胃癌組織CDK12、SIRT6蛋白表達變化及其與臨床病理特征和預后的關系

張杰東，劉蘭俠，劉杜先，王利利

1 南京中醫藥大學附屬南京醫院（南京市第二醫院）病理科，南京 210003；2 南京中醫藥大學附屬南京醫院（南京市第二醫院）臨床科研中心

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是全球范圍內常見的惡性腫瘤之一。近年來，胃癌的發病率不斷上升，發病人群呈年輕化趨勢。大多數胃癌患者早期無明顯癥狀，并且極易發生轉移，預后較差。但目前胃癌發生、發展的分子機制尚不完全清楚。有研究報道，多種生物標志物與胃癌的發生、發展密切相關［1］。細胞周期蛋白依賴性激酶12（CDK12）是一種與轉錄相關的細胞周期蛋白依賴性激酶，主要通過磷酸化C 末端域的RNA 結合蛋白1，調節基因的轉錄。因此，CDK12 蛋白陽性表達可促進胃癌細胞增殖、侵襲和遷移［2］。沉默信號調節蛋白6（SIRT6）是一種具有多種催化活性的蛋白酶，除了能抑制細胞衰老外，在調控基因表達、維持端粒穩定、修復DNA 以及葡萄糖和脂肪代謝等過程中發揮重要作用。SIRT6 蛋白陽性表達有助于維持機體細胞增殖、分化和凋亡，在一定程度上抑制胃癌的發生、發展［3］。本研究探討了胃癌組織CDK12、SIRT6蛋白表達變化及其與臨床病理特征和預后的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年3月—2019年3月南京中醫藥大學附屬南京醫院收治的胃癌患者75例。所有患者符合《內科腫瘤學》［4］中胃癌的診斷標準，并經術后病理檢查明確診斷。納入標準：①符合原發性胃癌診斷標準；②初診，術前未接受任何抗腫瘤治療；③接受腹腔鏡胃癌切除術。排除標準：①合并胃潰瘍、萎縮性胃炎等其他胃部疾病者；②合并其他部位惡性腫瘤者；③合并內分泌功能紊亂或免疫功能缺陷者。其中，男39例，女36例；年齡36～83歲，＜60歲22 例、≥60 歲53 例；BMI 17～26 kg/m2，＜24 kg/m252例、≥24 kg/m223例；Lauren分型：腸型36例，彌漫型39 例；腫瘤直徑2～9 cm，＜5 cm 38 例、≥5 cm 37例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期44 例，Ⅲ、Ⅳ期31 例；組織分化程度：高分化27例，中分化26例，低分化22例；有脈管侵犯33 例，無脈管侵犯42 例；有淋巴結轉移49例，無淋巴結轉移26例；有遠處轉移32例，無遠處轉移43 例。本研究經南京中醫藥大學附屬南京醫院醫學倫理委員會審核批準（審批編號：2017-LYkt012）。所有研究對象或其家屬知情同意并簽署書面知情同意書。

1.2 CDK12、SIRT6 蛋白表達檢測 采用免疫組化法。取手術切除的胃癌組織及其配對的癌旁組織（距腫瘤組織邊緣＞5 cm，并經術后病理檢查證實為正常胃組織），10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，5 μm 厚連續切片。切片經60 ℃烤片30 min，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3% H2O2滅活內源性過氧化物酶，檸檬酸鈉緩沖液煮沸修復抗原，室溫自然冷卻。5%正常山羊血清室溫封閉30 min，滴加CDK12、SIRT6 蛋白一抗，4 ℃孵育過夜。次日，滴加辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃孵育20 min。DAB 顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下拍照觀察。

結果判定：CDK12、SIRT6 蛋白陽性染色均定位于細胞核，呈淺黃色至棕褐色顆粒狀。染色強度評分：以陽性細胞呈色反應為準，無著色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。每張切片隨機選取5個200倍不重疊視野，計數陽性細胞數和細胞總數，計算陽性細胞比例。陽性細胞比例評分：無陽性細胞為0 分，陽性細胞比例≤10%為1 分，陽性細胞比例＞10%～30%為2 分，陽性細胞比例＞30%～50%為3 分，陽性細胞比例＞50%為4 分。根據染色程度和陽性細胞比例半定量分析，以染色強度評分與陽性細胞比例評分的乘積綜合評價。CDK12 蛋白表達評價［5］：≤3 為陰性表達，4～6 為弱陽性表達，7～9 為中度陽性表達，≥10 為強陽性表達。陰性、弱陽性表達視為CDK12 蛋白低表達，中度陽性、強陽性表達視為CDK12 蛋白高表達。SIRT6 蛋白表達評價［6］：≤1 為陰性表達，＞1 為陽性表達。

1.3 隨訪 所有患者出院后以電話或門診復查形式定期隨訪，隨訪截至患者死亡或出院后3年，統計患者生存情況，計算3年生存率。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。計數資料以例（%）表示，結果比較采用χ2檢驗或秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織CDK12、SIRT6 蛋白陽性表達比較 胃癌組織與癌旁正常組織CDK12蛋白陽性表達率分別為86.67%（65/75）、16.00%（12/75），SIRT6 蛋白陽性表達率分別為45.33%（34/75）、77.33%（58/75）。胃癌組織CDK12 蛋白陽性表達率顯著高于癌旁正常組織（χ2=82.986，P＜0.05），SIRT6 蛋白陽性表達率顯著低于癌旁正常組織（χ2=16.192，P＜0.05）。

2.2 胃癌組織CDK12、SIRT6 蛋白表達與臨床病理特征的關系 見表1。

表1 胃癌組織CDK12、SIRT6蛋白表達與臨床病理特征的關系［例（%）］

2.3 胃癌組織CDK12、SIRT6 蛋白表達與預后的關系 隨訪3年，75例胃癌患者中死亡17例，3年生存率為77.33%（58/75）。75 例胃癌患者中，胃癌組織CDK12 蛋白高表達者42 例，死亡14 例，3年生存率為66.67%（28/42）；胃癌組織CDK12 蛋白低表達者33 例，死亡3 例，3年生存率為90.91%（30/33）。胃癌組織CDK12蛋白高表達者3年生存率顯著低于胃癌組織CDK12 蛋白低表達者（χ2=6.196，P＜0.05）。胃癌組織SIRT6 蛋白陽性表達者34 例，死亡4 例，3年生存率為88.24%（30/34）；胃癌組織SIRT6 蛋白陰性表達者41 例，死亡13 例，3年生存率為68.29%（28/41）。胃癌組織SIRT6 蛋白陽性表達者3年生存率顯著高于胃癌組織SIRT6 蛋白陰性表達者（χ2=4.217，P＜0.05）。

3 討論

胃癌是全球范圍內常見的惡性腫瘤之一，其發病率僅次于肺癌、乳腺癌和結直腸癌。我國是胃癌的高發國家之一，每年新發病例約50萬例。胃癌起病隱匿，早期癥狀輕微且不典型，大多數患者出現明顯癥狀就診時已進展至中晚期，錯過了最佳治療時機，預后較差［7-9］。有研究報道，我國胃癌患者5年生存率不足20%［10-11］。近年來，隨著分子生物學不斷發展，轉錄因子及信號通路在惡性腫瘤發生、發展中的作用逐漸受到重視，同時伴隨個體化治療理念的普及推廣，針對轉錄因子及信號通路調控因子的靶向治療在惡性腫瘤治療中的價值日益凸顯［12］。因此，分子靶向治療成為胃癌精準治療的理想選擇。但由于胃癌發生的分子機制非常復雜，臨床上一直缺乏精準的治療靶點。

CDK12 是一種與轉錄相關的周期蛋白依賴性激酶，能夠參與細胞的多種生理過程，如DNA 損傷修復、mRNA 剪接以及細胞增殖和分化等。有研究報道，CDK12 基因定位于人染色體17q12，其編碼蛋白在多種惡性腫瘤細胞中過表達［13］。有研究報道，敲除CDK12可導致DNA損傷反應敏感性改變［14］，提示CDK12 在DNA 損傷應答及修復中具有重要的調控作用。有研究發現，CCL12 可調控與腫瘤浸潤和淋巴結轉移有關的腫瘤細胞和免疫細胞的生物學功能，而CCL12 為CDK12 的下游效應基因［15］。由此推測，CDK12 可能通過CCL12 相關信號通路調節腫瘤微環境，從而促進胃癌細胞侵襲和遷移。本研究結果顯示，胃癌組織CDK12 蛋白陽性表達率顯著高于癌旁正常組織；胃癌組織CDK12 蛋白表達與腫瘤臨床分期、組織分化程度、脈管侵犯、淋巴結轉移、遠處轉移有關，與性別、年齡、BMI、Lauren 分型、腫瘤直徑無關；進一步研究發現，胃癌組織CDK12 蛋白高表達者3年生存率顯著低于胃癌組織CDK12蛋白低表達者。結果表明，胃癌組織CDK12 蛋白高表達，其高表達能夠促進胃癌的發生、發展并與患者預后不良密切相關。

SIRT6 是一種具有多種催化活性的蛋白酶，可促進轉錄因子E2F1去乙酰化，從而抑制其功能。轉錄因子E2F1 在致癌信號和DNA 損傷的影響下可促使S 期細胞數量增加，并能抑制細胞凋亡。因此，SIRT6 可能具有抑制惡性腫瘤發生、發展的作用［16］。此外，SIRT6 陽性表達有助于其形成二聚體并與多種結合酶結合，抑制Akt/RAS/MEK/ERK 信號通路激活，阻止細胞增殖、遷移，進而預防細胞癌變；而SIRT6 陰性表達可促進Wnt 信號通路激活，促進β-連環蛋白從細胞質轉移至細胞核，并與其靶點特異性結合，促進抑制細胞凋亡基因過表達，導致細胞增殖與凋亡失衡，從而促進腫瘤的發生、發展［17］。本研究結果顯示，胃癌組織SIRT6 蛋白陽性表達率顯著低于癌旁正常組織；胃癌組織SIRT6 蛋白表達與腫瘤臨床分期、組織分化程度、脈管侵犯、淋巴結轉移、遠處轉移有關，與性別、年齡、BMI、Lauren 分型、腫瘤直徑無關；胃癌組織SIRT6 蛋白陽性表達者3年生存率顯著高于胃癌組織SIRT6 蛋白陰性表達者。結果表明，胃癌組織SIRT6蛋白低表達，其低表達能夠促進胃癌的發生、發展并與患者預后不良密切相關。

綜上所述，胃癌組織CDK12 蛋白高表達、SIRT6蛋白低表達，二者表達變化與腫瘤臨床分期、組織分化程度、脈管侵犯、淋巴結轉移、遠處轉移等臨床病理特征以及患者預后密切相關。