miR-103對鼻咽癌SUNE1細胞生物學行為的影響

王顯江，程俊亞，陳小麗

(嘉興市第一醫院 1.重癥醫學科；2.急診科，浙江 嘉興 314000；3.廈門大學 抗癌研究中心，福建 廈門 361005)

鼻咽癌在我國華南、西南地區的發病率極高，其五年生存率為50%～70%，嚴重影響我國南方地區人民生活質量[1]。鼻咽癌是一種高侵襲性和轉移性的頭頸部惡性腫瘤，30%～40%的進展期患者會發生遠處轉移[2]。因此，研究鼻咽癌細胞侵襲和轉移的分子機制對于開發新的鼻咽癌治療方法十分關鍵。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一組進化保守的內源性非編碼小分子RNA，能與mRNA特異性結合在轉錄后水平負性調控基因的表達。近年來大量研究發現，miRNA在腫瘤發生、發展、侵襲轉移和代謝中普遍存在表達失調[3]。Wang等[4]對100例鼻咽癌患者進行miRNA檢測后發現miR-103在鼻咽癌患者中上調，且其高表達預示預后不良。miR-103能夠通過靶向TIMP-3調控wnt/β-catenin信號通路影響鼻咽癌的發生發展[5]，Dluzen等[6]研究則證實miR-103能夠通過PARP-1調節高血壓患者的氧化應激。但miR-103是否會通過PARP-1影響鼻咽癌，目前還沒有研究報道。本研究旨在分析miR-103對鼻咽癌細胞增殖、遷移、侵襲等生物學行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人鼻咽癌細胞株SUNE1購自中國科學院上海生科院細胞資源中心；RPMI 1640細胞培養基、胎牛血清及0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；miR-103模擬物(miR-103 mimic)，miR-103抑制物(miR-103 inhibitor)和陰性對照(miR-103 negative control, miR-103 NC)由上海吉瑪股份有限公司設計并合成；LipofectaminTM 2000購自美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒、CCK-8分析試劑盒和Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；單克隆抗體cyclinD1、vimentin、PARP-1和GAPDH購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.2 細胞轉染與RT-PCR鑒定 取對數生長期SUNE1細胞，每孔1×105個細胞接種于12孔板中，貼壁培養24 h后，按照LipofectaminTM 2000轉染試劑盒說明書，分別將miR-103 mimic、miR-103 inhibitor和miR-103 NC轉染SUNE1細胞，轉染6 h后更換正常培養基。按照RNA提取試劑盒說明書，提取各組細胞RNA，逆轉錄成cDNA，采用實時熒光定量PCR法測定miR-103的表達水平。實驗設3個復孔，以U6為內參，定量結果以ΔCt表示。

1.3 CCK-8實驗 取各組對數生長期細胞，每孔2×104個細胞重新接種于96孔細胞培養板中，每組設置6個復孔。分別培養24 h、48 h、72 h后加入CCK-8試劑，37 ℃溫育3 h，酶標儀檢測在450 nm處的吸光度， 繪制細胞生長曲線分析細胞增殖情況。

1.4 Transwell實驗 取各組對數生長期細胞使用無血清培養基重懸，以每孔1×105個細胞接種于Transwell小室的上室(侵襲實驗孔上室需預先加入100 μL基質膠)，下室則加入500 μL含10%胎牛血清的完全培養基，于細胞培養箱孵育24 h。4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，顯微鏡下計數，分析細胞遷移和侵襲情況。

1.5 流式細胞術 收集各組對數生長期細胞，用細胞篩過濾，PBS洗滌2次，計數2×105個細胞，加入0.3 mL Binding buffer重懸細胞， 再加入5 μL FITC- AnnexinV和5 μL PI，避光溫育15 min，加入400 μL×Binding buffer，流式細胞儀檢測凋亡細胞的百分比。

1.6 Western blot實驗 收集各組對數生長期細胞，以RIPA裂解液提取各組總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后于100 ℃下變性5 min；變性蛋白樣本等量上樣至12%SDS-PAGE進行凝膠電泳分離蛋白，100 mA恒流轉膜120 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后，ECL化學發光，暗室曝光顯影，使用Image J 軟件計算灰度值。GAPDH為內參。

1.7 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件分析，測量數據以均數±標準差表示，采用非配對t檢驗，分析各組間差異的顯著性，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-103轉染SUNE1鼻咽癌細胞的miR-103表達水平 RT-PCR檢測結果(圖1)顯示，miR-103 mimic組、miR-103 NC組、miR-103 inhibitor組和SUNE1組的miR-103的表達量分別為(9.737±0.376)、(1.280±0.335)、(0.387±0.074)和(1.000±0.000)，miR-103 mimic組高于miR-103組，miR-103組低于SUNE1組，差異均有統計學意義(P<0.05)。

注：與對照組(SUNE1)比較，*P<0.05，**P<0.01。下同。

2.2 miR-103對SUNE1細胞增殖的影響 CCK-8檢測結果(圖2)顯示，與SUNE1組相比，miR-103 mimic組在48 h和72 h時的細胞生長速率均明顯升高，而miR-103 inhibitor組生長速率明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。

圖2 CCK-8檢測SUNE1細胞的增殖

2.3 miR-103對SUNE1細胞遷移侵襲的影響 Transwell實驗結果(圖3)顯示，miR-103 mimic組、miR-103 NC組、miR-103 inhibitor組和SUNE1組遷移穿入下室的細胞數分別為(87.67±8.02)個、(50.67±7.09)個、(12.33±3.06)個和(47.67±4.51)個；侵襲入下室細胞數分別為(72.33±8.14)個、(48.33±2.52)個、(11.67±1.53)個和(46.00±4.00)個。與SUNE1組比較，miR-103 mimic組細胞遷移能力和侵襲能力均顯著提升，miR-103 inhibitor組細胞遷移能力和侵襲能力均顯著減弱，差異均具有統計學意義(P<0.01)。

圖3 Transwell分析SUNE1細胞的遷移和侵襲

2.4 miR-103對SUNE1細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測結果(圖4)顯示，miR-103 mimic組、miR-103 NC組、miR-103 inhibitor組和SUNE1組的凋亡率分別為(4.05±0.23) %、(4.06±0.15)%、(4.11±0.21)%和(4.18±0.20)%，各組間細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)。

圖4 流式細胞術檢測SUNE1細胞的凋亡

2.5 miR-103對PARP-1和vimentin蛋白表達影響 Western blot實驗結果顯示，與對照SUNE1組相比，在miR-103 mimic組中vimentin蛋白的表達顯著升高，PARP-1蛋白的表達顯著降低；在miR-103 inhibitor組中，vimentin和cyclinD1蛋白的表達顯著降低，PARP-1蛋白的表達顯著升高；差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖5。

圖5 Western blot檢測細胞中PARP-1, β-actenin, cyclinD1蛋白的表達

3 討論

越來越多的研究表明，miRNA參與諸多腫瘤細胞的增殖、分化、轉移及凋亡等生物學過程。miR-103是miRNA家族中的一員，最早于2002年在人宮頸癌HeLa細胞系中被發現[7]。miR-103首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉錄生成原始miRNA轉錄產物(pri-miRNA-103)，在細胞核內被名稱為Drosha的RNA內切酶Ⅲ加工得到莖-環結構。隨后pre-miRNA-103被exportin-5蛋白運輸到細胞質中，再經第二種RNA內切酶Ⅲ -Dicer進一步加工得到成熟雙鏈RNA分子，其中一條成熟鏈插入RISC，與其靶基因mRNA的3’UTR結合，裂解其靶基因mRNA或抑制蛋白質表達[8]。一種miRNA能調控成百上千種下游基因的表達，不同miRNA之間也有交叉調控的蛋白，這種復雜的網狀結構調控著機體細胞的代謝活動[9]。

Fasihi等[10]研究發現，miR-103a在結直腸癌組織中高表達，并能激活Wnt促癌信號通路；Tan等[11]研究發現，miR-103通過靶向PTEN，激活PI3K/Akt信號通路促進肝癌細胞增殖與侵襲能力；Zhao等[12]觀察到，血清中高表達miR-103的食管癌患者較正常表達或低表達miR-103的患者生存率明顯下降；Zheng等[13]研究發現，miR-103在胃癌中通過KLF4促進增殖與轉移；Liang等[14]的研究顯示過表達miR-103a能明顯抑制胃癌MGC-803細胞的增殖、遷移和侵襲。

本研究在細胞水平上觀察到提高miR-103表達能夠抑制鼻咽癌SUNE1細胞增殖、遷移和侵襲的能力。Vimentin是一種中間絲蛋白，在多項研究中被證明是細胞運動的重要調節因子，可通過被Akt1磷酸化而增強細胞的遷移和侵襲能力[15]。Western blot實驗結果顯示，提高miR-103表達鼻咽癌細胞中vimentin蛋白的表達顯著升高，提示腫瘤細胞可獲得更強的遷移、侵襲能力，此結果與遷移侵襲實驗結果相一致。CyclinD1又稱G1 /S-特異性周期蛋白-D1，其通過激活G1期特有的周期蛋白依賴性激酶，促進G1周期抑制蛋白的磷酸化，推動細胞周期向S期過渡，其過度表達可致細胞增殖失控而惡性化[16]。Western blot實驗結果顯示：抑制miR-103表達鼻咽癌細胞中cyclinD1蛋白的表達減弱，但是提高miR-103表達并沒有明顯增強cyclinD1蛋白的表達，提示miR-103影響鼻咽癌細胞增殖可能另有途徑。PAPR是一種聚合酶，PARP-1下游產物表達增加可修復損傷的DNA分子，減少細胞凋亡[17]。miR-103高表達的鼻咽癌細胞中PARP-1表達顯著降低，即可能增加細胞凋亡，該作用可能抗衡了cyclinD1介導的細胞增殖。

綜上，本研究結果顯示miR-103能夠在細胞水平影響鼻咽癌細胞的生物學行為，該作用可能涉及到多重分子機制。miR-103有望成為鼻咽癌治療的新靶點，但其具體分子機制仍需進一步研究。