不同再礦化處理對漂白后釉質表面形貌及鈣磷比的影響

王婧嬋，李艷萍，何麗娜，牛玉梅

牙齒漂白作為一種減輕牙齒變色的保守方法[1]，已經為患者帶來了許多美學益處[2]。然而，漂白劑是否會影響釉質的表面性能現有的研究仍然存在爭議[3-5]。盡管過氧化物不會引起牙釉質表面宏觀結構的改變[6]，但多數研究發現高濃度的過氧化物會導致釉質微觀結構的改變[7-9]，例如釉質粗糙度增加、顯微硬度降低、表面形態改變以及鈣磷含量降低。雖然造成這些不利影響的原因國內外學者報道不盡相同[10-11]，但過氧化物漂白的風險不容忽視。研究表明，漂白后使用再礦化劑可以修復這種微觀結構的改變[12]。

原花青素(procyanidins，PC)是一種天然的植物代謝物，因其良好的抗氧化、抗炎、抗菌、抗凋亡和抗癌性能備受關注。一些水果中存在的PC可以防止活性氧造成的傷害，抑制糖基轉移酶和變形鏈球菌產生的酸。以往的研究表明，PC能夠中和殘留于牙面的氧以及氧自由基，促進漂白后牙體與復合樹脂的即刻粘接，并且其對牙體硬組織的生物調節具有強效作用，可用作膠原蛋白交聯劑，提高膠原強度，增強膠原耐酶解能力[13]。酪蛋白磷酸肽-無定形磷酸鈣(casein phosphopeptide-amorphous calcium phosphate，CPP-ACP)從牛奶中提取出來，可以作為鈣和磷酸鹽的儲存庫，與主要使病變淺表區域再礦化的氟化物不同，CPP-ACP由于其分子尺寸較小，可以使病變的更深區域再礦化[14]。但目前關于其對漂白后釉質再礦化的作用鮮見報道，因此本實驗通過觀察PC及CPP-ACP對漂白后釉質再礦化能力以及顏色的影響，為漂白后釉質脫礦的防治提供新的思路和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 儀器 低速切割機SYJ-150(中國沈陽科晶公司)；色差儀ZE6000(日本電色)；原子力顯微鏡(美國 Bruker DIMENSION ICON 公司)；掃描電鏡SU8010(日本日立公司)；Element型氮化硅(Si3N4)超薄窗口電制冷能譜儀(美國EDAX公司)。

1.1.2 試劑 40% HP Opalescence Boost 皓齒診室美白劑(Ultradent 公司，美國)；原花青素(純度>95%，合肥博美生物科技有限公司)；CPP-ACP(日本 GC 株式會社)；人工唾液：(ISO/TR10271標準)NaCl 0.4 g、KCl 0.4 g、CaCl20.795 g、NaH2PO4·2H2O 0.78 g、Na2S·2H2O 0.005 g、尿素1.0 g，蒸餾水稀釋至1 000 mL，pH值為6.8(東莞市信恒科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 牛切牙的處理 2021年6月10日在黑河市愛輝區養牛場購買60顆同一品種牛新鮮的離體切牙，徹底清除殘留物，用低速切割機將冠根分離，去除冠髓，去離子水沖凈，再用超聲清洗30 min，選取大小均一、無裂痕的牙冠，使用前將牙冠保存在4 ℃生理鹽水中。

1.2.2 釉質塊的制備 牛切牙自然晾干，石膏包埋后，用低速切割機切成8 mm×8 mm小塊，共獲得符合實驗要求的樣本77個。丙烯酸樹脂包埋，在流水下依次用500、1 000、2 000目碳化硅砂紙打磨拋光(磨除約100 μm)，涂布抗酸指甲油，暴露5 mm×5 mm的釉質開窗區。隨機選取11個樣本作為漂白前對照組。

1.2.3 實驗分組及處理 剩余66個樣本使用皓齒診室美白劑進行漂白，在釉質表面均勻涂抹一層美白劑，20 min后去除凝膠，重復2次，徹底沖洗吹干試件表面。隨機選取11個樣本作為漂白后對照組。其余55個樣本隨機分為5組(n=11)：去離子水(deionized water，DW)組(陰性對照組)；2%NaF組(陽性對照組)；10%PC組；CPP-ACP組；PC+CPP-ACP組。分別在DW、2%NaF、10%PC、CPP-ACP、10%PC+CPP-ACP溶液中浸泡10 min，自然晾干5 min，去離子水沖洗1 min，3次/d，分別為每天的7:00、12:00和17:00，共1周。其余時間將樣本置于人工唾液中，人工唾液需要每日更換。

1.2.4 色差儀檢測 牙齒顏色測定采用ZE6000色差儀，光源為D65光源。以CIE-LAB顏色系統記錄牙齒顏色的L、a、b值，然后按照公式ΔE*=[(ΔL*)2+(Δa*)2+(Δb*)2]1/2分別計算各組漂白后即刻、再礦化后與漂白前釉質表面的色差值ΔE1和ΔE2。

1.2.5 原子力顯微鏡分析 每組選取5個樣本，每個樣本選取3個位點，用原子力顯微鏡進行檢測，使用數據處理軟件NanoScope Analysis分析釉質表面形貌及粗糙度。以納米為單位測量平均粗糙度(average roughness，Ra)和均方根粗糙度(root mean square roughness，Rq)兩個參數。Ra、Rq從不同方面反映樣本表面的綜合狀態。

1.2.6 掃描電鏡及能譜分析 每組選取6個樣本，梯度脫水后放在干燥器內干燥，然后在牙釉質表面真空沉積一層微米級的鉑金薄膜，在每個樣本觀察界面上隨機選取3個位點，用掃描電鏡觀察表面超微結構，再用能譜儀進行元素成分及含量分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 25.0統計軟件進行數據分析，數值采用均值±標準差表示，采用單因素方差分析比較不同組間粗糙度、鈣磷比值及顏色的差異，若總體比較有差異，則采用Bonferroni法進行兩兩比較，統計學分析檢驗水平定為0.05。

2 結 果

2.1 色差儀檢測牙齒顏色改變

各組ΔE>8，漂白效果明顯。各組ΔE值漂白后升高，再礦化處理后略有降低，降低值(ΔE1，ΔE2)為1.34～1.89，各組ΔE1、ΔE2間均無統計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 不同再礦化處理各組間ΔE變化

2.2 掃描電鏡觀察表面超微結構

漂白前釉質表面形態(圖1A)：鏡下可見其表面光滑平坦，結構均勻致密，磨痕不明顯。漂白后即刻釉質表面形態(圖1B)：鏡下可見表面因脫礦形成較大凹坑，并有散在孔隙。DW組釉質表面形態(圖1C)：與漂白后即刻相似，可見有大量孔隙，無沉積層。NaF組釉質表面形態(圖1D)：鏡下可見釉質表面有排列整齊而致密的晶體沉積。PC組釉質表面形態(圖1E)：鏡下可見排列緊密不均勻的晶體沉積。CPP-ACP組釉質表面形態(圖1F)：鏡下可見大小不一的晶體沉積，有散在孔隙。PC+CPP-ACP組釉質表面形態(圖1G)：鏡下可見排列均勻而致密的晶體沉積。

A：漂白前；B：漂白后即刻；C：DW組；D：NaF組；E：PC組；F：CPP-ACP組；G：PC+CPP-ACP組

2.3 能譜分析

X-射線能譜儀分析元素成分顯示，NaF組主要含有 Ca、P、C、O、F 元素，其余各組主要含有 Ca、P、C、O 元素，而未觀察到F元素沉積(圖2)。

A：漂白前；B：漂白后即刻；C：DW組；D：NaF組；E：PC組；F：CPP-ACP組；G：PC+CPP-ACP組

由表2定量分析元素含量比值可知，漂白后釉質表面鈣磷質量比、物質的量比均顯著降低(P<0.005)，再礦化后NaF、PC、CPP-ACP和PC+CPP-ACP組均有不同程度的升高(P<0.005)，DW組無明顯變化(P>0.005)，兩兩比較顯示從低到高的牙釉質表面鈣磷比是：漂白后即刻、DW、CPP-ACP、PC、漂白前、PC+CPP-ACP和NaF組。其中，PC和CPP-ACP組鈣磷比值均低于NaF組(P<0.005)，而PC+CPP-ACP組與NaF組鈣磷比相似，差異無統計學意義(P>0.005)。

表2 釉質表面鈣磷比值

2.4 原子力顯微鏡檢測結果

2.4.1 表面形貌 漂白前組(圖3A)釉質表面平整，顆粒之間排列致密而有序，三維重建圖黃色部分凸起均勻；漂白后即刻組(圖3B)釉質表面粗糙不平，顆粒間隔較大，三維重建圖凸起不均勻，高低起伏差距大，可見明顯的凹陷狀小坑；DW組(圖3C)表面形態和三維重建圖與漂白后即刻組相似，未見明顯沉積物；NaF組(圖3D)釉質表面有球狀沉積物，分布較為均勻，三維重建圖部分區域可見裂隙，凹陷小而淺；PC組(圖3E)釉質表面有較疏松的顆粒狀沉積物，三維重建圖部分區域可見小而淺的凹陷；CPP-ACP組(圖3F)釉質表面較為粗糙，但仍較DW組較為平整，有散在的顆粒狀沉積物，三維重建圖部分區域可見少量坑狀和尖銳突起結構；PC+CPP-ACP組(圖3G)釉質表面較為平整，但仍比漂白前組略粗糙，有均勻、致密的顆粒狀沉積物，三維重建圖黃色部分凸起較為均勻。

A：漂白前；B：漂白后即刻；C：DW組；D：NaF組；E：PC組；F：CPP-ACP組；G：PC+CPP-ACP組

2.4.2 粗糙度 對各組樣本的表面粗糙度進行統計學分析(表3)，漂白后Rq、Ra均顯著升高(P<0.001)，經不同處理后各組均有不同程度的降低(P<0.001)，兩兩比較顯示從高到低的釉質表面粗糙度是漂白后即刻、DW、NaF、CPP-ACP、PC、PC+CPP-ACP和漂白前組。其中，PC+CPP-ACP組粗糙度值最接近漂白前，明顯小于NaF、PC和CPP-ACP組(P<0.001)。

表3 釉質表面粗糙度

3 討 論

天然產品用于醫藥已有數千年歷史，資源豐富并且安全性較好，在預防和治療牙齒脫礦中有著廣闊前景。PC作為天然抗氧化劑和自由基清除劑，已被證明在各種臨床應用中以及作為膳食補充劑是安全的。現代藥理研究顯示[17]，PC可以通過誘導膠原交聯和降低生物降解率增加膠原蛋白的穩定性，進而促進牙本質再礦化。CPP-ACP易溶于唾液，能夠顯著提高唾液中鈣及磷酸根離子水平，有助于再礦化。此外，CPP-ACP分子有親水和疏水區域，可以掩蓋細菌表面的疏水蛋白，從而阻止細菌黏附牙齒表面[18]。

由于牙釉質的礦物質是基于鈣和磷酸鹽形成的，當與這些離子相關的不飽和溶液接觸時，可能會發生羥基磷灰石溶解。反之，當與過飽和溶液接觸時，會發生礦物沉淀或再礦化。唾液中存在鈣、磷等礦物離子，在一定程度上可修復脫礦釉質，封閉微小孔隙，但這一再礦化進程非常緩慢且作用輕微。因此，本實驗去離子水處理后各項指標都無明顯變化。

Poorni等[19]發現牙釉質鈣磷比可以反映釉質表面鈣磷得失，進而判定其再礦化程度。本實驗能譜分析結果發現，NaF、PC、CPP-ACP和PC+CPP-ACP組的鈣磷比值均有不同程度的恢復，這表明它們都能促進漂白后的釉質再礦化，并且可以發現與漂白前相比新形成的沉積物的主要元素種類沒有發生改變，這表明在釉質表面有新的晶體生成，具體成分仍需進一步探索，推測可能是磷酸鹽、碳酸鹽或有機酸鈣的其他螯合物等。雖然PC、CPP-ACP對恢復鈣磷比值的作用不及NaF的效果顯著，但二者聯合應用的效果與其接近。

掃描電鏡和原子力顯微鏡實驗結果表明，再礦化處理后各組釉質表面均有程度不一的礦物質沉積，正如預期那樣，PC與CPP-ACP聯合應用的沉淀物最為致密。推測其原因可能是,CPP-ACP能維持溶液中鈣、磷離子的過飽和狀態，保證礦化所需的離子滲透梯度[20-21]，PC能清除漂白劑殘留的活性氧，并且其攜帶的大量酚羥基首先與溶液中的鈣離子結合形成含鈣絡合物，然后與釉原蛋白中的氨基發生反應，通過這兩個過程絡合物中的鈣離子轉移到了釉原蛋白中，使得游離的鈣離子聚集到釉原蛋白中[22]，從而增強了釉質再礦化。因此，二者聯用能發揮更大的再礦化優勢，但具體作用機制有待進一步研究。

綜上所述，漂白后使用PC和CPP-ACP均有良好的再礦化效果，且聯合應用的效果優于單獨應用。雖然天然藥物的具體有效成分目前仍不十分明確，但其不良反應較小且資源豐富，有進一步研發利用的價值。

利益沖突：作者聲明沒有競爭利益。