硫酸新霉素的研究*

胡永彬，徐禮生

(1 新宇藥業股有限公司，安徽 宿州 234000；2 宿州學院生物與食品工程學院，安徽 宿州 234000)

1 硫酸新霉素的性質

從弗氏鏈霉菌的發酵產物中分離得到的新酶素，是最早被發現的2-脫氧鏈酶胺氨基糖苷類抗生素[1]，具有抗菌能力強特點[2]。氨基糖苷類抗生素的產生菌對磷酸鹽極為敏感，僅在亞最適生長磷酸鹽的濃度時產量最高[3]. 氨基糖苷類抗生素產生菌被某些金屬離子如Ca、Cu、My、Na、Zn等刺激而產生抗生素[4]。新霉素是堿性水溶性抗生素，可在實際應用過程中，中和酸性物質，結合成鹽，所以工業用新霉素都是硫酸新霉素物質。硫酸新霉素為白色粉末，不溶于有機溶媒，在pH 2～9的范圍內抗菌效能穩定，與酸一起加熱即失去大部分活力。硫酸新酶素能夠與細菌核糖體30S亞基結合，使mRNA錯讀，進而抑制翻譯過程，抑制細菌蛋白質的合成。因此對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、結核桿菌等發揮良好的抗菌作用，對放線菌、鉤端螺旋體、阿米巴原蟲有抑制作用，在堿性溶液中抗菌作用較強，是一種理想殺菌劑。硫酸新霉素可阻礙內皮生長因子來干擾血管的形成[2]。氨基糖苷類藥物具有一定神經毒性，新霉素的毒性也較大。長期使用硫酸新霉素會傷害第VIII對腦神經，從而引起不可逆性耳聾[5]。也可造成對維生素A、維生素B12的吸收不良等癥狀[6]。

2 硫酸新霉素的作用機理

新霉素(neomycin，Nm)是弗氏鏈霉菌產物中純化得到的一種氨基糖苷類抗生素。其主要作用方式為與細菌核糖體16S rRNA結合，通過誘導密碼子誤讀和干擾起始和易位來抑制蛋白質合成，從而導致細菌死亡[7-9]。硫酸新霉素可損害第8對腦神經、前庭神經和耳蝸神經，導致失去平衡、姿勢異常，甚至可造成不可恢復性失聰[10]。硫酸新霉素在腎臟中以原形代謝，可累積在腎臟并損害腎小管上皮細胞，造成一定的腎毒性，根據臨床表現程度不同，可分為急性腎功能衰竭和無癥狀的輕度血清生化指標異常[11]硫酸新霉素可蓄積在毛細胞的線粒體上，并與其膜上的rRNA結合，損壞線粒體膜及其功能，線粒體膜的能量供應被阻斷，細胞得不到充分的能量供應而死亡；并且儲存在膜內間隙的細胞色素C被釋放到細胞質中，并與其他蛋白質結合，形成啟動caspase-9激活復合體，活性的caspase-9以正反饋放大效應在細胞內激活非活性的caspase-9和caspase-3，使得細胞的凋亡程序被啟動，引起細胞凋亡[12]。新霉素與TAR的小溝結合，使TAR的構象發生變化，縮小了Tat在大溝中的結合區域，抑制Tat與TAR結合，新霉素通過與內部環的結合，從而抑制Rev與病毒RNA結合[13]。新酶胺核心能夠與TAR、RRT發生相互作用，使得新霉素與HIV、TAR及RRE、RNA牢固結合，通過質譜分析和凝膠法試驗，TAR、RNA中有多個新霉素結合位點[14]。PDGF、VEGF和血管生成素是三種重要的血管發生因子，能夠在腦膠質瘤中高效表達[15]，新霉素能夠抑制這三種血管發生因子的表達，并抑制腦膠質瘤細胞的增殖，心血管是腦膠質瘤生長所必需的，所以，新霉素不僅可以阻礙心血管的發生，還能夠直接抑制腦膠質瘤細胞的增殖。因此，新霉素抗腫瘤的作用將會比單純抑制腫瘤血管發生或細胞增殖的抑制劑的作用更顯著[14]。

3 硫酸新霉素的應用

根據發酵過程特性、發酵動力學的研究結果和淀粉酶活力變化規律，采用發酵過程優化策略，發酵120 h，放罐效價提高，殘糖濃度從3.0%下降到1.5%以下，淀粉單耗下降，同時減少排放COD量，達到“減污”、“增效”的目的[16]。采用化學誘變劑亞硝基胍(NTG)進行誘變處理，使孢子發生DNA高頻率突變[17]，能夠為工業化高效發酵生產新霉素提供優良菌種。針對提高新霉素產素率，可以采用不改變原菌種遺傳性狀(DNA)，除去搖床發酵原培養基中玉米漿等添加促進劑，同時調節培養基pH，36e培養，縮短搖床發酵周期，新霉素產量提高40%以上[18]。利用花生粕取代花生餅作為硫酸新霉素發酵的原料，避免發酵異常、菌絲畸形等，有效保障發酵生產。采用高效分離手段，如離子交換技術和膜分離技術，優化新霉素發酵液的提取工藝，利用732樹脂動態吸附與洗脫，使優化后的硫酸新霉素的提取率達88.2%，降低環境污染[19]。基于多孔板發酵及酶標儀檢測高通量選育模型，建立酶標儀測定發酵液中硫酸新霉素的方法，并對24孔板發酵條件進行單因素和正交優化，使硫酸新霉素的效價較原發酵條件有所提高[20]，能夠快速篩選誘變后硫酸新霉素高產菌株。建立HPLC法，以金黃色葡萄球菌作為實驗菌株，采用抗生素微生物檢定法中管碟法中的二計量法測定硫酸新霉素的效價[21]。因硫酸新霉素質子化而帶正電荷，可通過靜電引力作用與帶負電荷的鋅試劑陰離子結合成離子締合物，建立鋅試劑共振散射譜新方法，用于實際樣品中硫酸新霉素含量的測定[22]。硫酸新霉素可阻遏奧尼羅非魚的嗜水氣單胞菌病，并且，由硫酸新霉素引起的淡水魚類出血性疾病的病原體，可被良好的控制和殺滅，因此促進禽畜生長[23]。通過正己烷溶解曲安奈德新霉素貼膏，采用水萃取的方法提取貼膏劑中的硫酸新霉素，建立HPLC法測定其含量[24]。針對硫酸新霉素化合物的特殊性，建立通用性強、靈敏度高的液相色譜-串聯質譜儀(HPLC-MS/MS)測定飼料中硫酸新霉素含量，經磷酸鹽緩沖液提取，用C18固相凈化、進行高效液相色譜—串聯質譜儀測定[25]提高飼料利用率，促進禽畜生長，廣泛用于畜牧業。HPLC-PDA法可同時測定硫酸新霉素可溶粉中非法添加甲硝唑、水楊酸、乙酰甲喹、甲氧芐啶，用乙醇提取，經C18柱分離，磷酸鹽緩沖液作為流動相洗脫，并采用二極管陣列檢測器進行全波長掃描，結果表明，這四種化學藥物在0.01～0.12 mg/mL范圍內線性關系良好，回收率在98.0%～99.9%之間，能夠為獸藥市場提供一定的技術支撐[26]。對發酵液中新霉素B組分的含量進行測定，可采用高效液相-脈沖安培檢測法，能夠有效跟蹤發酵過程，為發酵過程中補料、換罐等操作提供依據[27]。通過研究新霉素A、B及其衍生物的作用機理，從而為研制高效、低毒的抗HIV藥物提供更多的研究方向和借鑒方法。新霉素在弗氏鏈霉菌合成途徑如下：2-脫氧青蟹肌醇糖合成酶(由neoC基因編碼調控)以D-葡萄糖磷酸(G6P)為原料，對其進行催化反應生成2-脫氧青蟹肌醇糖(2DOI)，谷氨酰胺在2DOI轉氨酶(由neoS基因編碼調控)作用下被轉化為2-脫氧青蟹肌醇糖胺(2DOIA)[10]。2DOIA被NAD依賴性脫氫酶(由neoE基因編碼調控)催化， C-1位發生脫氫形成3-氨基-2，3-脫氧青蟹肌糖。3-氨基-2，3-脫氧青蟹肌糖被2DOI轉氨酶(由neoS基因編碼調控)催化轉化為2-脫氧鏈霉胺(2DOS，這類抗生素合成過程中重要中間產物)。2DOS在糖基轉移酶(由neoM基因編碼調控)與糖基供體(尿苷二磷酸-N-乙酰-D-葡萄糖)作用下發生糖基化反應形成2-氨基-乙酰巴龍霉胺，后者在脫乙酰酶(由neoD基因編碼調控)的催化作用下進一步脫去2-N-乙酰基最終反應生成巴龍霉胺[11]。巴龍霉胺的C-6′由neoQ基因編碼調控的催化下發生氧化，經過轉氨酶(由neoB基因編碼調控)催化生成新霉素A(Neamine)。在糖基轉移酶(由neoF基因編碼調控)的作用下，核糖霉素發生糖基化，隨后在脫乙酰酶(由neoD基因編碼調控)的催化下生成新霉素Y2。新霉素Y2在FAD依賴性脫氫酶(由neoQ基因編碼調控)和轉氨酶(由neoB基因編碼調控)催化作用下生成新霉素C(neomycin C)。新霉素C在差向異構酶(由neoN基因編碼調控)催化作用下C-5?發生差向異構化形成新霉素B。

4 結 語

抗生素是由微生物及其他有生命的體系所產生的，具有抑制和殺滅其他微生物及抗癌能力的化合物。采用NTG誘變與鏈霉素抗性突變株篩選新霉素高產菌株，獲得Streptomyces fradiae Str63高產突變菌株，奠定了工業化生產新霉素的基礎。新霉素的傳統生產工藝產率低，排污量大，采用發酵過程優化策略，減少環境污染，提高效價。優化后的新霉素發酵液提取工藝不僅提取率高，節省水資源，而且污染物排放量少，是一種環境友好的提取工藝。可采用微生物法、免疫分析法、色譜法、分光光度法、熒光分析法、電化學分析法、共振散射光譜法和比色法等測定硫酸新霉素。硫酸新霉素在堿性溶液中抗菌作用較強，對于相當多的抗生素都有很見效的作用，能夠發展為抗癌、抗HIV、抗腫瘤藥物等。硫酸新霉素的微生物發酵生產過程需要繼續進一步研究，對菌株進行優化改造，硫酸新霉素的作用機理需要更深入的探究，但隨著新霉素的研究不斷深入，未來會逐漸解決有關硫酸新霉素的工業應用的難題。