，信號(hào)采集時(shí)間為120 s，每采樣1 次，通過(guò)跑空瓶的形式對(duì)進(jìn)樣通道進(jìn)行清洗，降低對(duì)下一樣品的影響。每個(gè)樣品重復(fù)3次。不同傳感器對(duì)應(yīng)了不同的物質(zhì)類別［16］，組成電子鼻傳感器陣列的10 個(gè)金屬氧化物傳感器的敏感物質(zhì)及其檢測(cè)限見(jiàn)表2。

表2 PEN2電子鼻傳感器陣列及其性能特點(diǎn)Table 2 Electronic nose sensor array and its performance characteristics

1.3.8 魷魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫苦前后滋味感官分析 選取谷氨酸鈉、檸檬酸、鹽酸-奎寧、NaCl、蔗糖分別作為鮮、酸、苦、咸、甜的標(biāo)準(zhǔn)品［17］，對(duì)應(yīng)的濃度及分值如表3所示。選取10名經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的感官品評(píng)員進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。感官評(píng)價(jià)之前無(wú)辛辣刺激食品攝入，且不能使用香水化妝品等物品。每種味道由低濃度標(biāo)準(zhǔn)品至高濃度標(biāo)準(zhǔn)品順序進(jìn)行感官評(píng)定，每次評(píng)定后均用水漱口，口中無(wú)異味后再品嘗下一個(gè)樣品。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)應(yīng)的分值對(duì)樣品進(jìn)行對(duì)照打分，得到樣品的分值。

表3 不同濃度滋味標(biāo)準(zhǔn)品評(píng)分值Table 3 Standard taste evaluation scores of different concentrations

1.3.9 電子舌分析 本試驗(yàn)所用電子舌能直接檢出鮮、酸、苦、咸的響應(yīng)值，以谷氨酸鈉、檸檬酸、鹽酸奎寧、NaCl為標(biāo)準(zhǔn)品用蒸餾水配置成不同濃度梯度［18］。取脫色前后的魷魚(yú)皮酶解液和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品15 mL于樣品杯中，室溫下進(jìn)行電子舌檢測(cè)，每個(gè)樣品測(cè)定4個(gè)平行值，取后3次測(cè)定數(shù)值進(jìn)行分析，檢測(cè)期間設(shè)定采樣時(shí)間為120 s，清洗時(shí)間10 s，每次檢測(cè)完畢后均進(jìn)行清洗。測(cè)定前儀器需經(jīng)活化、自檢和校準(zhǔn)等程序，確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

電子鼻數(shù)據(jù)采用PEN3-Win Muster 數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行主成分分析（principal compcnent analysis，PCA）；采用SPSS 17.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA），顯著性檢驗(yàn)方法為Duncan 多重檢驗(yàn)，顯著水平為P＜0.05，使用GraphPad Prism及Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫色材料篩選結(jié)果

由圖1可知，以脫色率為指標(biāo)，粉狀活性炭脫色效果最佳，脫色率達(dá)到81.20%。根據(jù)蛋白損失率，樹(shù)脂D152蛋白損失率最低，為1.27%，但脫色率僅達(dá)到8.34%。所測(cè)試的樹(shù)脂中，脫色效果最好的為樹(shù)脂D380，脫色率為32.17%。D380、AB-8 為陰離子交換樹(shù)脂，脫色率高于其余陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和非極性樹(shù)脂，可能是因?yàn)槊附庖褐嘘庪x子型色素占比較高。極性樹(shù)脂AB-8與D380 的脫色率大于非極性樹(shù)脂D4006 和D3520，可能是因?yàn)槊附庖褐械纳囟酁闃O性分子。綜合考慮脫色率及蛋白損失率，最后選用粉狀活性炭作為魷魚(yú)皮酶解液的脫色劑。

圖1 脫色劑對(duì)膠原肽脫色率和蛋白損失率的影響Fig.1 Effect of decolorant on decolorization rate and protein loss rate of collagen peptide

2.2 活性炭脫色工藝的優(yōu)化

2.2.1 pH值的影響 由圖2可知，隨著pH值的升高，魷魚(yú)皮酶解液的脫色率與蛋白損失率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在酸性較高的條件下脫色率較高，當(dāng)pH值在2以下時(shí)脫色率達(dá)到87.17%，之后隨pH值上升，脫色率呈下降趨勢(shì)，表明脫色率與H+濃度有關(guān)［19］。為了避免pH值過(guò)低導(dǎo)致膠原蛋白肽的損失，選擇pH值為2。

圖2 pH值對(duì)膠原肽脫色率和蛋白損失率的影響Fig.2 Effect of pH value on decolorization rate and protein loss rate of collagen peptide

2.2.2 活性炭添加量的影響 由圖3可知，當(dāng)活性炭添加量由0.05%增加到0.30%時(shí)，魷魚(yú)皮酶解液的脫色率由56.91%提高到82.32%，蛋白損失率也由25.93%上升至36.22%，該結(jié)果與李秉潤(rùn)等［20］利用活性炭對(duì)水蛭酶解液脫腥脫色的研究結(jié)果一致，隨著活性炭添加量的增加，蛋白損失率逐漸增加。為了減少多肽損失，選擇活性炭添加量為0.15%。

圖3 活性炭添加量對(duì)膠原肽脫色率和蛋白損失率的影響Fig.3 Effect of activated carbon content on decolorization rate and protein loss rate of collagen peptide

2.2.3 脫色時(shí)間的影響 由圖4可知，膠原蛋白肽脫色率與蛋白損失率均隨脫色時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)脫色時(shí)間大于30 min時(shí)，脫色率趨于穩(wěn)定，蛋白損失率略有上升。

圖4 脫色時(shí)間對(duì)膠原肽脫色率和蛋白損失率的影響Fig.4 Effect of decolorizing time on decolorization rate and protein loss rate of collagen peptide

2.2.4 脫色溫度的影響 由圖5可知，當(dāng)溫度從10 ℃上升到60 ℃時(shí)，魷魚(yú)皮膠原蛋白肽的脫色率由62.12%上升至77.57%。綜合考慮脫色率及蛋白損失率，選擇溫度為30 ℃。

圖5 脫色溫度對(duì)膠原肽脫色率和蛋白損失率的影響Fig.5 Effects of decolorizing temperature on decolorization rate and protein loss rate of collagen peptide

2.2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果 粉狀活性炭脫色效果優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4～6。通過(guò)極差分析可知，各因素對(duì)脫色率及蛋白質(zhì)損失率的影響大小次序?yàn)锽＞A＞C＞D，即活性炭添加量＞pH值＞脫色溫度＞脫色時(shí)間。以脫色率為依據(jù)，脫色效果最佳的組合是A1B3C3D3，即pH 值1、活性炭添加量0.2%、脫色溫度40 ℃、脫色時(shí)間40 min。以蛋白損失率為依據(jù)，脫色效果最佳的組合是A1B1C1D1，即pH 值1、活性炭添加量0.1%、脫色溫度20 ℃、脫色時(shí)間20 min。綜合分析脫色率及蛋白損失率，活性炭最佳脫色工藝為A2B1C2D2，即pH 值2、活性炭添加量0.1%、脫色溫度30 ℃、脫色時(shí)間30 min。進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)表明，在該條件下，活性炭的脫色率達(dá)到82.91%±0.05%，蛋白回收率達(dá)到75.82%±0.17%，樣品得率為72.32%±0.16%。

表4 活性炭脫色正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal test for decolorization of activated carbon

表5 脫色率方差分析Table 5 Variance analysis of decolorization rate

表6 蛋白質(zhì)損失率方差分析Table 6 Analysis of variance of protein loss rate

2.3 脫色前后膠原蛋白肽的分子量分布

由圖6和表7可知，魷魚(yú)皮膠原蛋白肽經(jīng)粉狀活性炭脫色后分子量分布與脫色前相比差異不大。脫色后分子量小于180 Da 的肽占比下降幅度最大，下降了3.14 個(gè)百分點(diǎn)，分子量小于500 Da 的肽占比共下降4.79 個(gè)百分點(diǎn)，可能是因?yàn)榉蹱罨钚蕴吭谖缴氐耐瑫r(shí)，溶液中的氨基酸類、二肽及三肽也部分被吸附［21］。此外，脫色后分子量大于2 000 Da的肽占比也有所下降，而分子量在500～1 000 Da的肽占比增幅較大，達(dá)到了4.69個(gè)百分點(diǎn)，分子量在500～2 000 Da的肽占比共增加了6.14個(gè)百分點(diǎn)。脫色前后分子量小于1 000 Da的膠原蛋白肽所占比例分別為79.47%、79.37%，無(wú)顯著差異（P＞0.05）。表示脫色過(guò)程中主要損失了分子量小于500 Da 及大于2 000 Da 的魷魚(yú)皮膠原蛋白肽，Ajibola等［22］研究發(fā)現(xiàn)分子量小于1 000 Da肽的抗氧化活性高于分子量大于1 000 Da的肽；也有文獻(xiàn)報(bào)道，相對(duì)于氨基酸及大分子多肽，寡肽（＞四肽）對(duì)維持腸道健康和功能具有重要作用，且可以作為生理活性物質(zhì)被直接吸收［23］。因此，可推測(cè)脫色工藝對(duì)于活性較高的膠原蛋白肽影響較少。

表7 脫色前后膠原蛋白肽分子質(zhì)量分布Table 7 Molecular weight distribution of the decolorized and non-decolorized squid skin collagen peptides

圖6 魷魚(yú)皮膠原蛋白肽凝膠色譜圖Fig.6 Gel chromatogram of collogen peptide of squid skin

2.4 脫色前后膠原蛋白肽的氨基酸組成

由表8可知，魷魚(yú)皮膠原蛋白肽共檢出20 種游離氨基酸，其中鮮味2種、甜味5種、苦味9種以及無(wú)味氨基酸4種［24］。脫色后魷魚(yú)皮酶解液中的游離氨基酸含量降低了2.02 mg·g-1，呈味氨基酸含量降低了0.89 mg·g-1，但呈味氨基酸（delicious amino acid，DAA）占總游離氨基酸（total free amino acid，TFAA）的比例上升了1.75 個(gè)百分點(diǎn)。谷氨酸（Glu）是酶解液的主要鮮味氨基酸，脫色后樣品的鮮味氨基酸占比由10.21%上升至13.12%；此外，脫色前后甜味氨基酸占比無(wú)明顯差異，分別為12.99%和13.73%，其中丙氨酸（Ala）占比最高。脫色后酶解液的苦味氨基酸占比由71.50%下降至67.72%，其中酪氨酸（Tyr）是主要的苦味氨基酸，脫色后由16.81%降至14.24%。表明脫色可有效改善酶解液的風(fēng)味，具有一定的脫苦作用，并提升鮮味。

表8 脫色工藝對(duì)膠原肽游離氨基酸含量的影響Table 8 Effect of decolorization process on free amino acid content of collagen peptide

味道強(qiáng)度值（taste active value，TAV）表示各個(gè)呈味物質(zhì)的含量與其閾值的比。當(dāng)TAV＞1時(shí)，表明該物質(zhì)對(duì)樣品呈味貢獻(xiàn)大；當(dāng)TAV＜1時(shí)，表明該物質(zhì)對(duì)樣品幾乎沒(méi)有呈味貢獻(xiàn)［25］。酶解液脫色前TAV最大的為蛋氨酸（Met），為12.10，其次為Glu，其TAV為11.10，表明苦味氨基酸和鮮味氨基酸對(duì)樣品整體滋味呈味具有重要貢獻(xiàn)。脫色后，Glu的TAV上升至15.17，成為最主要呈味氨基酸，而Met的TAV由12.10下降至11.40，進(jìn)一步表明脫色可使主要的苦味氨基酸呈味貢獻(xiàn)下降，鮮味氨基酸呈味貢獻(xiàn)上升，酶解液風(fēng)味得到一定程度的提升。

2.5 脫色前后膠原蛋白肽的電子鼻分析

PCA分析是將提取的傳感器響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和降維，并對(duì)降維后的特征向量進(jìn)行線性分類處理，其總貢獻(xiàn)率越大（＞75%），檢測(cè)數(shù)據(jù)的信息反映越好［26］。圖7為脫色前后酶解液電子鼻響應(yīng)信號(hào)的PCA 分析結(jié)果，酶解液脫色前后的響應(yīng)值沒(méi)有重疊區(qū)域，區(qū)分度較好，PC1和PC2的貢獻(xiàn)率分別為96.38%和3.44%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)99.82%，各組樣品的數(shù)據(jù)點(diǎn)按其類別對(duì)應(yīng)聚類，且兩兩之間能實(shí)現(xiàn)較好地區(qū)分，說(shuō)明這兩個(gè)主成分幾乎包含了樣品的所有信息，可用來(lái)代表魷魚(yú)皮酶解液中揮發(fā)性物質(zhì)的整體信息，該結(jié)果表明脫色前后魷魚(yú)皮酶解液的氣味相互獨(dú)立。

圖7 魷魚(yú)皮酶解液電子鼻響應(yīng)值的PCA分析Fig.7 PCA analysis of electronic nose response of enzymatic hydrolysate of squid skin

圖8為魷魚(yú)皮酶解液揮發(fā)性成分的電子鼻載荷分析。脫色前后累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了99.99%，基本涵蓋了樣品的所有信息。魷魚(yú)皮酶解液脫色后，第1 主成分（PC1）貢獻(xiàn)率最大的成分由R7（硫）變成了R2（氮氧化物）；第2 主成分（PC2）貢獻(xiàn)率最大的成分由R2（氮氧化物）變成了R7（硫），表明脫色后氮氧化物類揮發(fā)性成分對(duì)氣味的貢獻(xiàn)最大，硫化類（硫化氫等）揮發(fā)性成分對(duì)氣味的貢獻(xiàn)率變小。綜上所述，魷魚(yú)皮酶解液脫色前后氣味發(fā)生了明顯變化，且脫色后風(fēng)味得到一定程度的改善。

圖8 魷魚(yú)皮酶解液風(fēng)味LOADINGS分析Fig.8 Aroma LOADINGS analysis of squid skin enzymatic hydrolysate

2.6 脫色前后膠原蛋白肽的感官評(píng)價(jià)分析

以鮮、酸、苦、咸、甜標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)脫色前后的魷魚(yú)皮酶解液進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖9所示。魷魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液以苦咸味為主，經(jīng)活性炭脫色處理后，魷魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液的苦味顯著下降（P＜0.05），鮮、酸及咸味顯著上升（P＜0.05），甜味無(wú)顯著變化，表明活性炭處理對(duì)魷魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液有一定的脫苦效果。

圖9 魷魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液滋味感官評(píng)分Fig.9 Sensory taste score of squid skin enzymatic hydrolysate

2.7 脫色前后膠原蛋白肽的電子舌分析

由圖10可知，脫色前后PC1 和PC2 貢獻(xiàn)率分別為70.26%和13.30%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為83.56%，表明PC1、PC2 包含了大量樣品原始數(shù)據(jù)，可以整體反應(yīng)樣品信息［27］。判別指數(shù)（discrimination index，DI）是區(qū)分樣品之間差異的表征值［28］。本試驗(yàn)DI為95.95，表明樣品之間區(qū)分度大。不同樣品之間滋味差異可以通過(guò)樣品在主成分分析圖中的距離遠(yuǎn)近來(lái)表征［29］。魷魚(yú)皮膠原蛋白肽酶解液脫色前后樣品位于主成分分析圖中不同區(qū)域，不重疊，且距離較遠(yuǎn)，表明脫色前后樣品滋味差異較大。

圖10 魷魚(yú)皮酶解液滋味主成分分析Fig.10 Principal component analysis of taste of enzymatic hydrolysate of squid skin

主成分分析中，可根據(jù)樣品落點(diǎn)的區(qū)域及樣品間的距離來(lái)判斷樣品之間的相似性，本研究樣品所在區(qū)域表明該標(biāo)準(zhǔn)品滋味屬性，樣品之間距離越近表明滋味屬性越相似。圖11為魷魚(yú)皮酶解液脫色前后不同滋味的主成分分析圖。鮮、酸、苦、咸不同滋味的主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率分別為81.76%、80.26%、88.56%、81.99%，表明第1和第2主成分能夠代表大部分的原始數(shù)據(jù)信息。DI 值分別為99.83、99.78、98.59、99.83，表明電子舌能較好地區(qū)分脫色前后魷魚(yú)皮酶解液的滋味。脫色前后樣品整體風(fēng)味無(wú)交疊，區(qū)分效果好。根據(jù)每種滋味對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度［30］，可見(jiàn)鮮味、酸味、咸味有不同程度的提升，苦味下降。表明魷魚(yú)皮酶解液經(jīng)脫色工藝優(yōu)化后風(fēng)味有明顯提升，主要表現(xiàn)為鮮味、酸味、咸味加強(qiáng)，苦味減弱。綜合電子鼻和感官評(píng)定分析可知，魷魚(yú)皮酶解液脫色前后風(fēng)味有明顯差別，脫色的同時(shí)明顯改善了酶解液的風(fēng)味，有助于魷魚(yú)皮酶解液后續(xù)的加工及應(yīng)用。

圖11 魷魚(yú)皮酶解液不同滋味的主成分分析Fig.11 Principal component analysis of different tastes of enzymatic hydrolysate of squid skin

3 討論

膠原蛋白肽是以膠原蛋白為原料，利用化學(xué)、物理方法或者生物酶法降解得到的產(chǎn)物，具有廣泛的生物活性［31］。早期有研究者發(fā)現(xiàn)蛋白酶解液具有苦味，且水產(chǎn)源蛋白酶解液依舊存在腥味［32］，為掩蓋不良?xì)馕叮梢酝ㄟ^(guò)選擇分離法［33］、掩蓋法［34］、酶解法［35］等方法脫腥脫苦提升產(chǎn)品品質(zhì)，而活性炭法作為選擇分離法是較為常見(jiàn)的脫色方式［36］。本研究比較不同脫色劑效果，發(fā)現(xiàn)粉狀活性炭脫色率最佳，與前人研究結(jié)果類似［37-38］，可能是由于粉狀活性炭微孔數(shù)量多，比表面積大，從而能夠快速且高效地吸附蛋白酶解液色素分子［39］。

本研究通過(guò)高效液相色譜分析樣品脫色前后的分子量分布，發(fā)現(xiàn)樣品脫色前后分子量分布差異不大，可能是由于活性炭脫色是通過(guò)范德華力和靜電作用吸附色素［40］，未破壞化學(xué)鍵，從而較好地保持了樣品中多肽的結(jié)構(gòu)［41］。此外，脫色后樣品分子量小于500 Da和大于2 000 Da 的肽占比有所減少，這可能是由于粉狀活性炭是疏水性吸附劑，易吸附分子量偏小的芳香族氨基酸、色素和其他分子量偏大的小肽［42］。氨基酸作為重要的呈味物質(zhì)，有助于滋味的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，脫色前后甜味氨基酸占比幾乎無(wú)差異，苦味氨基酸占比降低，這可能是由于添加活性炭不影響含羥基和烷基的中性氨基酸（Thr、Ser 和Gly、Ala）和部分堿性氨基酸（Lys），易吸附芳香基氨基酸（Tyr 和Phe）、含硫氨基酸（Met）和堿性氨基酸（His 和Arg）［43］。電子鼻試驗(yàn)結(jié)果表明樣品脫色前后氣味完全不同，且脫色后氮氧化物類揮發(fā)性成分代替硫化類（硫化氫等）揮發(fā)性成分對(duì)氣味的貢獻(xiàn)最大，這與常鈺菲［44］、錢琴蓮等［45］的研究結(jié)果一致。感官評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果表明樣品脫色處理后苦味下降，甜味基本無(wú)變化，而其余風(fēng)味有不同程度提升。電子舌分析也表明脫色前后膠原蛋白肽風(fēng)味差異明顯，脫色后的膠原蛋白肽苦味明顯下降，鮮味、酸味、咸味都有不同程度提升。表明活性炭能有效改善酶解液的風(fēng)味，主要?dú)w因于粉末狀活性炭具有有效面積大、微孔數(shù)量多、吸附性能好等特點(diǎn)，能夠在一定程度上減少色素以及魚(yú)腥味等揮發(fā)性物質(zhì)，從而有效改善產(chǎn)品風(fēng)味［46］。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，粉狀活性炭對(duì)魷魚(yú)皮酶解液脫色脫苦效果最好，最佳工藝條件為：pH 值2.0，活性炭添加量0.1%，脫色溫度30 ℃，脫色時(shí)間30 min，在該工藝條件下的脫色率為82.91%，蛋白回收率達(dá)到75.82%。通過(guò)凝膠色譜、游離氨基酸、電子鼻、電子舌及感官評(píng)定分析表明，脫色前后膠原蛋白肽的分子量分布差異不大，但脫色前后魷魚(yú)皮酶解液的風(fēng)味明顯不同，苦味得以改善。綜上所述，粉狀活性炭脫色工藝可有效改善魷魚(yú)皮酶解液的風(fēng)味，提高魚(yú)膠原蛋白肽產(chǎn)品品質(zhì)。而脫色處理對(duì)其生物活性及功能特性的影響還有待進(jìn)一步研究。