PRPF3和CHEK1在肝細胞肝癌中的表達水平及臨床意義*

梁 偉，李 娟△，羅中興，楊曉剛

長沙市第三醫院:1.檢驗科;2.血液腫瘤科，湖南長沙 410015

肝細胞肝癌(HCC)是常見的消化系統惡性腫瘤，每年死亡例數達35.81萬人，死亡率達25.85/10萬[1]。近年來隨著外科手術、介入治療等的發展，一定程度上提高了HCC患者的臨床治療療效，延長生存時間，但仍有部分HCC患者首次診斷時已出現肝區疼痛、鞏膜黃染、消瘦等中晚期癥狀，喪失最佳手術時機[2]。深入探究HCC的疾病發生機制，尋找能夠預測預后的腫瘤標志物，具有重要意義[3]。前mRNA加工因子3 (PRPF3)編碼基因位于1q21.2，編碼蛋白功能是將細胞核中的mRNA前體中剪切去除內含子，形成由四個小核糖核蛋白和剪接因子組成構成的剪接復合體[4]。近年來發現，在皮膚鱗癌[5]、肝癌[6]等惡性腫瘤中表達顯著升高，其能夠通過激活JAK2/STAT3信號通路，促進腫瘤的惡性增殖及轉移。檢查點激酶1(CHEK1)基因位于11q24.2，編碼蛋白屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，當細胞DNA損傷或存在未完全復制DNA時，CHEK1參與調節細胞周期及DNA的損傷修復[7]。近年來發現，CHEK1在卵巢癌[8]、乳腺癌[9]等惡性腫瘤中表達水平上調，其作為一種促癌基因，促進腫瘤的惡性進展。本研究通過分析HCC中PRPF3、CHEK1的表達，探討其臨床預后價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集自2017年3月至2018年3月期間于本院診治的86例HCC患者為研究對象。其中男50例，女36例，年齡31～78歲，平均(61.2±7.1)歲。納入標準：(1)接受肝癌切除術，且經術后病理明確為HCC。(2)術前無放化療、靶向治療史及生物治療等病史。(3)臨床、病理及隨訪資料完整。(4)患者和家屬對本研究知情同意。排除標準：(1)伴肝膿腫等感染性疾病。(2)伴其他器官惡性腫瘤。(3)合并嚴重的心肺腦等器官功能衰竭。(4)合并血液系統疾病。腫瘤大?。骸? cm者54例，>3 cm者32例；腫瘤TNM分期：Ⅰ期55例，Ⅱ～Ⅲ期31例。病理分級：高中分化60例，低分化26例；甲胎蛋白(AFP)水平：<400 ng/mL 62例，≥400 ng/mL 24例；肝內轉移：有23例，無63例。本研究經經本院倫理委員會批準并通過。

1.2方法

1.2.1癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫中HCC組織及癌旁組織PRPF3和CHEK1 mRNA的表達水平 采用R 3.6.3對TCGA數據庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)中HCC數據的RNA-seq數據進行分析，同時應用R包：中的ggplot2[3.3.3版本]進行可視化處理，將FPKM 格式的RNAseq數據轉換成了TPM 格式并進行log2轉化。

1.2.2免疫組化檢測 將HCC癌和癌旁組織(距離癌組織邊緣2 cm以上)放入10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm切片后進行免疫組化染色。主要步驟：切片常規脫蠟，梯度乙醇水化，切片放入0.01 M檸檬酸緩沖液(pH6.0)中微波爐加熱5 min進行抗原熱修復，3%雙氧水去除內源性過氧化物酶，一抗4 ℃過夜 (PRPF3稀釋比1∶400，購自Abcam公司，貨號ab272596；CHEK1稀釋比1∶400，購自Abcam公司，貨號ab40866)；滴加生物素標記的二抗室溫孵育30 min；辣根過氧化物酶標記三抗室溫孵育30 min，DAB顯色30 s；蘇木素復染細胞核5 min；梯度乙醇脫水，中性樹脂封片。200倍顯微鏡下(日本OLYMBUS，BX53)觀察陽性表達情況，染色評分根據染色強度(0：無染色，1：染色淺，2：染色深)和染色面積(0：≤25%，1：25%～50%，2：≥50%)的乘積評估。評分<2分為陰性表達，≥2分為陽性表達[10]。

1.2.3隨訪 隨訪自手術切除之日開始，隨訪終點為為患者死亡或隨訪時間結束。以門診或電話的方式進行隨訪，每6個月隨訪一次，隨訪截止時間為2021年3月。

2 結 果

2.1TCGA數據庫中肝細胞肝癌癌組織與正常肝組織中PRPF3和CHEK1 mRNA表達水平比較 TCGA數據庫肝細胞肝癌癌組織中PRPF3 mRNA的表達水平顯著高于正常肝組織，癌組織中CHEK1 mRNA的表達水平顯著高于正常肝組織，差異具有統計學意義(P<0.001)。見圖1。

注：與正常肝組織比較，***P<0.001。

2.2肝細胞肝癌與癌旁組織中PRPF3和CHEK1蛋白表達水平 癌組織中PRPF3陽性表達主要位于細胞質和細胞膜，CHEK1陽性表達主要位于細胞質和細胞膜，見圖2。癌組織中PRPF3、CHEK1的陽性表達率分別為75.6%(65/86)、73.3%(63/86)，癌旁組織中PRPF3、CHEK1的陽性表達率分別為24.4%(21/86)、26.7%(23/86)，癌組織中PRPF3、CHEK1的陽性表達率明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(χ2=45.023、37.209，P<0.001)。

圖2 免疫組化檢測癌組織中PRPF3和CHEK1

2.3癌組織中PRPF3和CHEK1 mRNA及蛋白表達水平的相關性 利用R語言，采用Pearson相關分析肝細胞肝癌癌組織中PRPF3和CHEK1 mRNA表達水平的相關性，結果PRPF3和CHEK1 mRNA表達水平呈顯著正相關(r=0.614,P<0.001)。采用Spearman秩相關分析肝細胞肝癌癌組織中PRPF3和CHEK1蛋白表達水平的相關性，結果兩者蛋白表達水平亦呈顯著正相關(r=0.601,P<0.001)。見圖3。

圖3 肝癌癌組織中PRPF3和CHEK1 mRNA

2.4PRPF3和CHEK1蛋白表達與臨床病理特征間的關系 不同腫瘤TNM分期、病理分級及肝內轉移癌組織中PRPF3、CHEK1的表達水平差異具有統計學意義(P<0.05)，不同患者的性別、年齡、腫瘤大小及AFP水平無關(P>0.05)。見表1。

表1 癌組織中PRPF3、CHEK1的表達水平與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.5癌組織中PRPF3和CHEK1表達對肝細胞肝癌患者生存預后的影響 86例患者隨訪2～36個月，平均生存時間為(26.1±4.2)個月，隨訪期間死亡49例，3年總體生存率43.0%(37/86)。PRPF3陽性表達組的3年總體生存率為33.8%(22/65)，平均生存時間為(22.1±4.0)月；PRPF3陰性表達組3年總體生存率為71.4%(15/21)，平均生存時間為(31.4±4.2)月；相比于PRPF3陰性表達組，PRPF3陽性表達組患者3年總體生存率較低，差異有統計學意義(χ2=6.214，P<0.001)，平均生存時間較短，差異有統計學意義(t=9.152，P<0.001)。

CHEK1陽性表達組的3年總體生存率為33.3%(21/63)，平均生存時間為(23.4±4.3)月；CHEK1陰性表達組3年總體生存率為69.6%(16/23)，平均生存時間為(30.7±4.6)月，相比于CHEK1陰性表達組，CHEK1陽性表達組患者3年總體生存率較低，差異有統計學意義(χ2=5.817，P<0.001)，平均生存時間較短，差異有統計學意義(t=6.840，P<0.001)。見圖4。

2.6單因素及多因素COX比例風險模型分析影響肝細胞肝癌患者預后的危險因素 以患者生存狀態為因變量(1=死亡，0=存活，t=生存時間)，以年齡、性別、腫瘤大小、病理分級、腫瘤TNM分期、肝內轉移、AFP水平、PRPF3、CHEK1為自變量。單因素分析結果表明，腫瘤TNM分期Ⅱ～Ⅲ期、組織低分化、有肝內轉移、PRPF3和CHEK1陽性表達是影響肝細胞肝癌患者預后的因素；多因素Cox回歸分析結果腫瘤組織低分化、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期、有肝內轉移、PRPF3和CHEK1陽性表達是HCC患者不良預后的獨立危險因素。見表2。

表2 單因素及多因素COX比例風險模型分析影響HCC患者預后的危險因素

圖4 PRPF3和CHEK1表達對患者生存預后影響

3 討 論

肝癌是全球癌癥相關死亡中第三大死因，具有發病率高，預后較差等特點。根據病理類型，肝癌分可為HCC，膽管細胞癌和混合型，HCC最為常見，約占所有類型的90%以上。目前，HCC的治療包括手術切除、射頻消融治療及系統治療等，能夠延長患者的生存時間，但部分人群治療后仍可發生腫瘤復發轉移，導致患者死亡[11]。因此，需深入研究HCC的疾病發病規律，尋找新的HCC預后判斷的腫瘤標志物，以指導臨床治療及隨訪。

mRNA前體剪接是轉錄過程中的基本過程，在蛋白質多樣性形成方面發揮著重要作用。 mRNA前體剪接異常也是許多疾病，尤其是惡性腫瘤發生發展的病理學的關鍵[12]。PRPF3作為mRNA前體剪接的重要剪接因子，在核糖核蛋白復合體形成和募集到活性剪接體發揮重要作用[13]。近年來發現，惡性腫瘤中PRPF3在腫瘤中發揮促癌基因的作用，促進腫瘤的惡性進展[5]。本研究發現，HCC癌組織中PRPF3在mRNA及蛋白表達均較正常肝組織明顯升高，與LIU等[6]報道結果一致。PRPF3表達升高的機制可能與轉錄調控有關。研究表明，肝癌中PRPF3的表達水平受孤兒核受體 HNF4α的表達水平調控，HNF4α能結合到PRPF3啟動子區域，促進PRPF3的表達水平[14]。此外，腫瘤分期Ⅱ～Ⅲ期、低分化程度及伴肝內轉移的HCC癌組織中PRPF3表達陽性率較高，提示PRPF3表達升高參與HCC的腫瘤進展。ZUO等[5]研究表明，PRPF3的表達上調通過激活JAK2/STAT3信號通路，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和轉移，阻斷JAK2/STAT3 通路后則能夠逆轉PRPF3誘導的促癌功能。此外，PRPF3的表達升高還能夠通過促進腫瘤微環境中免疫抑制分子如PD-1等的表達，抑制腫瘤殺傷T淋巴細胞的腫瘤殺傷功能，導致腫瘤進展[6]。

DNA 損傷反應能夠保護基因組完整性，可檢測并發出DNA損傷信號以進行后續處理[15-16]。DNA損傷后細胞周期檢查點的激活，促進直接 DNA 修復。當單鏈DNA損傷后，會激活共濟失調毛細血管擴張突變基因Rad3相關激酶(ATR)，進而磷酸化激活CHEK1[15-16]。研究發現，CHEK1可以促進同源重組，穩定并重新啟動停滯的復制叉，進而抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤的增殖[17]。本研究中，HCC癌組織中CHEK1的mRNA及蛋白表達水平明顯高于癌旁組織，提示HCC中CHEK1表達水平上調。分析其原因，可能是CHEK1表達水平受到微小RNA的表達水平調控有關。研究發現，miR-508能夠結合CHEK1mRNA的3′非編碼區，抑制其表達，而腫瘤中miR-508表達水平下調，導致CHEK1 mRNA穩定性升高，促進CHEK1的表達[18]。此外，HCC癌組織中CHEK1的表達水平與腫瘤TNM分期、病理分級及肝內轉移有關，表明CHEK1參與促進HCC的腫瘤進展。有研究報道，CHEK1的表達水平增加能夠促進腫瘤細胞G2/M期的進行，進而導致腫瘤細胞過度增殖，促進腫瘤進展[8]。此外，尚有學者發現，腫瘤中CHEK1的表達能夠促進腫瘤干性的形成，抑制腫瘤細胞對化療藥物的敏感度，導致腫瘤的復發轉移[19]。

本研究進一步分析PRPF3和CHEK1與HCC患者生存預后關系，結果發現PRPF3陽性表達、CHEK1陽性表達的HCC患者生存預后較差，提示PRPF3和CHEK1是判斷HCC患者生存預后的腫瘤標志物。單因素及多因素COX回歸分析進一步證實，PRPF3陽性表達、CHEK1陽性表達是HCC患者不良預后的獨立危險因素。因此，PRPF3和CHEK1是重要的HCC預后預測腫瘤標志物，檢測有助于HCC癌組織中兩者的表達情況有助于判斷HCC患者的預后。本研究通過相關性分析發現，HCC癌組織中PRPF3和CHEK1的表達呈顯著正相關，提示兩者可能存在相互作用的關系。目前兩者之間的具體作用關系尚不清楚，但有學者利用生物信息學分析發現，CHEK1是PRPF3的重要下游調節因子，兩者在肝癌的發生發展中存在協同的關系[6]。因此，其具體作用機制有待深入探索。

綜上所述，HCC中PRPF3、CHEK1表達水平上調，兩者表達與腫瘤TNM分期、病理分級及肝內轉移有關。PRPF3陽性、CHEK1陽性表達的HCC患者生存預后較差，是HCC患者不良生存預后的獨立危險因素，可能成為新的HCC預后判斷的腫瘤標志物。但本研究樣本例數有限，有待擴大樣本量進一步驗證。