CD83重組蛋白的原核表達、復性純化及多克隆抗體制備①

馬 寧 李興杰 姜鴻宇 徐國鋒 王 星 張宗德

（西南醫科大學附屬醫院炎癥與變態反應實驗室，瀘州 646000）

CD83分子在許多細胞中均有表達，但主要由活化的免疫細胞，如樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）、B細胞和T細胞等表達和分泌。CD83是成熟DCs高度穩定表達的Ⅰ型跨膜糖蛋白，被認為是DCs成熟的標志物。DCs是體內最重要的抗原呈遞細胞，DCs成熟后通過釋放特定細胞因子調控CD4+T細胞的分化，發揮其在抵抗病原感染引起免疫反應中的核心作用。大量研究表示，不同病毒可以調節CD83的表達水平改變DCs的功能。皰疹病毒能夠通過靶向CD83形成獲得性免疫逃逸機制［1］。水痘帶狀皰疹病毒感染時可選擇性抑制DCs上CD83的表達［2-3］。相反，在前期研究中，本課題組發現禽流感病毒及其神經氨酸酶能夠上調DCs和巨噬細胞表面CD83表達，進而促使小鼠產生急性肺部炎癥［4］。由此可見，CD83在病毒感染致病過程中發揮重要作用。

CD83通常以膜結合型和可溶性型兩種形式表達。在正常人類血清中能檢測到從活化的DC和B細胞中釋放的可溶性CD83（soluble CD83，sCD83），這種sCD83具有很強的免疫抑制功能［5］。有研究表明，sCD83可抑制單核細胞向DCs分化，改變DCs的細胞骨架，阻止DCs成熟，并降低DCs介導的T細胞增殖［6-8］。此外，sCD83可作為免疫抑制劑在自身免疫系統疾病及器官移植排斥反應中發揮抗炎作用［9-10］。另有研究表明，CD83單克隆抗體能夠抑制DCs成熟發揮免疫抑制功能［11］。靶向CD83可以抑制小鼠自身免疫性疾病和過敏反應［12-13］。此外，特異性抑制CD83可減輕單純皰疹病毒感染引起的小鼠全身炎癥反應［14］。這些研究提示，在自身免疫系統疾病、過敏及病毒感染等條件下，使用sCD83或CD83抗體特異性靶向CD83處理，能夠發揮免疫抑制作用，展現抗炎、抗病毒效果。

本研究首先通過構建鼠源CD83胞外結構域（Met1-Arg133）的重組質粒，將質粒在TOP10F'原核表達系統中表達。其次，通過包涵體變性、復性純化獲得了CD83重組蛋白。最后，使用純化獲得的CD83重組蛋白及QuickAntibody-2W免疫佐劑免疫SD大鼠2周，獲得了滴度高、特異性強的CD83多克隆抗體。本研究為后續sCD83和CD83抗體在抗炎、抗病毒過程中的免疫抑制機制的研究提供了支持。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種、細胞株及表達質粒 表達宿主菌TOP10F'感受態購自昂宇生物公司。肺巨噬細胞系Raw264.7購自中國科學院干細胞庫。pGEX-2TCD83（Met1-Arg133）表達質粒由優寶生物構建。

1.1.2主要試劑LB肉湯、氨芐西林（Ampcillin，Amp）、Tris-HCl、NaCl、甘 油、EDTA、聚 乙 二 醇PEG6000、十二烷基肌氨酸鈉（SKL）、二硫蘇糖醇（DTT）、IPTG、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、還原型谷胱甘肽（GSH）購自索萊寶科技有限公司；BeyoGoldTMGST-tag Purification Resin、考馬斯亮藍超快染色液、GST Mouse Monoclonal Antibody、辣根過氧化物酶標記山羊抗大鼠IgG（H+L）、辣根過氧化物酶標記驢抗山羊IgG（H+L）購自碧云天生物技術有限公司（Beyotime）；CD83 Polyclonal Antibody（PA5-47138）、山羊抗大鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗Alexa Fluor 488（A-11006）購自Invitrogen公司；CD83-Fc重組蛋白購自Sino biological公司。

1.1.3實驗動物 體質量約300 g的SD大鼠購自西南醫科大學實驗動物中心。

1.2方法

1.2.1重組菌誘導表達 將pGEX-2T-CD83（Met 1-Arg 133）質粒轉染至TOP10F'感受態后，涂布至LB+Amp（100 μg/ml）培養平板上，O/N培養。挑取單個克隆接種至5 ml LB+Amp培養液中，37℃、150 r/min擴增培養。當OD600nm達到0.6～0.9時，將5 ml培養液全部轉移至含有400 ml LB+Amp培養液的三角瓶中繼續培養至OD600nm約為0.8時，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，25℃誘導表達12～16 h。收集菌體，用無菌PBS懸浮洗滌沉淀3次后，保存于-80℃條件下。

1.2.2包涵體復性

1.2.2.1包涵體超聲破碎 稱重回收獲得菌體沉淀，按照1 g/35 ml的比例加入buffer A（50 mmol/L Tris-HCl，0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，5%甘油，5 mmol/L DTT，pH7.9）重懸菌體，液氮反復凍融3次；在冰浴中超聲破碎菌體（功率200 W，工作8 s，間歇6 s）；超聲破碎5 min，4℃、10 000 r/min離心10 min，回收包涵體沉淀。

1.2.2.2包涵體洗滌 使用無菌PBS洗滌回收得到的包涵體沉淀，重復3次，4℃、10 000 r/min離心10 min，收集包涵體沉淀。

1.2.2.3包涵體變性 向1.2.2.2中回收得到的包涵體中按比例加入buffer A及20%SKL貯存液，使得SKL終濃度為0.3%，劇烈攪動使沉淀慢慢溶解，4℃靜置約6 h溶解；將溶解懸液4℃、10 000 r/min離心10 min，收集上清。

1.2.2.4包涵體復性 向1.2.2.3中回收得到的上 清 液 中 加 入20%PEG6000、50 mmol/L GSSG和100 mmol/L GSH至終濃度分別為0.2% PEG6000、1 mmol/L GSSG和2 mmol/L GSH；4℃、O/N靜 置復性。

1.2.2.5透析 將1.2.2.4中復性得到的溶液裝入MD44（3500D）透析袋中；在4℃條件下，使用無菌PBS進行攪拌透析，每12 h換液1次，24 h后回收復性液。

1.2.2.6蛋白結合及洗脫 回收1.2.2.5中得到的復性液，按500 μl/35 ml的比例加入BeyoGoldTMGST-tag Purification Resin，4℃旋轉結合3 h；將結合后的復性液加入親和層析柱空柱管進行流穿，PBS洗滌GST-resin后，用溶出液（buffer A+50 mmol/L Tris-HCl、12 mmol/L GSH），按2 min/滴的流速洗脫溶出。每500μl為1個溶出組分，回收至第4個溶出組分。

1.2.3SDS-PAGE、Western blot及ELISA檢測目的蛋白活性

1.2.3.1SDS-PAGE、Western blot將洗脫獲得的樣品進行SDS-PAGE，電泳完成后將凝膠用去離子水洗滌5 min，棄去離子水加入適量的考馬斯亮藍超快染色液，室溫水平搖動染色1 h；染色完成后回收染色液，加入適量去離子水洗滌5 min；棄去離子水，將冰乙酸∶乙醇∶去離子水按1∶4∶5混合配制洗脫液洗脫凝膠；當蛋白條帶清晰后拍照，使用Image J計算各蛋白條帶灰度值；以BSA相應濃度制作標準曲線，定量洗脫樣品中CD83蛋白的濃度；或將電泳完成后凝膠進行Western blot，檢測CD83目的蛋白的特異性。

1.2.3.2ELISA檢測蛋白活性 將唾液酸凝集素SNA（20 μg/ml）包被于ELISA板上，4℃孵育過夜。經1%BSA封閉后，將GST-CD83重組蛋白（10μg/ml）及CD83-Fc蛋白（10 μg/ml）加入到板孔中，與SNA在37℃孵育3 h。1×PBST洗平板2次，然后用CD83一抗在室溫孵育1 h。經1×PBST洗滌后，加入辣根過氧化物酶標記驢抗山羊IgG標記的二抗。用TMB顯色液顯色，在450 nm下讀取吸光值。

1.2.4制備多克隆抗體

1.2.4.1免疫大鼠 將純化獲得的CD83重組蛋白與QuickAntibody-2W免疫佐劑等體積混合，通過后腿小腿肌肉注射免疫SD大鼠，每只SD大鼠左、右腿各注射1針，免疫劑量約為200μg/只；待免疫7 d后等劑量加強免疫1次；當合計免疫14 d時尾靜脈采血，檢測血清效價；當血清效價達1∶104～1∶105時，取大鼠腹主動脈血；4℃、O/N靜置后，3 000 r/min離心10 min回收血清。

1.2.4.2血清效價檢測 將純化得到的CD83重組蛋白稀釋后按100μg/ml與包被液混合，4℃、O/N包被于酶標板中；經1×PBST洗滌3次、1%BSA封閉后，將免疫所得血清用1×PBST按1∶10稀釋至1∶108后加入酶標板中，37℃孵育1 h；以未免疫大鼠的血清作為陰性對照；經1×PBST洗滌后加入辣根過氧化物酶標記山羊抗大鼠IgG（H+L）二抗，37℃孵育1 h；經1×PBST洗滌后加入TMB顯色液顯色，測定效價［28］。

1.2.4.3免疫熒光染色 將肺巨噬細胞Raw264.7在有蓋玻片的24孔板中培養至對數期，經1×PBST洗滌后，用4%甲醛固定。經1×PBST洗滌3次后，用1%BSA封閉。用免疫大鼠所得的CD83多克隆抗體進行孵育，4℃過夜。次日，用Alexa Fluor 488山羊抗大鼠IgG二抗孵育1 h。最后，運用DAPI進行細胞核染色后觀察。圖像采用奧林巴斯FV1000共焦顯微鏡在恒定曝光時間下獲得。

2 結果

2.1CD83載體的構建 首先，經NCBI檢索，本課題組比對了Human、Rat及Mouse CD83細胞外結構域氨基酸序列，其中相同序列占總比的58.04%，相似序列占總比的92.26%（見圖1）。由于鼠源CD83胞外結構域與人源CD83相似度較高，且鼠源CD83重組蛋白相關研究較少，因此選擇鼠源CD83的NM_009856轉錄本，將該轉錄本編碼CD83胞外結構域的399個堿基作為模板。其次，課題組設計了含有限制性內切酶BamHⅠ/EcoRⅠ基因序列的引物，通過PCR、限制性內切酶酶切、T4 DNA連接酶連接，將CD83胞外結構域399個堿基裝載到pGEX-2T載體上。最后，通過BamHⅠ/EcoRⅠ酶切電泳得到了約400 bp的條帶，如圖2所示。此外，測序結果顯示，裝載在pGEX-2T載體上的399個堿基為編碼CD83胞外結構域的相應堿基且無突變位點（圖2）。表明CD83原核表達系統載體pGEX-2T-CD83（Met1-Arg133）構建成功。

圖1 Human、Rat、Mouse CD83細胞外結構域氨基酸序列對比圖Fig.1 Comparison of amino acid sequences in extracellular domain of Human，Rat，and Mouse CD83

圖2 CD83重組質粒模式圖及電泳鑒定圖Fig.2 Model diagram and electrophoresis identification diagram of CD83 recombinant plasmid

2.2CD83重組蛋白的表達 將構建所得CD83質粒轉染至TOP10F'表達菌株中培養、IPTG誘導表達。使用裂解液裂解回收得到的菌體，通過SDSPAGE、考馬斯亮藍染色后分析發現，在上清液中并未檢測到GST-CD83蛋白或檢測到的表達量極少。調整IPTG濃度、誘導溫度和誘導時間（0.1 mmol/L、37℃、4 h，0.1 mmol/L、16℃、O/N，0.2 mmol/L、25℃、O/N）以及檢測裂解后回收的沉淀后發現，在沉淀中能檢測到大量GST-CD83蛋白（約39.5 kD）。表明在原核表達系統中GST-CD83蛋白大多以包涵體形式表達，而誘導表達的最佳條件為：0.2 mmol/L IPTG、25℃、O/N（12～16 h）（圖3）。

圖3 SDS-PAGE分析CD83表達情況Fig.3 Analysis expression of CD83 by SDS-PAGE

2.3CD83重組蛋白的包涵體復性及純化 首先，采用IPTG的最佳誘導條件誘導得到菌體，經PBS洗滌、裂解液裂解、超聲波超聲后回收得到菌體沉淀。其次，使用0.3%SKL將包涵體溶解變性，利用透析法進行包涵體復性。最后，使用GST親和層析純化獲得GST-CD83蛋白，通過SDS-PAGE、考馬斯亮藍染色及Western blot分析CD83蛋白的純化情況及特異性。使用BSA定量GST-CD83的蛋白濃度。如圖4A、圖5所示，GST-tag resin能夠結合絕大部分復性液中的GST-CD83蛋白，且通過洗脫液洗脫下的GST-CD83蛋白特異性較高。因此表明，使用SKL溶解、透析復性、GST親和層析純化以及BSA定量，能夠獲得高效、穩定及高濃度的CD83重組蛋白。CD83是一種唾液酸糖蛋白，因此通過檢測其與唾液酸凝結素SNA的結合情況檢測蛋白活性。結果顯示，GST-CD83與SNA的結合效果與商品化CD83-Fc相近（圖4B）。

圖4 CD83重組蛋白的活性測定Fig.4 Activity determination of CD83 recombinant protein

圖5 Western blot分析CD83表達特異性Fig.5 Analysis specificity of CD83 by Western blot

2.4CD83多克隆抗體的制備及鑒定 以純化得到的GST-CD83蛋白作為抗原，使用QuickAntibody-2W免疫佐劑與既定劑量抗原進行混合后免疫SD大鼠。在第1次免疫7 d后使用相同劑量抗原進行加強免疫1次。在免疫開始后的第14天進行采血回收血清，使用ELISA法檢測血清中的抗體效價。如圖6A所示，以未免疫的大鼠血清為陰性對照做對比后觀察到，CD83多克隆抗體的效價約為1∶104～1∶105。此外，運用免疫熒光染色檢測CD83多克隆抗體的活性（圖6B）。結果顯示，該多克隆抗體免疫結合肺巨噬細胞Raw264.7細胞表面CD83，與已發表論文中商品化CD83抗體的免疫染色結果一致［4］。表明從該原核表達系統中獲得的GST-CD83蛋白能夠作為穩定抗原免疫動物；而與傳統免疫佐劑相比，QuickAntibody-2W免疫佐劑的抗體產生快、抗體滴度高等優點，縮短了抗體的制備周期，為免疫動物、抗體制備提供新的思路。

圖6 ELISA檢測CD83抗體的抗體效價及免疫活性Fig.6 Antibody titer and immunoactivity of CD83 antibody were detected by ELISA

3 討論

CD83是免疫球蛋白超家族成員之一。CD83有兩種蛋白質類型，一種是膜結合形式（membrane CD83，mCD83），另 一 種 是 可 溶 性 形 式（soluble CD83，sCD83）［5］。膜結合蛋白mCD83由胞漿結構域、跨膜結構域和胞外結構域組成。在哺乳動物中，mCD83表達于多種免疫細胞表面，被認為是免疫細胞表面的激活標志，包括T細胞、B細胞、DCs及巨噬細胞等。其中，mCD83在活化的DCs和其他抗原呈遞細胞表面的表達使其成為一個有吸引力的治療靶點，實現選擇性免疫抑制。有研究顯示，皰疹病毒能夠靶向mCD83形成獲得性免疫逃逸，建立潛伏期［1］。此外，水痘帶狀皰疹病毒感染時可選擇性抑制DCs上mCD83的表達［2-3］。相反，有研究發現EB病毒（epstein-barr virus，EBV）能夠促進B細胞上mCD83的表達［15］。同時，本課題組前期研究顯示，禽流感病毒H9N2突變體強毒株能夠上調DCs和巨噬細胞等免疫細胞表面mCD83的表達，進而促使小鼠產生急性肺部炎癥［4］。

關于sCD83，有研究發現在健康人血清中可檢測到低水平的sCD83，但在造血系統惡性腫瘤或自身免疫性疾病患者血清中可檢測到較高水平［16-18］。另外，在健康小鼠血清中檢測到的sCD83水平極低，但在孕期小鼠或誘導自身免疫小鼠血清中檢測到sCD83的水平將會升高［13，19］。細胞培養實驗則證實，大多數sCD83是由活化的B細胞和DC細胞，以及小鼠的Treg細胞分泌產生［19-21］。小鼠CD83與人類CD83的細胞外結構部分均包含一個V型免疫球蛋白結構域，且有63%的氨基酸同源性。雖然，這兩物種天然sCD83的序列仍未被證實，目前還不清楚該產物是否來源于mCD83或CD83剪接變異體細胞外部分的剪切［22］。但有研究顯示，重組可溶性CD83胞外結構域（recombinant soluble extracellular CD83，rsCD83）能夠模仿天然sCD83變體，在自身免疫性疾病的動物模型和移植中顯示了強大的免疫抑制特性［23-25］。

由于mCD83在多種免疫細胞表面表達且sCD83在惡性腫瘤及自身免疫性疾病中高分泌、高表達等特性，CD83將成為一個有效的治療靶點，特異性靶向CD83將能為多種疾病的治療提供手段。研究顯示，在移植物抗宿主病（graft-vs-host disease，GVHD）的臨床前模型中CD83特異性抗體具有清除CD83+細胞的能力［26］。另有研究表明，特異性抑制CD83可減輕單純皰疹病毒感染引起的小鼠全身炎癥反應［14］。此外，抗CD83抗體在其他炎癥環境中也能夠呈現免疫抑制效果，如在巨細胞動脈炎（giant cell arteritis，GCA）的異種小鼠模型中得到了證明［27］。本課題組的前期研究發現抗CD83多克隆抗體能夠降低禽流感病毒H9N2突變株引起的細胞因子風暴，進而降低小鼠肺部急性炎癥反應［4］。

本研究通過將鼠源CD83胞外結構域399個堿基裝載到含有GST融合蛋白的pGEX-2T載體上，成功構建了CD83的原核表達質粒。將質粒轉染至TOP10F'原核表達菌株并優化IPTG的誘導條件，明確了GST-CD83的包涵體表達形式及最佳誘導條件。將誘導表達得到的菌體沉淀，利用包涵體變性、復性及GST親和層析獲得了CD83重組蛋白。最后，將獲得的重組CD83蛋白與QuickAntibody快速免疫佐劑免疫SD大鼠，快速、高效地獲得了CD83的多克隆抗體。因此，本研究獲得CD83重組蛋白及CD83多克隆抗體的方法，不僅能夠為sCD83和CD83抗體的制備提供新思路，還能夠為后續sCD83和CD83抗體在抗炎、抗病毒過程中免疫抑制機制的相關研究提供支持。