白頭翁皂苷B4和PD-L1 siRNA共遞送cRGD修飾靶向脂質體的制備及體外細胞攝取研究 Δ

萬安平 ，張婧 ，周雄 ，馮育林 ，劉駿 ，何瑤 ， ，李翔 （.江西中醫藥大學中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，南昌 330006；.江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌 330004）

白頭翁始載于《神農本草經》，為毛茛科植物白頭翁Pulsatilla chinensis（Bunge） Regel的干燥根[1]。白頭翁皂苷B4（anemoside B4，AB4）是白頭翁中的五環三萜皂苷成分之一，具有抗腫瘤、調節免疫等藥理作用[2]。然而AB4為水溶性藥物，在血漿中的半衰期短、代謝快，在腫瘤部位的富集量較少，這在一定程度上限制了其應用[3]。程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）是一種在腫瘤表面大量表達的免疫抑制分子，阻斷免疫檢查點PD-L1/程序性死亡蛋白1（programmed death-1，PD-1）可以抑制癌細胞的激活，進而提高腫瘤免疫治療的效應[4]。小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）是一種長度為21～25 bp的雙鏈RNA，其可通過RNA干擾作用沉默相關基因來達到治療疾病的作用[5]。PD-L1 siRNA（簡稱為“siP”）可通過誘導內源性mRNA降解來下調腫瘤細胞中PD-L1的水平，從而激活T淋巴細胞的抗腫瘤免疫活性[6]。但是游離siP的穩定性差，難以穿透生物屏障，且靶向遞送效率低[7]。因此，設計一種可實現靶向遞送siP的有效載體具有重要意義。

脂質體是目前研究最多、應用最廣的遞送系統，可改善藥物的穩定性[8]。將AB4和siP共同包載于脂質體囊泡中，有望延長其在體內的循環時間，從而提高其在腫瘤組織的分布。環精氨酰甘氨酸天冬氨酸序列[cyclo（Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys），cRGD]是一種可與αβ整合素受體結合的環肽[9]，而αvβ3整合素受體在非小細胞肺癌的腫瘤組織和腫瘤血管細胞表面高度表達[10]。因此，本研究首先將AB4和siP共裝載于脂質體中，然后利用cRGD可與αvβ3整合素受體結合的優勢，對脂質體進行修飾，制備AB4和siP共遞送cRGD修飾靶向脂質體（AB4/siP-c-L），以提高脂質體的腫瘤主動靶向性，為其后續抗腫瘤研究奠定基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有Gallios型流式細胞儀（美國Beckman公司），JEM-2100型高分辨率透射電子顯微鏡（日本Jeol公司），Chemi Doc XRS型凝膠成像儀、Mini-Sub Cell GT Cell小型水平電泳槽（美國Bio-Rad公司），LSM-710型共聚焦激光掃描顯微鏡（德國Zeiss公司），ABI 7500型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Applied Biosystems公司），LC-20AT型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），HC-3018R型高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），Nano ZS型粒度測定儀（英國Malvern公司）。

1.2 主要藥品與試劑

AB4原料藥（批號2018042505，純度＞98.0%）購自江西本草天工科技股份有限公司；熒光染料Alexa Fluor 647標記的siP（siP647）、熒光染料FAM標記的siP（siPFAM）、陰性對照siRNA均購自廣州銳博生物技術有限公司；氫化大豆磷脂酰膽堿（HSPC）、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG 2000）均購自德國Lipoid GmbH公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-cRGD（DSPE-PEG 2000-cRGD）購自西安瑞禧生物科技有限公司；（1，2-二油酰基-丙基）-三甲基銨-氯鹽（DOTAP）及高純度膽固醇均購自艾偉拓（上海）醫藥科技有限公司；4＇，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購自武漢博士德生物工程有限公司；RPMI 1640培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、0.25%胰酶均購自德國Gibco公司；瓊脂糖購自北京亞米生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.3 細胞

小鼠Lewis肺癌細胞LLC購自美國菌種保藏中心。

2 方法和結果

2.1 脂質體的制備

（1）采用乙醇注入法制備cRGD修飾的AB4靶向脂質體（AB4-c-L）[11]。將AB4溶于乙醇中得到濃度為16 mmol/L的AB4乙醇溶液，將HSPC、DOTAP、膽固醇、DSPE-PEG 2000-cRGD、DSPE-PEG 2000（物質的量之比為8.3∶25∶7.2∶0.1∶0.9）溶于上述AB4乙醇溶液中，超聲（60 ℃，50 kHz，5 min）使其完全溶解，然后緩慢注入到2 mL 5%葡萄糖溶液中，60 °C水化1 h，探頭超聲（300 W，10 min）。將所得納米混懸液置于透析管中，在5%葡萄糖溶液中透析4 h，經0.45 μm濾膜過濾，收集濾液，即得AB4-c-L。（2）將DSPE-PEG 2000-cRGD替換為DSPE-PEG 2000，同法操作制備未經cRGD修飾的載AB4脂質體（AB4-L）。（3）將所得AB4-c-L與20 nmol/L的siP等體積混合，室溫孵育30 min，通過靜電吸附得到AB4/siP-c-L。（4）使用 siP647、siPFAM代替 siP，同法制備AB4/siP647-L、AB4/siP647-c-L和AB4/siPFAM-c-L。

2.2 AB4/siP-c-L的表征

2.2.1 粒徑和Zeta電位測定 分別取AB4-L、AB4-c-L和AB4/siP-c-L混懸液各100 μL，用5%葡萄糖溶液稀釋至2 mL，混勻，采用激光散射粒徑測定儀測定其粒徑及Zeta電位。每個樣品平行測定3次。結果顯示，AB4-L、AB4-c-L、AB4/siP-c-L的平均粒徑分別為（180.6±0.3）、（190.7±1.2）、（187.4±3.1） nm，Zeta電位分別為（51.4±1.3）、（49.2±1.2）、（33.5±1.4） mV。

2.2.2 形態觀察 將AB4/siP-c-L混懸液稀釋適當倍數后，取適量滴加于銅網上，靜置5 min，用2%磷鎢酸染色10 min，晾干，置于透射電子顯微鏡下觀察。結果顯示，AB4/siP-c-L呈類球形，分散良好。結果見圖1。

圖1 AB4/siP-c-L的透射電鏡圖

2.2.3 AB4包封率和含量測定 采用高效液相色譜法測定AB4含量。色譜柱為Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-水（8∶17，V/V），柱溫為25 ℃，檢測波長為201 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL。經方法學考察，結果符合2020年版《中國藥典》（四部）通則要求[12]。

通過超濾離心法測定脂質體對AB4的包封率[13]。將400 μL AB4/siP-c-L混懸液置于Ultra-4超濾離心管（截留分子量為10 kDa）中，以10 000 r/min離心15 min，收集濾液；取濾液按上述色譜條件進樣測定，得到脂質體中游離AB4的含量（Mfree）。取400 μL AB4/siP-c-L混懸液V脂質體，用甲醇稀釋至2 mL，然后按上述色譜條件進樣測定，得到脂質體中AB4的總量（Mtotal）。通過下列公式分別計算脂質體中AB4的包封率和藥物含量：包封率（%）＝（Mtotal-Mfree）/Mtotal×100%；藥物含量＝（Mtotal-Mfree）/V脂質體。結果顯示，AB4在AB4/siP-c-L中的包封率為（95.2±0.4）%，含量為（1.0±0.2） mg/mL。

2.2.4 siP包裹能力考察 采用瓊脂糖凝膠電泳法考察脂質體對siP的包裹能力。將AB4-c-L與20 nmol/L siP混合，使得AB4-c-L混懸液中DOTAP的氮（N）與siP中的磷（P）的物質的量之比為10∶1，室溫孵育30 min，作為樣品；以等量的游離siP（20 nmol/L）和AB4-c-L混懸液作為陰性對照樣品，同法操作。將上述樣品分別與上樣緩沖液混合，依次上樣進行瓊脂糖凝膠電泳（電壓75 mV，時間60 min），于凝膠成像系統中成像。結果顯示，當AB4-c-L中N和P的物質的量之比為10∶1時，電泳條帶消失，提示AB4-c-L可將siP完全包裹。結果見圖2。

圖2 AB4/siP-c-L對siP的包裹能力考察的電泳圖

2.2.5 血清穩定性考察 將AB4/siP-c-L與FBS等體積混合，在37 ℃孵育，分別在0、1、2、4、8、12、24 h時取出24 μL的AB4/siP-c-L于離心管中，向離心管中加入6 μL上樣緩沖液，渦旋混勻，作為待測樣品；以等量的游離siP（20 nmol/L）作為陰性對照樣品，同法操作。將上述樣品分別上樣至1.2%的瓊脂糖凝膠各泳道中，設置電泳參數為電壓75 mV、時間60 min，采用凝膠成像系統成像。結果顯示，游離的siP在FBS中2 h后開始降解（條帶顏色變淺），且時間越長，降解越完全；而AB4/siP-c-L在FBS中8 h后仍存在，表明AB4/siP-c-L能提高siP在血清中的穩定性。結果見圖3。

圖3 AB4/siP-c-L血清穩定性考察的電泳圖

2.2.6 體外釋放行為考察 采用透析袋擴散法考察AB4/siP-c-L的體外釋放行為。分別取適量的AB4溶液和AB4/siP-c-L混懸液，置于截留分子量為10 kDa的透析袋中，然后將透析袋分別置于100 mL不同pH（pH7.4、6.0、5.0）的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，于37 ℃、150 r/min條件下考察AB4/siP-c-L中AB4在PBS中的釋放行為。分別于 0.5、1、2、4、8、12、24、48 h時取樣，同時補充相同溫度和相同體積的釋放介質，按“2.2.3”項下方法測定釋放介質中AB4的含量。每個時間點平行測定3次。以釋放時間為橫坐標、AB4累積釋放率為縱坐標繪制釋放曲線，結果見圖4。如圖4所示，與AB4溶液相比，AB4/siP-c-L中AB4在不同pH條件下均未見明顯突釋，說明AB4/siP-c-L具有緩釋作用。同時，AB4/siP-c-L的釋放具有pH敏感性，隨著pH的降低，AB4/siP-c-L中AB4的釋放越快；在pH5.0條件下，AB4/siP-c-L中AB4的48 h累積釋放率分別是pH6.0、pH7.4條件下的1.4、2.4倍。

圖4 AB4/siP-c-L中AB4在不同pH釋放介質中的體外釋放曲線（±s，n=3）

2.3 LLC細胞對脂質體的攝取考察

2.3.1 流式細胞術檢測 采用流式細胞術考察LLC細胞對熒光標記制劑的攝取量。將LLC細胞按每孔1×106個接種于24孔板上，在37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h至細胞貼壁。將細胞分為空白對照組、siP647組、AB4/siP647-L組、AB4/siP647-c-L組，每組設置3個復孔。空白對照組細胞給予常規培養基，給藥組細胞分別加入siP647、AB4/siP647-L、AB4/siP647-c-L（siP647的濃度均為 20 nmol/L，AB4的濃度均為1.6 μmol/L）。將細胞置于培養箱中分別常規培養15、30、60 min后，用PBS清洗細胞3次，加入適量胰酶進行消化，收集細胞至流式管中。采用流式細胞儀檢測孵育不同時間后細胞對熒光標記制劑的攝取量。采用Graphpad Prism 8軟件對結果進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時組間兩兩比較采用Tukey's檢驗，方差不齊時組間兩兩比較采用Dunnett'sT3檢驗。檢驗水準α＝0.05。結果顯示，在孵育15、30、60 min后，3個給藥組細胞的熒光攝取量較空白對照組均顯著升高（P＜0.05），其中AB4/siP647-c-L組細胞的熒光攝取量又顯著高于siP647組和AB4/siP647-L組（P＜0.05），且隨著孵育時間的延長AB4/siP647-L組、AB4/siP647-c-L組細胞的熒光攝取量均顯著升高（P＜0.05）。結果見表1。

表1 孵育不同時間后各組細胞對各制劑的攝取量測定結果（±s，n=3，%%）

表1 孵育不同時間后各組細胞對各制劑的攝取量測定結果（±s，n=3，%%）

a：與孵育相同時間的空白對照組比較，P＜0.05；b：與孵育相同時間的siP647組比較，P＜0.05；c：與相同制劑孵育15 min時比較，P＜0.05；d：與相同制劑孵育30 min時比較，P＜0.05；e：與孵育相同時間的AB4/siP647-L組比較，P＜0.05

60 min 0.6±0.1 9.2±2.1a 96.1±1.7abcd 97.8±1.3abcde組別空白對照組siP647組AB4/siP647-L組AB4/siP647-c-L組15 min 0.3±0.1 1.1±1.1a 42.4±2.8ab 50.9±3.1abe 30 min 0.5±0.1 1.2±2.1a 71.8±2.5abc 90.4±1.8abce

2.3.2 共聚焦激光掃描顯微鏡觀察 采用完全隨機方案，利用共聚焦激光掃描顯微鏡考察熒光標記制劑在LLC細胞內的分布。將LLC細胞按每孔1×106個接種于Lab-Tek?腔室玻片上，置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育24 h至細胞貼壁。將細胞分為空白對照組、siPFAM組和AB4/siPFAM-c-L組，每組設置3個復孔。空白對照組細胞給予常規培養基，給藥組細胞分別加入siPFAM、AB4/siPFAM-c-L（siPFAM的濃度均為 20 nmol/L，AB4的濃度均為1.6 μmol/L）。將細胞置于培養箱中分別常規培養1、4 h后，用PBS清洗細胞3次，DAPI染色10 min，再次用PBS清洗3次后，封片，于顯微鏡下觀察細胞中的熒光分布。統計學分析方法同“2.3.1”項下。結果顯示，孵育1、4 h后，藥物主要分布于細胞質中，siPFAM組、AB4/siPFAM-c-L組細胞的熒光強度均顯著高于空白對照組（P＜0.05），AB4/siPFAM-c-L組細胞的熒光強度顯著高于siPFAM組（P＜0.05），且隨著孵育時間的延長各給藥組細胞的熒光強度均顯著升高（P＜0.05）。結果見圖5、表2。

圖5 孵育不同時間后各組細胞的共聚焦激光掃描顯微圖（×40）

表2 孵育不同時間后各組細胞胞漿中的熒光強度測定結果（±s，n=3）

表2 孵育不同時間后各組細胞胞漿中的熒光強度測定結果（±s，n=3）

a：與孵育相同時間的空白對照組比較，P＜0.05；b：與相同制劑孵育1 h時比較，P＜0.05；c：與孵育相同時間的siPFAM組比較，P＜0.05

4 h 0 25.2±8.6ab 35.2±4.9abc組別空白對照組siPFAM組AB4/siPFAM-c-L組1 h 0 8.6±3.9a 18.4±4.4ac

3 討論

本研究采用乙醇注入法制備了cRGD修飾的靶向脂質體，用于共遞送水溶性藥物AB4和基因藥物siP。在制備過程中筆者發現，加入DSPE-PEG 2000-cRGD后可降低AB4-c-L和AB4/siP-c-L的電位。其可能原因在于，囊泡表面包裹的PEG可在一定程度上覆蓋DOTAP的正電基團，從而導致脂質體的電位下降[14]。對于基因藥物siP，由于體內存在大量的核酸酶，一旦游離siP進入體內，會迅速降解失效。但是經過脂質體包裹后，脂質體上PEG可保護siP不被核酸酶代謝，避免負電荷的蛋白或紅細胞對siP的吸附，從而延長其在體內的循環時間[15]。通過細胞攝取實驗結果可知，LLC細胞對AB4/siP-c-L的攝取能力比對游離siP更強，AB4/siP-c-L可在細胞質內大量富集。其具體的作用機制可能與靶向基團cRGD的腫瘤細胞穿膜作用相關[16]。

根據本課題組前期開展的藥動學及組織分布實驗得知，AB4/siP-c-L給藥12 h后小鼠血液中AB4的濃度已非常低，AB4已基本分布到腫瘤部位。因此，為充分考察AB4/siP-c-L中AB4的釋放行為，本研究選擇48 h作為考察時間，未選擇更長的72 h。在體外釋放行為考察實驗中，與AB4溶液相比，AB4/siP-c-L混懸液中AB4的緩釋效果明顯。其原因可能在于AB4包裹于脂質體的內水相，磷脂雙分子膜發揮了延緩藥物透過的作用。AB4/siP-c-L在接近內涵體酸性pH條件下（pH5.0～5.5）可更快釋藥，而在中性pH條件下（pH7.4）釋藥速率最慢。其原因可能是所使用的脂質材料DOTAP的極性基團三甲基銨在酸性條件下的極化程度增加，該極化的極性基團聚集使得磷脂雙分子膜混亂程度增加，進而導致膜通透性增加，最終提高了AB4/siP-c-L中AB4在pH5.0～5.5環境中的跨膜釋放速率。

綜上所述，本研究制備的AB4/siP-c-L可有效實現AB4與基因藥物siP的共載，并對LLC細胞具有一定的體外靶向性，可為后續AB4/siP-c-L的抗腫瘤研究提供基礎。