翠云草細胞壁組成特性

李 林

（廣西藝術學院 建筑藝術學院，廣西南寧 530007）

翠云草（Selaginella uncinata）是卷柏科（Selaginellaceae）卷柏屬多年生觀賞蕨類；在蔭蔽的栽培環境下，其葉片呈藍色。翠云草的藍色葉與其葉片細胞壁有關，是由于其葉片上層表皮外側細胞壁內的兩層薄膜干涉濾器，引發光的薄膜干涉[1]。細胞壁主要組分為纖維素、半纖維素、果膠質、木質素、少量蛋白質及礦物質等，其分布和排列方式共同決定細胞壁特性[2-3]。在不同細胞類型甚至是同一細胞壁上不同部位，均存在細胞壁胞壁組成及尺寸厚度的差異[4]。近年來，為推動生物質能源轉化，植物細胞壁作為可再生能源物質，其基礎和應用研究進展很快。李豐成[5]利用收集到的大群體芒草（Miscanthus）材料，從生物質降解轉化、能源植物選育及生物質合成機理3個層面進行植物細胞壁結構特征與生物質高效利用分子機理的研究；韋鵬練[6]以毛竹（Phyllostachys edulis）為研究對象，利用現代光譜技術，從多細胞、雙細胞和單細胞3個層次，對毛竹細胞壁主要化學組分的分布展開研究。細胞壁作為植物細胞抵抗外界環境脅迫的第一道屏障，在細胞響應外界逆境脅迫時具有重要作用[7]。細胞壁對逆境的響應表現在很多方面，如細胞壁結構變化、細胞壁多糖組分變化、結構多糖的修飾變化、細胞壁蛋白和酶的變化及質外體小分子物質的動態變化等[8]。Houston等[9]研究發現，單子葉植物和雙子葉植物細胞壁相關基因對不同病原菌和非生物脅迫的應答相似，細胞壁在脅迫中具有共同的重塑機制，即利用細胞壁相關基因對細胞壁結構進行多樣化修飾，并有一整套精確的脅迫應答轉錄因子對其進行調控。

翠云草屬蔭生植物，本課題組在項目前期研究中設計不同光強處理，利用全光照對翠云草形成脅迫，得到2種顏色差異較大的葉片（翠云草藍色葉和紅色葉），用于后續研究[10]。為得到更全面的細胞壁組成信息，選擇與翠云草同屬的小翠云（S.kraussiana）（葉片為綠色）進行對比研究。前期研究通過離子色譜鑒定出翠云草細胞壁中的10種單糖成分，分別為甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖酸、半乳糖酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖，發現各單糖組分含量在3種葉片中均差異顯著[11]。造成因素（細胞壁結構多糖中的纖維素、半纖維素或果膠質）尚不了解。本研究分別提取和測定3種材料細胞壁中的纖維素、半纖維素、果膠質和木質素含量，采用高效液相色譜法（HPLC）測定3種材料中的木質素單體，通過比較它們的含量差異，了解翠云草細胞壁組成特性，為進一步挖掘翠云草藍色葉的關鍵基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為栽培于廣西大學林學院苗圃（108°22'E，22°48'N）3層遮蔭棚下（光強為65～105 μmol·m-2·s-1）的藍色葉翠云草和綠色葉小翠云、全光照下（光強為500～520 μmol·m-2·s-1）的紅色葉翠云草新鮮葉片。隨機采集各個方向正常生長的成熟葉片100 g，粉碎機粉碎后過40目篩。55℃烘干至恒重，50℃烘箱保存，備用。

1.2 研究方法

試驗中用到的主要儀器為WATERS515泵液相色譜儀（515泵、2690分離單元、2470紫外檢測器）、多管架自動平衡離心機（湖南湘儀TDZ5-WS）、旋轉蒸發器（上海亞榮RE-52AA）、循環水真空泵（上海東璽SHZ-D型）、SYP智能玻璃恒溫水浴鍋、分光光度計（Mapada V-1100D）、鼓風干燥箱（DHG90A-101AS）、電子天平（島津AOY120）和恒溫搖床（安徽中科HQL150B）。

試劑為纖維復合酶（寧夏和氏璧公司）、蒽酮和甲基咪唑（上海Sigma-Aldrich公司）。細胞壁測定相關試劑均購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2.1 細胞壁提取

稱取0.1 g左右樣品于研缽中，每份材料3個重復。加入1 mL pH 7.0的0.5 mol/L磷酸緩沖液，研磨至勻漿后，離心5 min（3 000×g），去掉上清液；沉淀加入5 mL 0.5 mol/L磷酸緩沖液淋洗2次，再用5 mL蒸餾水淋洗2次，去掉上清液；加入5 mL氯仿-甲醇（1∶1，V∶V），室溫（20～35℃）下150 r/min振蕩1 h后，離心5 min（3 000×g），去掉上清液；加入5 mL甲醇淋洗1次，5 mL丙酮淋洗1次，5 mL蒸餾水淋洗1次，去掉上清液；加入5 mL DMSO-H2O（9∶1，V∶V），室溫振蕩過夜（12 h），離心5 min（3 000×g），去掉上清液；加入5 mL DMSO-H2O淋洗2次，5 mL蒸餾水淋洗3次，去掉上清液，殘渣為粗細胞壁[5]。沉淀風干至恒重，備用。

1.2.2 果膠質提取和測定

稱取粗細胞壁2 mg，加入150 μL草酸銨緩沖液，在沸水中水浴l h，期間每隔10 min搖動1次，離心5 min（14 000×g），取上清液，重復3次；合并上清液至10 mL容量瓶，定容至刻度；取1 mL加入試管中，加入5 mL 0.012 5 mol/L H2SO4-硼砂，100℃沸水浴5 min；冷卻后，加入100 μL 0.15%間羥基聯苯溶液，振搖5 min[5]。524 nm處測定吸光度。

標準品處理：取1 mg/mL半乳糖醛酸標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mL置于10 mL容量瓶中，加水定容；分別取上述溶液1 mL加入試管，加入5 mL 0.012 5 mol/L H2SO4-硼砂，100℃沸水浴5 min；冷卻后，加入100 μL 0.15%間羥基聯苯溶液，振搖5 min[5]。以1 mL水為對照。524 nm處測定吸光度。以半乳糖醛酸質量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.3 堿溶半纖維素提取與測定

在提取果膠質后的沉淀中加入5 mL 4 mol/L KOH（含1 mg/mL NaHB4），在室溫下提取1 h，期間每10 min輕輕搖動，離心5 min（14 000×g）；沉淀加入5 mL 4 mol/L KOH淋洗1次，5 mL蒸餾水淋洗2次，收集上清液，重復3次；采用蒽酮比色法測五碳糖（C5）和六碳糖（C6）[5]。620 nm比色，繪制以葡萄糖為標準樣品的C6標準曲線；660 nm比色，繪制以木糖為標準樣品的C5標準曲線。

1.2.4 酸溶半纖維素提取與測定4 mol/L KOH提取后的殘渣用蒸餾水洗滌至中性，將殘渣轉移至5 mL螺口玻璃瓶，定容至2.5 mL，加入TFA裂解堿不溶半纖維素后，收集上清液，測C5和C6[5]。重復3次。

1.2.5 纖維素提取與測定

4 mol/L KOH提取后的殘渣用蒸餾水洗滌至中性；將殘渣轉移至100 mL螺口玻璃瓶，加入4 mL 72%（ω/ω）濃硫酸，25℃搖床中150 r/min震蕩1 h；取出玻璃瓶，用蒸餾水定容至10 mL，終止該反應；再定容至100 mL，取10 mL上清離心，測C5和C6[5]。

1.2.6 木質素含量提取與測定

稱取0.5 g烘干后的樣品，用苯-乙醇（67∶33，V∶V）抽提4 h；抽提的粉末風干后，放入250 mL三角瓶中，加入10 mL 72%（ω/ω）濃硫酸，30℃搖床中120 r/min震蕩1.5 h；加入200 mL蒸餾水水解1 h[5]。將水解液用過濾器過濾，蒸餾水沖洗三角瓶3次，獲得濾液；殘渣用蒸餾水洗至中性。將殘渣和過濾器80℃干燥至恒重，冷卻至室溫，稱重；將殘渣和過濾器以575℃灰化4 h，冷卻30 min，稱重。將濾液用2.88%的硫酸稀釋10倍（視樣品而定），紫外分光光度計比色，測定吸光值，光波長205 nm，空白為2.88%的硫酸。

計算酸溶木質素（ASL，%）、酸不溶木質素含量（AIL，%）和總木質素含量（%）。計算公式為[5]：

式中，A為吸收值；D為稀釋倍數；V為濾液總體積；K為酸溶木質素的吸收系數，取110；W1為樣品質量；W2為殘渣和過濾器80℃干燥至恒重的重量；W3為殘渣和過濾器灰化后的重量。

1.2.7 木質素單體提取與測定

稱取0.05 g細胞壁粉末，加入5 mL 2 mol/L NaOH溶液、0.5 mL硝基苯，加入30 mL二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液（1∶1，V∶V）萃取3次，保留水相；用鹽酸將水相pH調至3～4，用30 mL二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液萃取3次；收集有機相，旋蒸后的殘渣用5 mL色譜甲醇重新溶解，用0.22 μm孔徑濾膜過濾，取濾液上機檢測[5]。HPLC檢測木質素單體的條件為柱子類型universal C18反相柱（4.6 mm×250 mm）；流動相為甲醇∶水∶冰乙酸=25∶74∶1；流速為1.1 mL/min；波長為280 nm。

1.3 數據處理

采用Excel軟件進行數據整理，采用SPSS 25.0軟件進行方差分析和多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 細胞壁物質組成

3種植物中的細胞壁物質組成相似，均為纖維素、半纖維素、木質素和果膠質（表1）。纖維素含量差異顯著（P＜0.05），半纖維素、木質素和果膠質含量均差異極顯著（P＜0.01）。藍色葉翠云草中的纖維素、半纖維素含量均最高，木質素、果膠質含量均最低。

表1 細胞壁物質組成含量Tab.1 Contents of substance compositions of cell walls

2.2 木質素單體組成

木質素單體H、單體G和單體S含量在3種葉片中均差異極顯著（P＜0.01）（表2）。小翠云木質素單體G含量高于單體S，藍色葉和紅色葉翠云草木質素單體組成均表現為單體S＞單體G＞單體H。

表2 木質素單體組成Tab.2 Compositions of lignin monomers

小翠云的木質素單體H、單體G和單體S含量均最少。木質素單體H含量表現為藍色葉翠云草＞紅色葉翠云草＞小翠云，藍色葉翠云草的木質素單體H含量是小翠云的4.09倍。木質素單體G的含量表現為紅色葉翠云草＞藍色葉翠云草＞小翠云，紅色葉翠云草的木質素單體G含量是小翠云的4.32倍。木質素單體S含量表現為紅色葉翠云草＞藍色葉翠云草＞小翠云，紅色葉翠云草的木質素單體S含量是小翠云的11.82倍。

2.3 強光脅迫后細胞壁物質含量變化

紅色葉翠云草和藍色葉翠云草的纖維素含量差異顯著（P＜0.05），半纖維素、木質素、果膠質、木質素單體H、木質素單體G和木質素單體S含量均差異極顯著（P＜0.01）（表1～2）。紅色葉翠云草的纖維素、半纖維素和木質素單體H含量均低于藍色葉翠云草，木質素、木質素單體G、木質素單體S和果膠質含量均高于藍色葉翠云草。

3 討論與結論

3.1 翠云草細胞壁物質組成

纖維素是植物細胞壁中最主要的成分，含量可達40%～70%，約占植物干重的1/3[2]。半纖維素是植物細胞壁中僅次于纖維素的第2大類多糖，約占細胞壁總量的25%，其通過氫鍵與纖維素微纖絲交聯，并與木質素、果膠質通過共價鍵在細胞壁基質中交聯形成網絡結構，共同維持細胞壁的穩定性與完整性[2，12]。木質素在植物細胞壁中廣泛存在，在木本植物成熟的木質部中，其含量達18%～38%，可加強細胞壁的機械支持力和抗壓強度,促進機械組織的形成，增加細胞壁硬度等[13]。本研究中，3種葉片的細胞壁物質組成均為纖維素＞半纖維素＞木質素，這3種物質之和均占細胞壁物質的90%左右，符合一般規律。

果膠質含量在初生細胞壁中約占30%，次生細胞壁中含量很少；其含有較多的多聚物，使細胞壁具有多孔性，有利于細胞壁的生長和細胞內外物質的交流[14]。本研究中，與小翠云、紅色葉翠云草相比，藍色葉翠云草的纖維素和半纖維素含量均差異顯著或極顯著，果膠質含量分別為小翠云和紅色葉翠云草的69.59%和68.75%，差異極顯著。前期研究發現，藍色葉和紅色葉翠云草的細胞壁單糖含量差異顯著[11]。細胞壁單糖主要由纖維素、半纖維素和果膠質等水解而來，這種差異顯著性可能與這3種成分含量變化有關。

3.2 翠云草木質素單體組成

木質素是苯丙烷類的衍生物，是由苯丙烯鹽基醇轉化形成的香豆醇（單體G）、松柏醇（單體S）和芥子醇（單體H）等酚類單體聚合形成的多聚物，主要出現在次生壁中[15]。木質素單體組成隨產地、樹種、部位、細胞類型和細胞壁層不同而變化[16]。針葉木主要含有木質素單體G，闊葉木主要含有木質素單體G和單體S，兩種木材均含有少量的木質素單體H；禾本科（Gramineae）類植物的木質素主要由木質素單體G、單體S和單體H組成[17]。王健等[18]研究發現，鐵皮石斛（Dendrobium officinale）莖中主要含有木質素單體G和單體S及微量的單體H。Weng等[19]發現與翠云草同屬的江南卷柏（S.moellendorffii）細胞壁中含有大量木質素單體S。本研究結果表明，翠云草細胞壁木質素以木質素單體S為主，含微量的木質素單體H。同屬的小翠云細胞壁以木質素單體G和單體S為主，木質素單體G含量比單體S稍高，含微量木質素單體H。說明同屬的植物，其木質素單體組成存在差異。

3.3 翠云草逆境響應

研究表明，植物細胞壁中的纖維素、半纖維素、果膠質和結構蛋白等大分子物質中含有較多負電基團，可與金屬陽離子發生各種物理、化學反應，將其固定于細胞壁中，減少重（類）金屬對植物的毒害[20]。Zhan等[21]發現，在Pb和Cd脅迫下，華中蹄蓋蕨（Athyrium wardii）為緩解毒性，其細胞壁會產生更多的果膠質和半纖維素1，提高重金屬離子固定能力。Yang等[22]發現，給大豆（Glycine max）根系施加0.2～1.0 mmol/L的Cd，其根系細胞壁中的木質素含量增加。本研究中，紅色葉翠云草受到強光脅迫，與藍色葉翠云草相比，其纖維素、半纖維素和木質素單體H的含量均下降，果膠質、木質素、木質素單體S和單體G含量分別為藍色葉翠云草的1.45、1.32、2.84和2.52倍。說明果膠質和木質素（單體S和單體G）在逆境響應中發揮更大的作用，可能與緩解重金屬對植物的毒害作用相似，但還需進一步的研究證實。

本研究對翠云草細胞壁組成特性進行初步探究，為進一步挖掘翠云草藍色葉的關鍵基因奠定基礎。但研究還缺乏相應的分子基礎，下一步工作可以結合前期研究中的轉錄組數據，從苯丙烷代謝途徑中尋找相應的分子基礎，挖掘翠云草藍色葉的細胞壁合成關鍵基因。