雪茄煙葉晾制過程中顏色變化探討

王 佩 賈世偉 馮俊升 段宏群 王 宏 孔德輝 周中宇*

（1河南農業大學煙草學院，河南鄭州 450002；2河南中煙工業有限責任公司，河南鄭州 450016；3河南省煙草公司洛陽市公司，河南洛陽 471000）

雪茄煙是一種不同于其他類型卷煙的煙草制品。傳統概念的雪茄是指由雪茄煙葉完全手工卷制的圓形或方柱形煙支，具有香氣醇厚豐滿、勁頭大、吃味濃、煙氣呈堿性、焦油與煙堿比值低、抽吸時不過肺、對人體危害小等特點[1]。現有的雪茄煙制品結構從內到外依次是茄芯、茄套和茄衣。一般一株煙可以產生3種煙葉，即頂部葉做茄芯，中下部葉做茄套和茄衣[2]。一般對茄衣的外觀要求極高，它包裹在雪茄煙支的最外層，具有保護和美化雪茄以及提升雪茄品質等功效，代表了雪茄煙支的身份和品質[3]。國內茄衣和茄套常采用晾煙，茄芯可以是品質較好的曬煙或者晾煙。

在雪茄煙晾制過程中，其顏色變化是煙葉調制過程中的一個難點。國內外對其顏色變化的機理研究較少，因而本文從一些容易發生褐變的食品、植物入手，論述其在生產中顏色變化的原因，從而為雪茄煙晾制過程中控制顏色變化提供一些參考。

1 變色的原因

1.1 色素降解

果蔬的色澤是構成其產品品質的重要因素，其表面的綠色主要來源于葉綠素。葉綠素降解是一種非常普遍的自然現象，在秋季樹木落葉、作物衰老、果實成熟等情況下或者遭受生物與非生物脅迫時，如低溫、蟲害、微生物侵染等，都有可能發生[4]。葉綠素降解在綠色植物生長發育過程中起著至關重要的作用，包括營養代謝、果實和種子成熟。這不僅是葉綠素-蛋白質復合物分解的先決條件，也是衰老器官中大量營養物質再動員的先決條件。

梁俊林等[5]分析了不同顏色銀杏葉片中葉色素以及其他色素等含量，結果表明，引起銀杏葉變黃的最直接原因是類胡蘿卜素和花色素苷相對含量的增加。葉綠素的降解途徑有2條：一是光降解，二是葉綠素酶降解。汪 洋等[6]研究了光照對新鮮青花椒干燥過程中葉綠素降解的影響，結果表明，在紫外光干燥條件下，青椒表面的綠色逐漸褪去，并在干燥結束后，其色澤從綠色變為褐色。葉綠素及其衍生物都在一定程度上降解了一部分。果蔬類表面的綠色也會隨著自身的衰老而褪去。樊艷燕等[7]研究了青花菜衰老過程中葉綠素的降解及其相關基因的表達，結果表明，脫鎂葉綠素酶基因BoPPH和葉綠素酶基因BoCLH2會共同加快葉綠素降解。田雪婷等[8]研究了1-MCP處理對采后澳洲青蘋蘋果葉綠素降解的影響，結果顯示，1-MCP可以調控葉綠素降解相關基因，其中MdPAO是調控葉綠素降解的關鍵基因。宋小青等[9]研究表明，在獼猴桃果實貯藏過程中，葉綠素降解主要受葉綠素酶（chlase）和脫鎂螯合酶（MDCase）的影響。

烤煙在調制過程中隨著環境溫濕度的改變，色素也發生相應的降解。研究表明，煙葉在變黃期間，葉綠素降解量最大，一直持續至干筋期，仍可以緩慢降解；類胡蘿卜素隨著烘烤時間的延長降解量逐漸減小，總體來說，調制后的煙葉類胡蘿卜素相對含量較葉綠素高[10]。白肋煙晾制期間葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素等在葉綠素酶、過氧化物酶等的作用下發生降解，在0～3 d內下降速度最快，葉綠素a/葉綠素b的比值隨晾制時間的延長而下降；隨著葉片部位的升高，色素降解量也呈現增加趨勢，即上部葉＞中部葉＞下部葉[11]。白肋煙在不同晾房內晾制時，葉綠素總量、葉綠素a含量、葉綠素b含量均在晾制7 d后低于類胡蘿卜素含量，葉綠素含量大幅降低而類胡蘿卜素含量略有降低，葉綠素與類胡蘿卜素含量的差異較大，驗證了煙葉由綠變黃的生理過程[12]。向歡等[13]研究了光照對曬煙變黃期葉綠素熒光的影響，結果顯示，煙葉中的葉綠素在變黃初期仍然可以吸收利用光能，從而促進細胞內物質的轉化。

1.2 酶促褐變

劉紅錦等[14]認為，果蔬褐變與細胞采后失水、衰老、不合適的溫度和氧氣濃度以及其他逆境脅迫等有關。酶促褐變是指在有氧條件下，酚酶催化酚類物質形成醌及其聚合物的反應過程。煙葉因饑餓代謝而消耗大量的內含物質，因而煙葉的顏色會隨之發生變化。隨著晾制時間的增加，煙葉細胞逐漸死亡，細胞膜失去了選擇透過性，使得原本位于液泡內的多酚類物質與位于質體內的多酚氧化酶（PPO）相結合，在氧氣的作用下，生成醌類化合物，而醌類化合物進一步聚合，與細胞內氨基酸生成黑色素沉淀[15]。如板栗的褐變主要發生在板栗果肉外表，在細胞受損之后，PPO、POD與果蔬組織中的內源性多酚物質如兒茶酚、單寧、花青素、酪氨酸、綠原酸等相互接觸，細胞內的氧化還原平衡被打破，氧氣進入，酚類物質氧化形成醌類化合物，醌再聚合形成褐色素或者黑色素，導致褐變的發生[16]。

雪茄煙葉的酶促反應主要發生在變黃末期、變褐期。適度的酶促棕色化反應有利于改善雪茄煙的外觀顏色。一直以來，對果蔬類防酶促褐變的研究都有很多，而促酶促褐變的研究較少。在一些食品加工過程中，適當的褐變是很有用的，如醬油、咖啡、紅茶、啤酒的生產和面包、糕點的烘烤。

酶促反應的發生需具備3個條件：底物、氧氣和酚氧化酶。3個條件缺一不可，否則酶促反應便不能發生。有研究認為，綠原酸、兒茶素是PPO的良好褐變底物，是引起果實褐變的主要酚類物質。與酶促反應相關的酶類有 PPO、SOD、CAT、POD、PAL、APX等，其中PPO、POD和CAT是與膜保護系統相關的酶，與植物衰老有關。國內外對煙草中PPO、POD和CAT酶活性的研究較多[17-19]，但對苯丙氨酸解氨酶（PAL）的研究較少。另有研究證明，PAL與酚的生成有關，表明了其與褐變關系密切[20]。PAL是一種只存在于植物及微生物細胞內的酶，它是連接生物初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應的酶，也是苯丙烷類代謝的關鍵酶和限速酶[21]。PAL活力往往作為酚類褐變的指標，它可以通過催化植物體內次生代謝產物酚類物質的產生而影響酶促褐變[22]。

在鮮芋[20]、山藥[23]、奉節臍橙[24]等植物中 PAL 影響褐變的研究較多。鮮切芋艿切分后當天測得的PAL活力最高，隨后迅速下降；臍橙果皮在褐變初期，PAL活性急劇上升，但在整個貯藏過程中PAL活性相對較穩定；Nguyen等[25]指出，低溫下貯藏的香蕉皮中PAL活力呈逐漸上升趨勢；范 騰等[26]研究胡蘿卜中PAL特性，結果表明，PAL酶活力隨著溫度上升而升高，當溫度40～50℃時酶活力較高，然后逐漸下降。馮立娟等[27]研究顯示，在石榴發育前期，PAL表現出較強的活性，進而促進了花青苷和木質素等次生代謝物質的合成；隨著木質素不斷生成，細胞分化伴隨著程序性死亡，果皮細胞內的活性物質不斷向外運輸，酶活性降低，木質素沉積，木質素后期沉積可能以酚類物質向木質素轉化途徑為主。但是，PAL與煙草褐變的關系至今仍未見報道，因而可以對雪茄煙晾制階段PAL與酶促變化的關系進行進一步探索與研究。

1.3 非酶褐變

非酶褐變是指在沒有酶類物質參與下發生的化學反應，使果肉或者果皮褐變的現象，主要發生在果蔬的采后加工和貯藏過程中。非酶褐變包括美拉德反應、多酚類物質氧化縮合、抗壞血酸氧化分解和焦糖化反應等幾種類型[28]。

美拉德反應是羰基化合物和氨基化合物之間的反應，經過一系列復雜的反應最終生成棕色甚至是黑色的大分子物質類黑精或稱擬黑素，所以又稱羰氨反應。許多研究表明，美拉德反應是使一些果汁濃縮汁顏色發生變化的原因，在橙汁加工和貯藏過程中發生的褐變反應是非酶褐變（NEB）。貯存期間的顏色評估表明，橙汁和含可溶性化合物的餾分變為棕色，而不溶性餾分未變為棕色。含有可溶性化合物的餾分顯示出與純橙汁完全相同的褐變行為。根據獲得的動力學參數可以發現，原味橙汁和含可溶性化合物的氨基酸在降解過程中，蔗糖的水解、葡萄糖和果糖含量的增加以及糠醛和5-羥甲基糠醛的形成相似[29]，而VC的降解是影響橙汁貯藏過程中褐變的主要因素[30]。研究表明，在存儲期間，東北酸菜中也很容易發生非酶褐變反應，還原糖和氨基酸在酸性條件下會發生褐變反應生成代表性產物5-羥甲基糠醛（5-HMF）[31]。美拉德反應還發生在香蕉汁貯藏過程中[32]。多酚的氧化聚合是蘋果汁加工過程中非酶褐變的主要原因[33]。朱 丹等[34]研究表明，美拉德反應是毛酸漿發酵期間非酶褐變的主要原因。連志超[35]研究表明，百香果汁在貯藏過程中VC的氧化分解以及美拉德反應是造成非酶褐變的主要原因。

非酶褐變在果汁貯藏中比較常見。糖類物質在果汁中的含量豐富，焦糖化反應就是指一部分糖類物質與氨基化合物發生反應，其余一部分在加熱條件下脫水，發生熱分解反應，從而使果汁顏色發生變化的過程。果汁中含有豐富的VC等抗壞血酸物質，這種物質因具有酸性和還原性，因而特別容易氧化分解，能夠和游離氨基酸反應生成色素類物質。多酚類物質氧化縮合是指多酚類物質在適當條件下容易發生自身氧化縮合生成褐色物質。一些單寧成分含量較高的水果，如野梨、葡萄、柿子等在加工過程中都容易發生氧化變質，生成褐色物質。一般認為5-HMF是葡萄糖或果糖在酸性條件下脫水分解的產物，是美拉德反應、焦糖化反應及抗壞血酸氧化反應共同的中間產物。有研究指出，5-HMF的積累與褐變速度有很強的相關性，5-HMF積累后不久就可發生褐變，因而5-HMF積累情況可以作為非酶褐變速度的指標[36]。在非酶褐變反應動力學中，抗壞血酸含量是影響褐變反應的特定參數之一[37]。因此，檢測藕帶中抗壞血酸含量的變化，對解析非酶褐變的機理具有重要意義。

非酶棕色化反應是形成煙草特征香味的重要反應，在煙草調制、陳化、加工以及燃吸過程中，都不同程度地發生非酶棕色化反應，生成多種煙草香味物質[38]。但是，煙草中非酶棕色化反應的研究較少，因而可以在雪茄煙調制過程中探究非酶褐變和煙葉顏色的相關性，可以通過測定雪茄煙晾制過程中每個階段完成后樣品中的游離氨基酸、糖、氨基態氮、抗壞血酸、總酚、5-HMF含量以及觀察煙葉顏色的變化，從而分析在每個階段所發生的非酶褐變反應。

1.4 膜脂過氧化

細胞內發生膜脂過氧化作用其實是細胞在某一逆境條件下受到脅迫導致活性氧自由基增加，以此來進一步破壞細胞膜，最終使植物受到傷害的過程。范寧波等[39]研究表明，在雪茄煙晾制過程中，隨著煙葉變褐程度的加深，細胞逐漸失水干癟，細胞內發生失水脅迫，膜通透性發生改變，膜脂含量也急劇下降，這表明在煙葉調制過程中發生了膜脂的降解。趙松超等[40]研究表明，隨著雪茄煙葉晾制的進行，低晾制密度處理的晾房內溫度升高、濕度降低，煙葉細胞失水皺縮，在高溫和失水脅迫下，煙葉體內產生了許多活性氧，破壞煙葉體內的抗氧化酶系統，從而使膜系統受到損傷。

不僅是雪茄煙葉的變褐與膜脂過氧化作用有關，水果果心的褐變也與細胞衰老、膜脂過氧化傷害、冷害等因素有密切關系。膜脂過氧化作用是果實衰老和褐變的重要原因，而引起膜脂過氧化作用的主要原因是活性氧的積累。在荔枝、獼猴桃、香蕉和梨等的褐變過程中，活性氧清除酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性下降，內源抗氧化物質如還原型谷胱甘肽（GSH）、還原型抗壞血酸（AsA）含量下降，而膜脂過氧化物（ROOH）、H2O2和超氧陰離子自由基（O2-·）大量積累，導致膜脂過氧化產物丙二醛含量明顯增加，細胞膜透性改變。這表明果實褐變是由于內源消除活性氧的功能減弱、內源抗氧化能力下降使得活性氧得以積累，使得細胞膜系統膜脂過氧化作用加強，破壞了細胞膜結構的完整性導致的。因此，果皮褐變與過氧化作用和膜損傷有關[41]。

在陳 娜等[42]研究中，可以發現南果梨褐變過程中會產生較多的α-法尼烯和共軛三烯，增加過氧化物酶的活性，促進膜脂過氧化，使丙二醛含量上升，從而使果皮發生褐變。有研究表明，黃金梨果心褐變與果實衰老存在很大關系，在黃金梨低溫貯藏前期，抗氧化酶活性增加來清除自由基，后期抗氧化酶活性下降，細胞加速衰老，細胞膜透性增加，膜脂過氧化作用加強，丙二醛含量迅速增加，表明果心細胞膜受到損傷，果心變褐[43]。不論是果皮還是果心的顏色變化都說明褐變與膜脂過氧化密切相關。

同時也有眾多研究表明，LOX、CAT、APX和GR活性變化可能與荔枝果皮褐變有關。有研究者探討了LOX與果皮褐變的關系，認為LOX是導致果蔬衰老的一個關鍵酶，在果實衰老過程中LOX活性顯著增加，它通過破壞果實質膜使得機體成熟與衰老。同時，脂質過氧化的產物對有機體的活性生物大分子有毒害作用，導致細胞功能喪失[44-45]。在闞 娟等[46]對百合鱗片的研究中發現，褐變最快的內層鱗片在貯藏過程中LOX活力峰值最高且上升速率較快，說明LOX活力與百合鱗片褐變關系密切。低溫下APX等保護酶系統被破壞或活性變化不協調，導致積累許多有害的過氧化產物丙二醛（MDA），損傷生命大分子物質，引起一系列生理生化紊亂，最終導致膜損傷和褐變發生[47-48]。膜脂過氧化和這些酶活性變化與不同品種褐變過程差異的關系還需要進一步研究。

2 結論

本文以樹葉顏色變化以及一些蔬菜水果的褐變為出發點，探討了色素降解、棕色化反應以及膜脂過氧化與顏色變化的關系。在雪茄晾制過程中，色素類物質如葉綠素、類胡蘿卜素等發生降解，但葉綠素降解量遠遠高于類胡蘿卜素降解量，因而煙葉逐步呈現黃色。緊接著隨著晾房內溫濕度的變化，煙葉細胞失水皺縮，煙葉體內發生失水脅迫和高溫脅迫，促進活性氧自由基的積累，破壞膜系統，一方面使細胞受到損傷，一方面由于膜系統被破壞，細胞內的抗氧化性酶類與多酚類等物質接觸，發生棕色化反應，煙葉變褐。雪茄煙屬于晾曬煙，其晾制后的顏色需要呈深褐色，因而在其調制過程中應充分把握好變褐的度，充分了解調制過程中煙葉體內發生的色素降解，進而更好地調控晾制過程中顏色變化。現有的研究中都只研究了晾制過程中酶促反應對煙葉品質的影響，而忽略了非酶促反應的影響，因而接下來可以研究晾制過程中非酶促反應對雪茄煙葉的影響，并進一步與酶促反應對煙葉品質的影響進行比較，探索在雪茄煙葉晾制過程中非酶促反應的作用。總之，煙葉的顏色變化是一個復雜的過程，需要更進一步的探索。