基于脂質(zhì)組學(xué)的海洋顆石藻病毒甾醇去飽和酶及脂肪酸去飽和酶基因功能分析*

馬 暉 王彩鳳 李桂玲 李 健 劉靜雯

基于脂質(zhì)組學(xué)的海洋顆石藻病毒甾醇去飽和酶及脂肪酸去飽和酶基因功能分析*

馬 暉 王彩鳳 李桂玲 李 健 劉靜雯①

(集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院 福建廈門(mén) 361021)

赫氏顆石藻()宿主-病毒(.virus, EhV)的互作過(guò)程是影響海洋碳、硫生物地球化學(xué)循環(huán)及氣候變化的重要環(huán)節(jié)。在共進(jìn)化過(guò)程中, EhV通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移從宿主基因組中“劫獲”了一組鞘脂從頭合成相關(guān)酶基因, 重構(gòu)宿主脂代謝網(wǎng)絡(luò)以支持病毒的特殊需求。目前, 對(duì)病毒這組相關(guān)酶基因的生物學(xué)功能尚不十分清楚。以顆石藻病毒EhV-99B1基因組中的甾醇去飽和酶(EhV-SD)和脂肪酸去飽和酶(EhV-FAD)基因?yàn)檠芯繉?duì)象, 構(gòu)建釀酒酵母重組表達(dá)載體pYES2/CT-SD和pYES2/CT-FAD, 轉(zhuǎn)化相應(yīng)的基因缺陷型酵母菌株YMR015C和YGL055W獲得重組酵母細(xì)胞株, 進(jìn)一步采用UPLC-Q-Exactive-MS非靶向脂質(zhì)組學(xué)技術(shù), 比較分析重組酵母和缺陷型酵母細(xì)胞脂質(zhì)的組成和含量變化。結(jié)果顯示, EhV-與EhV-基因在釀酒酵母中成功表達(dá)并具有生物學(xué)活性。EhV-SD過(guò)表達(dá)顯著改變了重組酵母細(xì)胞脂質(zhì)代謝, 含多不飽和酰基鏈的磷脂酰膽堿(PC, 20︰4/20︰5/20︰6)和甘油三酯(TAG, 12︰3)種類(lèi)的豐度顯著升高; 而部分多不飽和脂肪酸(FA, 16︰2/16︰4)和含多不飽和酰基鏈的磷脂酰甘油(PG, 16︰2/18︰4)豐度則顯著降低。EhV-FAD過(guò)表達(dá)顯著增加了重組酵母中單不飽和脂肪酸的生物合成, 特別是棕櫚油酸(C16︰1)和油酸(C18︰1)顯著積累, 而飽和脂肪酸的含量則顯著降低, 表明EhV-FAD與酵母Δ9FAD具有類(lèi)似的生物學(xué)功能。海洋病毒中脂質(zhì)代謝相關(guān)新基因功能的確定, 有助于從代謝角度深入認(rèn)識(shí)海洋病毒-宿主的互作關(guān)系, 也為相關(guān)功能基因在生物技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

海洋顆石藻病毒; 甾醇去飽和酶基因; 脂肪酸去飽和酶基因FAD; 釀酒酵母; 非靶向 脂質(zhì)組學(xué)

顆石藻(Coccolithophores)是一種全球廣泛分布且具有重要生態(tài)功能的真核微型浮游植物, 其中赫氏顆石藻(Eh)具有形成“球石粒”和高產(chǎn)二甲基硫化物(DMSP)的能力, 且?guī)缀趺磕甓荚诖笱?尤其是高緯度海域)中形成大面積赤潮(Daniels, 2018), 該藻赤潮迅速大規(guī)模消亡被證實(shí)是特異性病毒(.virus: EhVs)感染和裂解所致(Ruiz, 2017)。因此, EhV-Eh的互作過(guò)程是影響海洋碳、硫生物地化循環(huán)及氣候變化的重要環(huán)節(jié), 并在重塑海洋生物群落結(jié)構(gòu)、地質(zhì)演變中具有重要地位(Sheyn, 2018; Johns, 2019)。

在共進(jìn)化過(guò)程中, EhV通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移從宿主基因組中“劫獲”了一組鞘脂從頭生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因, 如絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(SPT)、甾醇去飽和酶(SD)、脂肪酸去飽和酶(FAD)、脂類(lèi)磷酸酶(LPP)、糖基轉(zhuǎn)移酶(GT)以及二氫神經(jīng)酰胺合成酶/長(zhǎng)壽保障基因類(lèi)蛋白(Cers/LAG1)等, 并在一定程度上掌控宿主鞘脂代謝, 為病毒謀福利(Wilson, 2005; Lindell, 2007; Rose, 2014; Nissimov, 2017)。鞘脂代謝相關(guān)酶基因廣泛存在于高等動(dòng)植物及酵母基因組中, 但在海洋病毒中尚屬首次發(fā)現(xiàn)(Wilson, 2005)。作為一種大型雙鏈DNA病毒, EhV感染顆石藻顯著影響宿主脂質(zhì)代謝, 特別是深度重塑了宿主鞘脂代謝過(guò)程以滿足自身的代謝需求(Rosenwasser, 2014; Malitsky, 2016; Zeng, 2019)。鞘脂既是真核細(xì)胞膜的重要結(jié)構(gòu)成分, 也是膜上“脂筏”的主要功能成分, 參與物質(zhì)內(nèi)吞、跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種細(xì)胞過(guò)程, 被認(rèn)為是病原微生物進(jìn)出細(xì)胞的一種門(mén)戶(hù)(Rose, 2014)。以色列學(xué)者2016年首次詳細(xì)報(bào)道了EhV編碼的絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶vSPT(鞘脂從頭生物合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵限速酶)的功能, 在感染的藻宿主細(xì)胞中該酶催化合成病毒特有的新型鞘糖脂(vGSLs), 該物質(zhì)是病毒組裝的必要物質(zhì)基礎(chǔ)(Ziv, 2016)。另外, vGSLs還能作為信號(hào)分子誘發(fā)活性氧(reactive oxygen species, ROS) H2O2(Sheyn, 2016)和一氧化氮(Vardi, 2009; 2012)的產(chǎn)生, 進(jìn)而啟動(dòng)宿主依賴(lài)于凋亡特征蛋白酶metacaspase的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程, 最終裂解藻細(xì)胞釋放子代病毒粒子(Bidle, 2007; Liu, 2018; 蘇金凈等, 2019)。除此之外, vGSLs還可能參與調(diào)控顆石藻復(fù)雜的單倍體/二倍體生活史過(guò)程, 使某些宿主細(xì)胞停留于二倍體世代以利于病毒的感染和增殖(Hunter, 2015)。目前, 除了EhV-SPT基因外, EhV基因組中其他鞘脂代謝相關(guān)酶基因的功能尚不清楚。

在酵母細(xì)胞中, 甾醇去飽和酶主要包括C22-SD甾醇去飽和酶和C-5甾醇去飽和酶, C22-SD甾醇去飽和酶由基因編碼, 是酵母細(xì)胞麥角甾醇生物合成的限速酶, 屬于細(xì)胞色素P-450 (CYP450)的一種(Skaggs, 1996)。C22-SD能夠在甾醇側(cè)鏈中引入一個(gè)雙鍵, 催化酵母麥角甾醇-5,7,24(28)-三烯醇轉(zhuǎn)變?yōu)辂溄晴薮?5,7,22,24(28)-四烯醇, 然后ERG4p (C24=28亞甲基還原酶)將麥角甾醇-5,7,22,24(28)-四烯醇去飽和形成麥角甾醇(林曉珊等, 2010)。在釀酒酵母()中過(guò)表達(dá)ERG5導(dǎo)致麥角甾醇生物合成能力降低(蔡鵬麗等, 2007)。C-5甾醇去飽和酶由基因編碼, 該酶的作用是在表甾醇B環(huán)的C-5和C-6位置各引入一個(gè)雙鍵(Nakamura, 2004)。另外,基因的表達(dá)同時(shí)也影響其他脂質(zhì)的代謝, 如敲除基因的酵母大量合成甘油并分泌至胞外, 導(dǎo)致細(xì)胞耐鹽性降低(王慧等, 2020)。脂肪酸去飽和酶(FAD)是不飽和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶, 決定脂肪酸的不飽和程度。FAD種類(lèi)較多, 廣泛存在于動(dòng)植物、藻類(lèi)及真菌中。FAD在釀酒酵母中主要催化合成單不飽和脂肪酸。Δ9FAD是不飽和脂肪酸合成過(guò)程中的第一個(gè)酶, 在釀酒酵母中該酶能將雙鍵引入飽和脂肪酸C16:0/C18:0去飽和產(chǎn)生單不飽和脂肪酸C16:1/C18:1 (Stukey, 1990; Nagao, 2019)。由于釀酒酵母的基因組注釋完整且遺傳操作簡(jiǎn)單, 因此適合作為研究真核生物代謝遺傳學(xué)及生化機(jī)制的模式微生物(楊志剛等, 2014)。有學(xué)者將螺旋藍(lán)藻(sp.)基因在釀酒酵母中進(jìn)行功能表達(dá), 成功獲得了亞麻酸(Kurdrid, 2005)。Ma等人(2011)將海洋微藻()中基因克隆入釀酒酵母成功表達(dá), 該基因與釀酒酵母基因具有相似的去飽和酶活性。最近, 在光滑球擬酵母() med15Δ菌株中過(guò)表達(dá)脂肪酸延伸酶基因和去飽和酶基因能夠通過(guò)提高不飽和脂肪酸的含量增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)低pH脅迫的耐受能力(齊艷利等, 2021)。

本研究分別以()和()基因敲除釀酒酵母菌株YMR015C和YGL055W作為實(shí)驗(yàn)菌株。PCR擴(kuò)增EhV99B1基因組中的EhV-和EhV-基因, 構(gòu)建釀酒酵母重組表達(dá)載體pYES2/CT-SD和pYES2/CT-FAD, 分別轉(zhuǎn)化相應(yīng)基因缺陷型酵母細(xì)胞并誘導(dǎo)過(guò)表達(dá), 然后采用UPLC-Q-Exactive-MS非靶向脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較分析重組酵母和缺陷型酵母細(xì)胞脂質(zhì)組成和含量的變化, 初步確定病毒EhV99B1基因組編碼的上述兩個(gè)鞘脂代謝酶可能的功能。為深入了解脂代謝在顆石藻病毒與宿主互作過(guò)程中的調(diào)節(jié)作用提供新的理論認(rèn)識(shí), 也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)合成新型鞘脂的酵母細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

顆石藻病毒EhV-99B1株系分離自挪威海域(Schroeder, 2002), 由挪威卑爾根大學(xué)Gunnar bratbak教授贈(zèng)送。野生型釀酒酵母BY4741及()、()基因缺失型酵母菌株YMR015C和YGL055W均購(gòu)自EUROSCARF菌種庫(kù)(德國(guó)法蘭克福大學(xué)微生物研究所); 大腸桿菌Top10購(gòu)自泰京生物科技有限公司(中國(guó), 廈門(mén)); 克隆載體pMD19-T購(gòu)自TaKaRa公司(日本), 釀酒酵母表達(dá)載體pYES2/CT購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó))。

1.2 儀器與試劑

四級(jí)桿軌道阱雜交傅里葉變換超高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermofisher, Q-Exactive), 超高液相色譜儀(美國(guó)Waters, ACQUITY UPLC), 高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)BECKMAN COULTER, Avanti J-26S XP), 全自動(dòng)樣品快速研磨儀(上海凈信, Tissuelyser-24)。戊二醛、甲醇、氯仿購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司, 均為色譜級(jí)純。..EasyComp?釀酒酵母轉(zhuǎn)化試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó))。

1.3 酵母重組表達(dá)載體pYES2/CT-SD和pYES2/ CT-FAD的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

以實(shí)驗(yàn)室保存的含病毒EhV-和EhV-基因的重組質(zhì)粒pMD19-T-SD和pMD19-T-FAD作為模板, PCR擴(kuò)增目的基因, 擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工測(cè)序驗(yàn)證, EhV-和EhV-基因GenBank登錄號(hào)分別為CAZ369370和YP_293815。分別用限制性?xún)?nèi)切酶I /I和I /I對(duì)載體pMD19-T-SD、pMD19-T-FAD以及釀酒酵母表達(dá)載體pYES2/CT進(jìn)行雙酶切, 構(gòu)建酵母重組表達(dá)載體pYES2/CT-SD和pYES2/CT-FAD, 分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞, 篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行質(zhì)粒PCR和雙酶切驗(yàn)證。采用釀酒酵母轉(zhuǎn)化試劑盒(..EasyComp?)將重組表達(dá)載體pYES2/CT-SD和pYES2/CT-FAD分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母相應(yīng)基因缺陷型菌株YMR015C和YGL055W感受態(tài)細(xì)胞, 空載pYES2/CT作為對(duì)照分別轉(zhuǎn)化上述兩株基因缺陷型菌株, 具體操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于15 mL的SC選擇培養(yǎng)基(含有50 μg/mL卡那抗生素、20 g/L葡萄糖)中, 30 °C過(guò)夜培養(yǎng), 挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證, 確定陽(yáng)性子。

1.4 重組質(zhì)粒在釀酒酵母細(xì)胞中的誘導(dǎo)表達(dá)

將兩株對(duì)照菌株及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌株分別接種到含有2% D-半乳糖的SC-U培養(yǎng)基中, 30 °C誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h, 野生型釀酒酵母菌株BY4741在YDP培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。分別離心收集20 mL細(xì)胞沉淀, 液氮速凍后保存于-80 °C用于總脂和RNA的提取。每組樣品設(shè)置4～5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.5 細(xì)胞總脂的提取

向上述5組樣品中分別加入500 μL甲醇溶液和8個(gè)小鋼珠, 添加適量液氮, 在全自動(dòng)樣品快速研磨儀上快速研磨(65 Hz, 6次/3 min), 然后加入1 mL氯仿和417 μL Milli-Q水并充分混勻, 常溫靜止5 min待其分層, 取每管下層有機(jī)相250 μL作為粗脂樣品。每管樣品剩余的下相混合后取250 μL作為質(zhì)控樣本(quality control, QC), 將粗脂樣品與QC同時(shí)離心濃縮, 置于-80 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 UPLC-Q-Exactive-MS 檢測(cè)分析

1.6.1 液相條件 本實(shí)驗(yàn)中所用的儀器為超高效液相色譜儀與四級(jí)桿和軌道阱雜交傅里葉變換超高分辨質(zhì)譜儀串聯(lián)系統(tǒng)(UPLC-Q-Exactive-MS)。色譜柱為AQUITY UPLC BEH C8 (2.5 mm×100 mm, 1.7 μm,沃特世)。二元溶劑系統(tǒng)流動(dòng)相A為己烷和異丙醇︰乙腈(IPA︰ACN)=90︰10 (含10 mmol/L的醋酸銨), 流動(dòng)相B 為CAN︰H2O=60︰40 (含10 mmol/L的醋酸銨),洗脫梯度為: 初始比例為32%的流動(dòng)相B持續(xù)1.5 min, 然后在14 min內(nèi)線性增加到85%, 接著在0.1 min內(nèi)從85%增加到97%, 并保持2.4 min, 最后在0.1 min內(nèi)重新回到初始流動(dòng)相比例并保持1.9 min,流速為0.26 mL/min。

1.6.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源(ESI), 正負(fù)離子檢測(cè), 鞘氣流速(Sheath Gas Flow Rate)為55 arb, 輔助氣流速(Aux Gas Flow Rate)為12, 噴霧電壓(Spray Voltage)3 kV, 毛細(xì)管電壓3.0 kV, 干燥氣體(Desolvation Temperature)溫度為265 °C, 毛細(xì)管電壓(Capillary Voltage)2.5 kV, 質(zhì)量掃描范圍為100～1 500質(zhì)荷比, 采取針泵自動(dòng)進(jìn)樣, 每次進(jìn)樣量為6 μL, 進(jìn)樣室溫為10 °C。

1.6.3 質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)分析 采用面積歸一化半定量分析方法, 根據(jù)待測(cè)組分峰面積與所有峰面積和的百分比對(duì)粗脂進(jìn)行半定量分析。以準(zhǔn)確的質(zhì)荷比、串聯(lián)質(zhì)譜法碎裂模式和保留行為為基礎(chǔ), 基于LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫(kù), 用LipidSearch 和Xcalibur (Thermo, 美國(guó))軟件鑒定脂質(zhì)種類(lèi)。UPLC-Q-Exactive-MS獲得的原始數(shù)據(jù), 利用MS-DIAL v2.94進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理, 再利用每個(gè)樣本的總離子流進(jìn)行歸一化處理。在統(tǒng)計(jì)分析之前, 將所有樣品的峰面積標(biāo)準(zhǔn)化為細(xì)胞沉淀的干重, 然后每個(gè)脂類(lèi)樣品峰面積分別和總峰面積相比進(jìn)行半定量分析。將標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)集導(dǎo)入SIMCA-P 軟件(瑞典Umetrics)進(jìn)行單變量和多元變量統(tǒng)計(jì)分析,用MeV構(gòu)建熱圖以顯現(xiàn)所有實(shí)驗(yàn)組中脂質(zhì)和脂質(zhì)類(lèi)別的相對(duì)水平。采用SPSS 17.0進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn), 以變量在項(xiàng)目中的重要性(VIP值 > 1), |FC| > 2以及檢驗(yàn)< 0.001確定差異代謝物。

1.7 qRT-PCR檢測(cè)EhV-SD和EhV-FAD基因的表達(dá)

使用RNA提取試劑盒(RNA simple total RNA Kit, DP419, 天根)提取細(xì)胞總RNA。使用Hiscript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Hiscript II Q RTSuperMix, 諾唯贊)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 反應(yīng)程序?yàn)? 55 °C, 15 min; 85 °C, 5 s。利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)內(nèi)參基因(-actin)和兩種目的基因引物, 引物序列如表1。qRT-PCR反應(yīng)體系為10 μL, 其中包括1 μL cDNA, 5 μL 1×SYBR Green Premix預(yù)混液(Vazyme, 中國(guó)), 3.6 μL dd H2O和0.2 μL F/R引物, 每個(gè)樣品三個(gè)生物學(xué)重復(fù), qRT-PCR使用Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR系統(tǒng)。qRT-PCR反應(yīng)參數(shù)為: 第一階段: 95 °C 30 s進(jìn)行初始變性; 第二階段: 95 °C 30 s, 60 °C 30 s, 50個(gè)循環(huán); 第三階段: 95 °C 15 s, 60 °C 60 s, 99 °C 15 s, 60 °C 15 s。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± SD)表示, 顯著性差異采用檢驗(yàn)。*表示<0.05, 差異顯著; **表示<0.01; ***表示<0.001, 差異極顯著。利用Origin 2019b和Adobe illustrator軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行做圖分析。

2 結(jié)果

2.1 酵母重組質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá)

重組表達(dá)載體pYES2/CT-SD和pYES2/CT-FAD的質(zhì)粒PCR和雙酶切結(jié)果見(jiàn)圖1, EhV-和EhV-基因片段分別為987 bp (圖1a)和963 bp (圖1b), 符合預(yù)期大小, 重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示, EhV-和EhV-基因分別在相應(yīng)的重組酵母細(xì)胞中發(fā)生了不同程度的表達(dá), 含空載質(zhì)粒的酵母細(xì)胞均未擴(kuò)增出產(chǎn)物。

表1 qRT-PCR所用引物

圖1 重組表達(dá)載體pYES2/CT-SD和pYES2/CT-FAD的質(zhì)粒PCR及雙酶切鑒定結(jié)果

注: a. 重組表達(dá)載體pYES2/CT-SD的質(zhì)粒PCR和雙酶切電泳結(jié)果圖; b. 重組表達(dá)載體pYES2/CT-FAD的質(zhì)粒PCR和雙酶切電泳結(jié)果圖; M1: 5 000 bp DNA Ladder Marker; M2: 2 000 bp DNA Ladder Marker; 泳道1: 重組表達(dá)載體pYES2/CT-SD(a)和pYES2/CT-FAD(b); 泳道2: 表達(dá)載體pYES2/CT(a-b); 泳道3: 重組表達(dá)載體pYES2/CT-SD(a)和pYES2/CT-FAD(b)的質(zhì)粒PCR結(jié)果; 泳道4: 重組表達(dá)載體pYES2/CT-SD(a)和pYES2/CT-FAD(b)的雙酶切結(jié)果

2.2 基于Omics的統(tǒng)計(jì)分析

在上述色譜與質(zhì)譜條件下, 空載和重組酵母細(xì)胞的總脂提取物在反向色譜柱上得到了良好的分離, 選取正離子模式下四種釀酒酵母的總離子流(TIC)為代表展示不同釀酒酵母細(xì)胞中總脂的分離情況(圖2)。依據(jù)脂質(zhì)精確質(zhì)量數(shù)、保留時(shí)間、二級(jí)質(zhì)譜信息及LIPID MAPS數(shù)據(jù)庫(kù)等信息, 在正、負(fù)離子模式下, 空載和EhV-SD重組酵母細(xì)胞中共鑒定出27種脂質(zhì)代謝物, 其中正離子模式下19種271個(gè), 負(fù)離子模式下20種156個(gè), 正負(fù)離子模式下同時(shí)鑒定出的為溶血磷脂酰膽堿(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰膽堿(PC)等12種脂質(zhì)。空載和EhV-FAD重組酵母細(xì)胞中共鑒定出29種脂質(zhì)代謝物, 其中正離子模式下19種203個(gè), 負(fù)離子模式下22種150個(gè), 正負(fù)離子模式下同時(shí)鑒定出的為L(zhǎng)PC、磷脂酰甘油(PG)、PE和PC等12種。

圖2 正離子模式下酵母細(xì)胞總脂的總離子流圖

注: a. 空載酵母YMR015C細(xì)胞總脂的離子流圖; b. EhV-SD重組酵母YMR015C細(xì)胞總脂的離子流圖; c. 空載酵母YGL055W細(xì)胞總脂的離子流圖; d. EhV-FAD重組酵母YGL055W細(xì)胞總脂的離子流圖

正負(fù)離子模式下五組酵母細(xì)胞脂質(zhì)數(shù)據(jù)的主成分分析(PCA)得分圖中, 各組樣品在PCA得分圖的第一、第二主成分上被清晰地區(qū)分開(kāi)(圖3)。經(jīng)建模分析, 該模型正離子模式下對(duì)X矩陣的解釋率(2)為70.2% (圖3a), 負(fù)離模式下2為81.4% (圖3b), 表明脂質(zhì)組學(xué)分析的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。

通過(guò)有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析OPLS-DA模型, 空載和EhV-SD重組酵母細(xì)胞脂質(zhì)在圖中能較好地分開(kāi)(圖4)。正負(fù)離子模式下EhV-SD重組酵母細(xì)胞和空載酵母細(xì)胞樣品之間, 該模型對(duì)Y矩陣的解釋率(2)和模型的預(yù)測(cè)率(2)均高于60%, 模型對(duì)Y矩陣的預(yù)測(cè)率(2)值大于60%, 且2與2之間的差值小于0.3 (圖4a, 4c), 表明模型的預(yù)測(cè)能力良好。通過(guò)交叉排列驗(yàn)證對(duì)模型有效性進(jìn)一步驗(yàn)證, 經(jīng)過(guò)200次置換驗(yàn)證的結(jié)果顯示(圖4b, 4d),2與2接近,2的斜率大于0且2<0.05, 說(shuō)明模型沒(méi)有明顯的過(guò)擬合現(xiàn)象, 能較好地反映空載和EhV-SD重組酵母樣品脂類(lèi)代謝物之間的差異。

EhV-FAD重組釀酒酵母細(xì)胞脂質(zhì)OPLS-DA圖和交叉驗(yàn)證圖結(jié)果如圖5所示。在正、負(fù)離子模式下EhV-DAD重組酵母細(xì)胞和空載酵母樣品2與2之間的差值小于0.3, 且2值大于60 %, 表明模型的預(yù)測(cè)能力良好(圖5a, 5c)。通過(guò)交叉排列驗(yàn)證對(duì)模型有效性進(jìn)一步驗(yàn)證, 經(jīng)過(guò)200次置換驗(yàn)證(圖5b, 5d),2和2相交,2的斜率大于0且2<0.05, 說(shuō)明所建立的模型沒(méi)有過(guò)擬合現(xiàn)象。綜上, 四組不同釀酒酵母在正、負(fù)離子檢測(cè)模式下獲得的UHPLC- (+)ESIMS數(shù)據(jù)矩陣所構(gòu)建數(shù)據(jù)模型具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 正負(fù)離子模式下五組酵母細(xì)胞總脂的主成分分析圖

注: a. 正離子模式下五組酵母細(xì)胞總脂的主成分分析圖; b. 負(fù)離子模式下五組酵母細(xì)胞總脂的主成分分析圖; 1. 藍(lán)色圓圈代表空載酵母YMR015C; 2. 綠色方形代表EhV-SD重組酵母YMR015C; 3. 紅色三角代表空載酵母YGL055W; 4. 橙色菱形代表野生型酵母BY4741; 5. 紫色圓圈代表EhV-FAD重組酵母YGL055W

圖4 EhV-SD重組酵母細(xì)胞脂質(zhì)OPLS-DA和交叉驗(yàn)證圖

注: a. 正離子模式下OPLS-DA圖; b. 正離子模式下交叉驗(yàn)證圖; c. 負(fù)離子模式下OPLS-DA圖; d. 負(fù)離子模式下交叉驗(yàn)證圖; 1. 藍(lán)色圓圈代表空載酵母YMR015C; 2. 綠色方形代表EhV-SD重組酵母YMR015C; OPSL-DA: 正交偏最小二乘判別分析;2: 常規(guī)相關(guān)系數(shù);2: 交叉驗(yàn)證系數(shù); Correlation Coefficien: 樣本得分值和變量間相關(guān)系數(shù)

圖5 EhV-FAD重組酵母脂質(zhì)OPLS-DA和交叉驗(yàn)證圖

注: a. 正離子模式下OPLS-DA圖; b. 正離子模式下交叉驗(yàn)證圖; c. 負(fù)離子模式下OPLS-DA圖; d. 負(fù)離子模式下交叉驗(yàn)證圖; 3. 紅色三角代表空載酵母YGL055W; 5. 紫色圓圈代表EhV-FAD重組酵母YGL055W; OPSL-DA: 正交偏最小二乘判別分析;2:常規(guī)相關(guān)系數(shù);2: 交叉驗(yàn)證系數(shù); 相關(guān)系數(shù): 樣本得分值和變量間相關(guān)系數(shù)

2.3 差異脂質(zhì)的鑒定和分析

利用火山圖對(duì)不同酵母細(xì)胞中差異脂質(zhì)代謝物的分布及統(tǒng)計(jì)學(xué)差異進(jìn)行分析, 篩選條件為log2(FC)> 1、<0.05。進(jìn)一步利用OPLS-DA模型中的變量權(quán)重值(variable importance for the projection, VIP)挖掘具有生物學(xué)意義的差異脂質(zhì)分子, 根據(jù)VIP＞1、|log2(FC)|＞1和＜0.001的條件對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行交叉篩選, 綜合以上多變量與單變量分析, 在正、負(fù)離子模式下, 與空載酵母相比, EhV-SD重組酵母中共鑒定出20種差異脂質(zhì)代謝物, 主要包括脂肪酸(FA)、神經(jīng)酰胺(Cer)、甘油三酯(TAG)、1,2二棕櫚酰甘油三甲基高絲氨酸(DGTS)、甘油二酯(DAG)及磷脂類(lèi)(PE、磷脂酰絲氨酸PS、LPE)等, 其中正離子模式下10種34個(gè), 負(fù)離子模式下10種30個(gè)。與空載酵母相比, EhV-FAD重組酵母中共鑒定出22種差異脂質(zhì)代謝物, 主要是甘油酯(TAG、DAG)、磷脂(PC、PG、PE)、脂肪酸(FA、羥基脂肪酸支鏈脂肪酸(FAHFA)和神經(jīng)酰胺類(lèi)(Cer), 其中正離子模式下15種64個(gè), 負(fù)離子模式下17種114個(gè)。

將總峰面積法矯正后獲得的各種脂類(lèi)的含量進(jìn)行具體分析, 運(yùn)用MeV4.9.0軟件對(duì)鑒定出的差異脂質(zhì)代謝物繪制熱圖(圖6)。與空載酵母相比, EhV-SD重組酵母細(xì)胞中的差異脂質(zhì)代謝物根據(jù)Pearson相關(guān)系數(shù)被聚類(lèi)為3種明顯的變化趨勢(shì)(圖6a), 豐度相對(duì)較低的脂類(lèi)主要集中在Ⅰ組, 包括神經(jīng)酰胺類(lèi)的二羥鞘氨醇(Cer-NDS)和無(wú)羥基神經(jīng)酰胺(Cer-NS),磷脂PC、PG、PS及LPE, 脂肪酸FAHFA和 FA及葡萄糖醛酸糖脂(Glc-ADG)。α-羥基鞘氨醇神經(jīng)酰胺(Cer-AP), 磷脂LPE、LPG和溶血磷脂酰肌醇(LPI), 甘油酯DAG、DGTS和TAG的豐度則相對(duì)較高, 主要集中在Ⅱ、Ⅲ組。與空載酵母相比, EhV-FAD重組酵母中差異脂質(zhì)代謝物豐度變化趨勢(shì)也聚為3類(lèi)(圖6b), 其中磷脂PE、PI、LPC、PC及 LPA, 單半乳糖二酰甘油(MGDG)、TAG及DAG和神經(jīng)酰胺Cer-NS、Cer-AP、二羥鞘氨醇神經(jīng)酰胺(Cer-ADS)及鞘氨醇神經(jīng)酰胺(Cer-AS的豐度顯著下降, 主要集中在第Ⅰ組; 而磷脂PG、PS和SM, 甘油酯Glc-ADG、DGTS、硫代異鼠李糖甘油二酯(SQDG)和溶血酰基甘油三甲基高絲氨酸(LDGTS)及脂肪酸FA和FAHFA的豐度顯著增加, 主要集中在第II組。

圖6 酵母細(xì)胞中顯著差異脂質(zhì)代謝物聚類(lèi)熱圖

注: a. EhV-SD重組酵母細(xì)胞(YMR015C-SD)與空載釀酒酵母細(xì)胞(YMR015C)顯著差異脂質(zhì)豐度熱圖; b. EhV-FAD重組酵母細(xì)胞(YGL055W-FAD)與空載釀酒酵母細(xì)胞(YGL055W)顯著差異脂質(zhì)豐度熱圖; Cer-NDS: 二氫鞘氨醇; FAHFA: 羥基脂肪酸支鏈脂肪酸酯; PC: 磷脂酰膽堿; Cer-NS: 無(wú)羥基神經(jīng)酰胺; P: G磷脂酰甘油; PS: 磷脂酰絲氨酸; PE: 磷脂酰乙醇胺; PI: 磷脂酰肌醇; FA: 脂肪酸; LPE: 溶血磷脂酰乙醇胺; LPC: 溶血磷脂酰膽堿; LPA: 溶血磷脂酸; GlcADG: 葡萄糖醛酸糖脂; Cer-AS: 鞘氨醇神經(jīng)酰胺; Acar: 酰基肉堿; Cer-ADS: 二羥鞘氨醇神經(jīng)酰胺; Cer-AP: α-羥基鞘氨醇神經(jīng)酰胺; DAG: 甘油二酯; LPG: 溶血磷脂酰甘油; LPI: 溶血磷脂酰肌醇; DGTS1,2: 二棕櫚酰甘油三甲基高絲氨酸; MGD: G單半乳糖二酰甘油; SQDG: 硫代異鼠李糖甘油二酯; TAG: 甘油三酯; SM: 神經(jīng)鞘磷脂; LDGTS: 溶血酰基甘油三甲基高絲氨酸

從空載和重組酵母細(xì)胞中選取具有代表性差異脂質(zhì)代謝物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 結(jié)果如圖7所示。與空載酵母相比, EhV-SD重組酵母細(xì)胞中含多不飽和酰基鏈的甘油三酯(TAG, 12︰3)和磷脂酰膽堿(PC, 20︰4/20︰5/20︰6)種類(lèi)的含量顯著升高(圖7a, 7b),而含多不飽和酰基鏈的磷脂酰甘油(PG, 16︰2/18︰4)和部分多不飽和脂肪酸(FA, 16︰2/16︰4)的豐度則顯著降低(圖7c, 7d)。EhV-FAD重組酵母細(xì)胞中, 不飽和脂肪酸特別是單不飽和脂肪酸, 如棕櫚油酸(16︰1)和油酸(18︰1)的合成顯著積累, 而飽和脂肪酸的含量則顯著降低(圖7e～7g), 同時(shí)含不飽和酰基鏈的鞘磷脂(SM, 14︰1/14︰3/16︰3)種類(lèi)也顯著增加(圖7h)。

2.4 重組酵母細(xì)胞脂代謝通路分析

在正、負(fù)離子模式下, 從EhV-SD重組酵母細(xì)胞中篩選出20種差異脂質(zhì)代謝物, 從EhV-FAD重組酵母細(xì)胞中篩選出22種差異脂質(zhì)代謝物, 基于KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建相關(guān)代謝通路圖(圖8)。與酵母細(xì)胞C22-SD類(lèi)似, EhV-SD調(diào)控酵母細(xì)胞麥角甾醇生物合成的最后一步反應(yīng), 可能是由于本研究采用的是非靶向脂質(zhì)組學(xué)技術(shù), 限于總脂提取方法及檢測(cè)方法的原因, 本實(shí)驗(yàn)條件下沒(méi)有檢測(cè)到該酶直接催化形成的甾醇類(lèi)化合物。但我們發(fā)現(xiàn)EhV-SD除了調(diào)控甾醇化合物的合成外, 還可能通過(guò)其它中間代謝過(guò)程改變酵母細(xì)胞中多種脂質(zhì)的水平, 如鞘脂和甘油酯含量顯著增加, 而脂肪酸和部分磷酯則顯著降低(圖8a)。EhV-基因的過(guò)表達(dá)直接導(dǎo)致了單不飽和脂肪酸, 如油酸(18︰1)和棕櫚油酸(16︰1)的積累。另外, 該基因的過(guò)表達(dá)還可能通過(guò)其他中間代謝過(guò)程在不同程度上間接抑制部分脂肪酸、甘油酯、鞘脂及磷脂等的代謝過(guò)程(圖8b)。

圖7 EhV-SD和EhV-FAD基因過(guò)表達(dá)對(duì)酵母細(xì)胞中幾種典型脂質(zhì)豐度的影響

注: 相對(duì)豐度指與野生型酵母相比, 空載酵母和重組酵母中脂質(zhì)的相對(duì)豐度; *:< 0.05; **:< 0.01

注: a. EhV-SD重組釀酒酵母細(xì)胞脂質(zhì)代謝通路圖; b. EhV-FAD 重組釀酒酵母細(xì)胞脂質(zhì)代謝通路圖; Log2-Fold change代表脂質(zhì)含量的變化倍數(shù): 藍(lán)色系列代表脂質(zhì)含量減少; 紅色系列表示脂質(zhì)含量增加

3 討論

本研究通過(guò)在和基因缺陷型釀酒酵母中過(guò)表達(dá)顆石藻病毒EhV99B1甾醇去飽和酶基因EhV-和脂肪酸去飽和酶基因EhV-, 初步明確了病毒EhV-和EhV-基因的基本功能。酵母中甾醇的生物合成是一個(gè)多酶催化的復(fù)雜過(guò)程, 且其生物合成的調(diào)控是多層次的。在釀酒酵母中,基因編碼的C-22去飽酶催化酵母麥角甾醇生物合成途徑中的第20步反應(yīng), 在甾醇側(cè)鏈的C-22位引入反式雙鍵, 從而形成四烯甾醇。編碼的酵母C-5去飽和酶催化表甾醇B環(huán)的C-5和C-6位雙鍵的引入(Taton, 2000)。如基因缺失導(dǎo)致酵母細(xì)胞不能合成麥角固醇, 而合成了5,6-二氫麥角固醇(王慧等, 2020)。甾醇C-24還原酶基因()的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致酵母細(xì)胞中麥角甾醇含量提高, 而C-22去飽和酶基因()的過(guò)表達(dá)則導(dǎo)致酵母細(xì)胞中麥角甾醇含量降低(蔡鵬麗等, 2007)。可見(jiàn), 就酵母本身而言, 其基因的功能十分復(fù)雜, 這些酶在麥角甾醇生物合成中的調(diào)控作用還不十分清楚。本研究將EhV-基因克隆入基因缺陷型酵母菌株, EhV-基因成功表達(dá)并改變了酵母多種脂質(zhì)的含量, 但在EhV-SD重組酵母及野生型酵母細(xì)胞中均未檢測(cè)到甾醇類(lèi)化合物, 這可能由于本實(shí)驗(yàn)采用的細(xì)胞總脂提取及非靶向脂質(zhì)檢測(cè)條件等原因所致。不過(guò), 本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)EhV-基因的過(guò)表達(dá)可能通過(guò)其他中間代謝過(guò)程改變酵母細(xì)胞中多種脂質(zhì)的水平, 如TAG和Cer水平顯著升高, 特別是TAG中含單不飽和及多不飽和酰基鏈的種類(lèi)均顯著增加(圖7a, 7b), 表明EhV-SD具有明顯的去飽和酶作用。另外, 在釀酒酵母細(xì)胞中過(guò)表達(dá)基因?qū)е陆湍讣?xì)胞內(nèi)極性脂含量降低(蔡鵬麗等, 2007), 而對(duì)酵母基因?qū)嵤┩蛔兒? 不僅改變甾醇的含量還間接影響鞘脂的代謝(Guan, 2009)。可見(jiàn), 在酵母細(xì)胞中, 甾醇C-22去飽和酶酶促反應(yīng)下游除了已有的合成代謝途徑外, 可能還存在其他的分支代謝途徑, 通過(guò)這些途徑間接調(diào)控細(xì)胞中其它脂質(zhì)的代謝。除酵母外, 高等植物中也存在類(lèi)似現(xiàn)象, 如在番茄中表達(dá)食用金針菇的基因能夠促進(jìn)番茄中多不飽和脂肪酸的合成(Kamthan, 2012)。最新一篇對(duì)擬南芥的研究發(fā)現(xiàn), 甾醇能夠通過(guò)影響脂滴表面的物理特性干擾TAG合成酶的作用, 從而影響擬南芥種子中TAG的積累(Yu, 2021)。以上結(jié)果表明, SD酶的功能復(fù)雜多樣, 且不同物種SD功能之間的差異也較大, 這可能是重組EhV-SD酵母細(xì)胞中脂質(zhì)發(fā)生多樣性變化的一個(gè)原因。在EhV感染的顆石藻細(xì)胞中, 包括甾醇在內(nèi)的幾種萜類(lèi)化合物含量均顯著降低, 甾醇作為病毒包膜的組成部分, 宿主感染下調(diào)甾醇等脂類(lèi)含量可能是宿主的一種抗病毒防御策略(Rosenwasser, 2014)。因此我們推測(cè), EhV-SD也可能在一定程度上能夠抑制酵母細(xì)胞甾醇類(lèi)化合物的合成。此外, EhV感染能夠誘導(dǎo)宿主藻細(xì)胞中性脂的積累并形成大量脂滴以利于病毒的復(fù)制和組裝(Malitsky, 2016; Zeng, 2019)。以上結(jié)果提示, 在EhV感染的藻細(xì)胞中, EhV-基因的表達(dá)可能改變了宿主甾醇的生物合成, 而甾醇作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)脂類(lèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)TAG的合成和積累, 為病毒的復(fù)制和組裝提供條件。

脂肪酸去飽和酶(FAD)屬于酰基-CoA去飽和酶, FAD能在飽和脂肪酸鏈中引入雙鍵生成不飽和脂肪酸, 降低細(xì)胞膜中飽和脂肪酸含量, 增加不飽和脂肪酸含量(舒海燕等, 2021)。基因編碼的FAD是酵母不飽和脂肪酸生物合成過(guò)程中關(guān)鍵的限速酶, 可以將第一個(gè)雙鍵分別引入軟脂酸(16︰0)和硬脂酸(18︰0), 生成棕櫚油酸(16︰1Δ9)和油酸(18︰1Δ9) (Jeffcoat, 1977)。EhV-FAD的過(guò)表達(dá)顯著增加了重組酵母中不飽和脂肪酸的生物合成, 特別是促進(jìn)棕櫚油酸(16︰1)和油酸(18︰1)的積累, 而飽和脂肪酸含量則顯著降低(圖7f～7g), 表明EhV-基因與釀酒酵母細(xì)胞基因具有類(lèi)似的生物學(xué)功能。EhV 86感染顆石藻.CCMP1516誘導(dǎo)脂肪酸由多不飽和向單不飽和漂移, 特別是顯著促進(jìn)C18︰1(n-9)(Evans, 2009; Zeng, 2019)和C8-C16不飽和脂肪酸的顯著積累(Rosenwasser, 2014)。可見(jiàn), 病毒介導(dǎo)的顆石藻脂肪酸代謝可能是EhV-基因和宿主相關(guān)同源基因共同作用的結(jié)果。另外, 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn), D5D和D6D脂肪酸去飽和酶催化產(chǎn)生的不飽和脂肪酸可作為轉(zhuǎn)錄因子(如膽固醇調(diào)控原件結(jié)合蛋白1和過(guò)氧化物酶體增殖激活物受體)的配體, 參與調(diào)控與脂肪合成和脂肪酸氧化相關(guān)酶基因的表達(dá), 從而影響甘油酯和脂肪酸的組成(Warensj?, 2009)。類(lèi)似地, 本研究結(jié)果顯示, EhV-FAD的過(guò)表達(dá)不僅顯著影響酵母脂肪酸代謝, 同時(shí)也影響其他脂質(zhì)的特性, 如抑制甘油三酯、磷脂及鞘脂類(lèi)的豐度, 而顯著增加了它們的不飽和程度(圖7a～7g)。在基因缺陷型釀酒酵母中表達(dá)EhV-SPT, 發(fā)現(xiàn)病毒SPT利用鞘脂的從頭合成途徑并偏好以C15-CoA(肉豆蔻酰輔酶A)而非常規(guī)的C16-CoA (棕櫚酰輔酶A)為底物, 合成基于奇數(shù)C17-LCB長(zhǎng)鏈的病毒性鞘脂(Han, 2006)。同時(shí), 在EhV感染宿主過(guò)程中, 病毒通過(guò)啟動(dòng)EhV-基因的表達(dá), 抑制宿主鞘脂的合成, 轉(zhuǎn)而大量合成病毒特有的奇數(shù)碳鏈、富含羥基和不和鍵的新型鞘糖脂(Ziv, 2016)。基于以上結(jié)果, 我們推測(cè)在病毒感染重構(gòu)宿主鞘脂代謝過(guò)程中, EhV-SPT通過(guò)其底物偏好性啟動(dòng)病毒性鞘脂的合成, 而EhV-FAD則催化病毒性鞘糖脂結(jié)構(gòu)中不飽和脂肪酸鏈的形成。另外, 與EhV-SD重組酵母相反, EhV-FAD重組酵母中Cer含量顯著減少(圖8b), 而其降解產(chǎn)物鞘氨醇(SM)含量顯著升高(圖7h)。眾所周知, Cer作為一種細(xì)胞信號(hào)分子, 參與調(diào)控高等動(dòng)植物眾多細(xì)胞代謝, 并作為典型的信號(hào)分子誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和程序性死亡。在病毒感染的顆石藻細(xì)胞中, EhV-FAD的表達(dá)間接促進(jìn)毒性Cer向SM的轉(zhuǎn)變, 這可能也是病毒抑制宿主過(guò)早誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的一種策略。綜上, 本研究結(jié)果提示, 在病毒感染的顆石藻細(xì)胞中, EhV-SD和EhV-FAD的協(xié)同作用調(diào)控宿主細(xì)胞中鞘脂類(lèi)物質(zhì)的水平, 從而決定細(xì)胞命運(yùn)以調(diào)控顆石藻赤潮消亡過(guò)程。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合酵母突變體功能互補(bǔ)和非靶向脂質(zhì)組學(xué)方法, 初步確定了赫氏顆石藻病毒基因組中甾醇去飽和酶基因(EhV-)和脂肪酸去飽和酶基因(EhV-)的功能。EhV-SD主要功能是催化甾醇脂類(lèi)的生物合成, 產(chǎn)物甾醇可能作為信號(hào)分子間接調(diào)控了酵母細(xì)胞中磷脂類(lèi)、鞘脂類(lèi)及甘油酯類(lèi)和脂肪酸的含量, 從而影響酵母細(xì)胞酯類(lèi)代謝; EhV-FAD則主要催化酵母細(xì)胞中脂肪酸代謝, 特別是促進(jìn)單不飽和脂肪酸油酸和棕櫚油酸的積累, 同時(shí)也影響酵母細(xì)胞中鞘脂類(lèi)、磷脂類(lèi)及甘油酯類(lèi)的代謝。EhV-SD和EhV-FAD作為顆石藻病毒基因組編碼的關(guān)鍵輔助代謝基因, 在感染過(guò)程中與其他相關(guān)酶基因協(xié)同作用, 驅(qū)動(dòng)宿主鞘脂代謝流向病毒的轉(zhuǎn)移以合成病毒性鞘脂, 并最終誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡。可見(jiàn), 自然海域中顆石藻病毒-宿主在鞘脂合成代謝中存在激烈的博弈過(guò)程。然而, 包括顆石藻在內(nèi)的光合作用單細(xì)胞微生物的基因組中缺乏編碼如Bcl-2、p53和caspases等哺乳動(dòng)物典型的細(xì)胞凋亡因子, 但卻能以細(xì)胞凋亡方式應(yīng)答多種生物和非生物脅迫, 其確切調(diào)控機(jī)制尚不十分清楚。針對(duì)顆石藻病毒宿主這一模式體系,開(kāi)展鞘脂代謝相關(guān)輔助基因功能以及鞘脂介導(dǎo)的細(xì)胞死亡分子機(jī)制的研究, 將有助于深入認(rèn)識(shí)單細(xì)胞生物程序性細(xì)胞死亡途徑及其生態(tài)學(xué)意義。

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FUNCTIONAL ANALYSIS OF STEROL DESATURASE AND FATTY ACID DESATURASE GENES FROM COCCOLITHOPHORESVIRUS BASED ON LIPIDOMICS

MA Hui, WANG Cai-Feng, LI Gui-Ling, LI Jian, LIU Jing-Wen

(CollegeofOceanFoodandBiologicalEngineering, JimeiUniversity, Xiamen 361021, China)

The interaction between(Eh) and its specific lytic virus (EhV) plays a significant role in determining the fate of carbon and sulfur in the ocean and the climate modeling. Viral infection resistance is essentially an arms race of biochemical metabolism. During co-evolution, EhV “hijacked” a series of key enzyme genes involved inbiosynthesis pathway of sphingolipids from the host genome through gene horizontal transfer, supporting viral specific needs by rewiring host’ sphingolipid metabolism. At present, the function of these enzymes remains largely unknown. Therefore, the sterol desaturase (EhV-SD) and fatty acid desaturase (EhV-FAD) genes from EhV-99B1 strain were subcloned to construct the yeast recombinant expression vectors pYES2/CT-SD and pYES2/CT-FAD, and were then transformed into those corresponding gene-deficientstrains YMR015C and YGL055W, respectively. Furthermore, UPLC-Q-Exactive-MS untargeted lipidomics technique was used to analyze the changes of total lipids in.cells. Results show that the EhV-and EhV-genes were successfully expressed and biologically active in.. EhV-and EhV-genes overexpression significantly altered the total lipids contents and composition in recombinant.. The abundance of phosphatidylcholine (PC, 20︰4/20︰5/20︰6) and triglyceride (TAG, 12︰3) containing polyunsaturated acyl chains increased significantly, whereas the contents of some polyunsaturated fatty acids (FA, 16︰2/16︰4) and phosphatidylglycerol (PG, 16︰2/18︰4) containing polyunsaturated FA decreased significantly. Similarly, EhV-gene overexpression significantly induced the biosynthesis of monounsaturated FA in recombinant.. In particular, the palmitic oleic acid (C16︰1) and oleic acid (C18︰1) accumulated remarkably, while the content of saturated fatty acids was declined significantly, suggesting that EhV-FAD and Δ9FAD of.had similar biological functions. The identification of these new genes from marine virus provided an insight into the interaction between.virus and host, and also expanded their potential application in biotechnology.

virus; sterol desaturase gene; fatty acid desaturase gene;; lipidomics

Q943

10.11693/hyhz20220400085

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 42076086號(hào), 41576166號(hào); 福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 2019J01696號(hào)。馬暉, E-mail: 850524611@qq.com

劉靜雯, 博士, 教授, E-mail: ljwsbch@163.com

2022-04-04,

2022-04-28