氧化三甲胺測(cè)定方法的研究進(jìn)展*

張 野，時(shí) 景，張 明

(1 九州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221000；2 徐州市康復(fù)醫(yī)院，江蘇 徐州 221000)

氧化三甲胺(trimetlylamine oxide, TMAO)是一種穩(wěn)定性較好、易溶于水的小分子胺。不僅存在于海洋生物中，在人體內(nèi)也可經(jīng)腸道菌群代謝卵磷脂、膽堿、肉堿等原料生成[1]。人體內(nèi)TMAO的含量相對(duì)較少，但其血漿濃度與人們的飲食習(xí)慣、腸道菌群關(guān)鍵酶的活性密切相關(guān)。近年來(lái)，不少研究發(fā)現(xiàn)，TMAO在血漿中的高濃度與動(dòng)脈粥樣硬化面積的大小、腦卒中和心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[2-3]；在糖尿病人血漿的檢測(cè)中也發(fā)現(xiàn)，T2MD患者血漿TMAO濃度及膽堿等前體物質(zhì)濃度比健康人群水平高要高[4]；在腎損傷動(dòng)物體內(nèi)，腎損傷分子-1水平與血液中TMAO含量成正比，提示高水平TMAO可能是促進(jìn)腎臟纖維化的重要危險(xiǎn)因素[5]，因此，TMAO在人體血漿或尿液中水平的升高可能在心血管疾病、糖尿病、腎病等慢性疾病中發(fā)揮重要作用，找到快速、精準(zhǔn)檢測(cè)TMAO的方法尤對(duì)于慢性疾病的臨床篩查和診斷顯得尤為必要。TMAO作為慢性疾病標(biāo)志物的新希望，其研究方法的推進(jìn)也會(huì)為臨床提供更科學(xué)的預(yù)防手段和治療方法[6]。

1 TMAO的來(lái)源與代謝

TMAO是式為 (CH3)3NO 的天然化合物，大量存在于海洋生物中[7]。作為一種有效的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，TMAO可保護(hù)海洋動(dòng)物免受溫度、鹽度、高尿素和靜水壓力的不利影響[8]。TMAO可被海洋動(dòng)物的內(nèi)源酶或細(xì)菌酶降解為二甲胺(DMA) 或三甲胺 (TMA)，也可將其還原用于評(píng)估海產(chǎn)品的質(zhì)量。在人類(lèi)中，TMAO主要來(lái)源于腸道，腸道微生物群可將飲食中的肉堿、膽堿等含膽堿化合物轉(zhuǎn)化為T(mén)MA，TMA通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散迅速吸收到門(mén)靜脈循環(huán)中，然后再通過(guò)肝臟中的肝黃素單加氧酶(FMOs)轉(zhuǎn)化為T(mén)MAO[9]。值得注意的是，肝臟FMOs中FMO1的活性比FMO3低10倍，因此，F(xiàn)MO3是負(fù)責(zé)將 TMA 轉(zhuǎn)化為 TMAO的主要酶。

TMAO在體內(nèi)的代謝研究相對(duì)較少。有研究發(fā)現(xiàn)，40名健康男性在口服TMAO后，血漿中氘標(biāo)記的d9-TMAO最早可在15 min內(nèi)被檢測(cè)到，1 h后水平升高，給藥后6 h內(nèi)仍保持較高水平，最終被完全吸收[10]。TMAO被吸收后一般可在24 h內(nèi)以95%的比例經(jīng)腎臟從尿液中排出，4%從糞便途徑排出，近1%從呼吸道排出。此外，TMAO也可以被一些含有TMAO去甲基化酶的產(chǎn)甲烷的菌群代謝為二甲胺(DMA)、甲醛、氨和甲烷[11]。

2 TMAO的測(cè)定方法

近年來(lái)，TMAO在血漿、腦脊液、尿液中水平的升高已經(jīng)成為獨(dú)立預(yù)測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化、酒精性脂肪肝、阿爾茲海默等疾病等疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素。為了盡可能減少TMAO對(duì)人類(lèi)健康的影響，如何精準(zhǔn)檢測(cè)TMAO的含量尤為關(guān)鍵。目前TMAO的測(cè)定方法主要有比色法、離子色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫吸附法、核磁共振法等，本文將根據(jù)相關(guān)的研究結(jié)果，總結(jié)各方法的研究進(jìn)展。

2.1 比色法

比色法的檢測(cè)方式主要包括直接檢測(cè)法和間接檢測(cè)法[12]。直接檢測(cè)法主要是指雷氏鹽比色法，TMAO與雷氏鹽在酸性條件下相互作用生成紅色沉淀，經(jīng)含水乙醚和丙酮溶解后清洗、分離，再通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量吸光度值繪制TMAO的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量[13]。間接檢測(cè)法主要是指苦味酸檢測(cè)法，通過(guò)三氯化鈦(TiCl3)可將TMAO還原成TMA，再將TMA與苦味酸相互反應(yīng)生成黃色沉淀，比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)色卡確定TMA的含量，進(jìn)而換算得到TMAO的含量[14]。

2.2 離子色譜法

離子色譜法是基于離子交換的原理，對(duì)色譜固定相上的離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的溶質(zhì)離子之間進(jìn)行的可逆交換，用以定性和定量的方法。孫永等[15]使用4 mmol/L硝酸+3%乙腈淋洗，0.9 mL/min的流速進(jìn)行樣品分離，建立了一種非抑制性離子色譜法，這種方法可同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中TMAO及其分解產(chǎn)物，不僅樣品的預(yù)處理過(guò)程簡(jiǎn)單，且加標(biāo)回收率和精密度也較好，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。需要注意的是，如果生物樣品中存在Na+、K+、Mg2+等陽(yáng)性離子，可能會(huì)對(duì)胺類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)造成干擾和影響，因此，采用離子色譜法對(duì)TMAO進(jìn)行檢測(cè)可能不是最優(yōu)方法，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性、高特異性識(shí)別和結(jié)合原理，對(duì)待測(cè)抗體或者抗原進(jìn)行分析測(cè)定的方法，具有靈敏度高、檢測(cè)迅速穩(wěn)定、重復(fù)性好、成本較低的優(yōu)點(diǎn)。目前，市面上以醫(yī)院為研究單位開(kāi)發(fā)的有關(guān)TMAO的ELISA方法檢測(cè)方法較多，以山東大學(xué)為例，2018年山東大學(xué)第二醫(yī)院發(fā)明構(gòu)建了基于TMAO的多酶組合體系，熒光測(cè)定TMAO的檢測(cè)方法，該方法克服了TMAO代謝途徑中沒(méi)有NAD依賴(lài)脫氫酶參與，無(wú)法直接耦合的缺點(diǎn)，對(duì)于醫(yī)院系統(tǒng)的大數(shù)據(jù)調(diào)研和多因子分析具有重要意義。

2.4 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是利用液相色譜作為質(zhì)譜的進(jìn)樣系統(tǒng)，使復(fù)雜的化學(xué)組分先得到分離，再利用質(zhì)譜作為檢測(cè)器進(jìn)行定量和定性化學(xué)分析方法，是目前被廣泛認(rèn)可的檢測(cè)TMAO的方法，具有靈敏度高、特異性好、可同時(shí)分析多個(gè)成分及定量準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)。Wang等[16]采用液質(zhì)聯(lián)用的方法，通過(guò)標(biāo)記TMAO的含量，確定了血液TMAO濃度與心血管疾病之間的關(guān)系。Zhao等[17]基于液質(zhì)聯(lián)用并結(jié)合穩(wěn)定的同位素稀釋法，同時(shí)測(cè)定了人血漿和尿液中膽堿、甜菜堿、TMA、TMAO含量，并通過(guò)使用低、中、高水平加標(biāo)的質(zhì)量控制，驗(yàn)證了該測(cè)定方法的準(zhǔn)確性。Katharina等[18]基于 LC-MS/MS 開(kāi)發(fā)了一種不需要同位素標(biāo)記就能檢測(cè) TMAO 及其前體膽堿、肉堿和甜菜堿的含量的方法，這種方法速度快、處理量高、消耗的樣品量低，是具有成本效益的方法，有助于在臨床實(shí)踐中測(cè)量生物標(biāo)志物，以評(píng)估 CVD 發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，或監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和干預(yù)效果。但也有研究表明，二者聯(lián)用的技術(shù)雖靈敏度高，但步驟繁瑣，成本也相對(duì)昂貴，在衍生環(huán)節(jié)可能使TMAO發(fā)生降解，在一定程度上影響臨床的大規(guī)模篩查。

2.5 核磁共振法

核磁共振法主要是利用核磁共振光譜對(duì)物質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究的一種定性和定量的方法[19]。該方法不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，也不需要購(gòu)買(mǎi)同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，只需要加入緩沖液即可進(jìn)行檢測(cè)分析，在代謝組學(xué)的應(yīng)用中較為廣泛。Wang等[20]基于核磁共振的分析方法，深入研究了臨床血清或血漿樣本中TMAO的水平，以評(píng)估心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)和個(gè)體化飲食監(jiān)測(cè)。Helena等[21]也通過(guò)核磁共振法探索研究了魚(yú)類(lèi)的攝入量與人類(lèi)尿液中TMAO含量的相關(guān)性。盡管與質(zhì)譜法相比，核磁共振分析法可能具有靈敏度不夠等缺點(diǎn)，但該技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，因此在血液中含量并不算太低的氧化三甲胺物質(zhì)的定量分析方面依然可以較方便地使用。

3 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，隨著人們對(duì)TMAO的深入研究，越來(lái)越發(fā)現(xiàn)其在人類(lèi)健康疾病中的重要作用，對(duì)TMAO的預(yù)防和監(jiān)測(cè)在臨床中顯得尤為重要。目前，胺類(lèi)化合物特別是TMAO的含量測(cè)定已然成為研究熱點(diǎn)。現(xiàn)有的文獻(xiàn)表明，雖然TMAO的檢測(cè)方法仍存在有誤差、步驟繁瑣、成本高等局限性，但比以往研究已取得長(zhǎng)足進(jìn)展。研究顯示，比色法經(jīng)典，但其靈敏度、重復(fù)性較差，易與其他的胺類(lèi)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確，更適合水產(chǎn)生物的檢測(cè)；離子色譜法在離子交換過(guò)程中容易受液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在檢測(cè)TMAO上比酶聯(lián)免疫法、核磁共振法更有優(yōu)勢(shì)。因?yàn)橐嘿|(zhì)聯(lián)用對(duì)TMAO這種極性大、不具揮發(fā)性的胺類(lèi)物質(zhì)分離情況更好，也可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單上機(jī)分析、無(wú)需沉淀的過(guò)程，大大提高了通量，縮短了分析時(shí)間；盡管酶聯(lián)免疫吸附法看似簡(jiǎn)易操作，但不同醫(yī)院研發(fā)和采用的試劑盒的基線(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)并不一致，成本也相對(duì)較高；核磁共振分析法作為代謝組學(xué)研究的新興技術(shù)，雖然省去了很多樣品的前處理過(guò)程，但其價(jià)格昂貴，操作復(fù)雜，需要專(zhuān)業(yè)人員對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行解讀。總之，我們可能迫切需要研發(fā)一種快速、準(zhǔn)確、成本低并適合臨床實(shí)驗(yàn)室大規(guī)模篩查T(mén)MAO的方法，為提前預(yù)防TMAO誘發(fā)的疾病提供便捷途徑。