不同強度光強脅迫對海帶(Saccharina japonica)幼苗光合生理的影響*

牛建峰 馮澤中 孫振杰 王偉偉 張曉雯 梁廣津 王立軍 李曉捷① 王廣策①

不同強度光強脅迫對海帶()幼苗光合生理的影響*

牛建峰1, 2, 6馮澤中1, 4孫振杰1, 4王偉偉3張曉雯5梁廣津3王立軍1, 2, 6李曉捷3①王廣策1, 2, 6①

(1. 中國科學院海洋研究所實驗海洋生物學重點實驗室 山東青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋生物學與生物技術功能實驗室 山東青島 266237; 3. 山東東方海洋科技股份有限公司 山東省海藻遺傳育種與栽培技術重點實驗室 山東煙臺 264003; 4. 青島農業大學 山東青島 266109; 5. 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 中國水產科學研究院黃海水產研究所 山東青島 266071; 6. 中國科學院海洋大科學研究中心 山東青島 266071)

海帶()是我國藻類生產的主要品種之一, 其栽培面積和產量均居世界首位。2021～2022年產季, 山東榮成海帶主產區先后暴發了大規模病爛災害, 給當地水產經濟造成了巨大損失。引起病爛的原因可能來自多方面, 其中藻體所受光照過強及水體營養鹽水平較低可能起到了一定作用, 為此, 基于海帶幼苗的最小飽和光強、煙臺高新區牟平自然海區海水氮磷濃度及不同海水深度下的光照強度測定結果, 研究了梯度強光在不同海水營養鹽水平下對海帶生理的影響, 以期為“爛菜”現象的病因分析提供一定的線索。結果顯示, 海帶幼苗在700～900 μE/(m2s)強光脅迫3 d后,v/m可恢復至對照水平, 光合色素合成活躍, 營養鹽含量較高的海水更有助于PSII的修復, 但1 300～1 500 μE/(m2s)的強光輻射導致PSII不能恢復, 巖藻黃素、葉綠素及β-胡蘿卜素含量顯著降低。整個脅迫實驗中, 藻體總抗氧化能力(T-AOC)及其他抗氧化酶比活力大體上在強光脅迫的起始至第3天上調, 而在脅迫第5天時又出現下降趨勢, 且在營養鹽含量較高的處理組中, 各樣本活性均高于天然海水處理組樣本。抗氧化酶基因的表達也呈現類似的變化趨勢。在低于900 μE/(m2s)的光照條件下, 抗氧化酶活性可以得到較好的維持, 而海水中相對較為豐富的營養鹽則有利于藻體抗氧化能力的維持。研究結果為榮成海帶病爛暴發的原因分析提供了一定的借鑒。

強光脅迫; 活性氧清除; 光系統修復; 海帶幼苗; 抗氧化酶; 巖藻黃素; β-胡蘿卜素

海帶()屬褐藻門(Phaeophyta), 褐藻綱(Phaeophyceae), 海帶目(Laminariales), 海帶科(Laminariaceae), 糖藻屬() (水產辭典編輯委員會, 2007), 由假根狀固著器、柄和葉片組成, 通過固著器附著于巖石、養殖筏架上生長。海帶是我國漁業生產的主要藻類之一, 栽培規模和產量均居世界首位, 據國家藻類產業技術體系監測調查情況及相關統計數據顯示, 2008～2018年, 全國海帶栽培面積呈上升趨勢, 2018年栽培面積相比于10年前增加了約34.63%, 占全國藻類栽培面積的31.29%。目前我國海帶主要分布在東南沿海和渤海灣地區, 其中福建省占總栽培面積的45.23%, 山東省占比約為38.04%, 遼寧省占比13.47%; 浙江省、江蘇省和廣東省也有零星栽培, 占比不到4% (國家藻類產業技術體系, 2021)。海帶不僅是海藻化工和農業肥料等行業的重要原料, 也是一種營養豐富的海洋食蔬。我國已形成一個集海帶育種、育苗、栽培、加工、藻類化工為一體的產業鏈條, 海帶產業在促進就業、漁民增收, 為社會提供健康食品, 改善生態環境, 緩解水體富營養化等方面作出了重要貢獻(國家藻類產業技術體系, 2021)。

在海帶的生長發育過程中, 不可避免地會受到眾多環境因子的影響, 光照就是其中一個重要因子。海水透明度可影響自然海區海帶的垂直分布, 隨海水透明度的提高, 其分布的深度會相應增加。在海帶的人工栽培中, 水體透明度也是被考慮的重要環境因子, 在受江河入海口影響而水質較渾濁的海區, 海帶一般栽培于海水表層, 在海水透明度高的區域, 海帶則被栽培在較深層海水中(蘇麗, 2018)。有研究表明, 海帶對光照強度的需求存在一個適宜范圍(即光補償點與光飽和點之間), 在此范圍內, 隨光照強度增加海帶光合作用加快, 而當光照強度超過飽和點后, 光合作用則減弱甚至受到抑制(陳書秀等, 2021)。

長期生產實踐積累的經驗表明, 過強或過弱的光照條件均可能抑制海帶的生長, 甚至引起海帶病變發生。在光強范圍300～10 000 lx內, 不同大小海帶的光合活性均隨光照強度增強而升高(姚南瑜等, 1981)。張起信(1994)通過總結經驗數據提出海帶光補償點大約為345 lx, 在養殖前期(幼苗期和凹凸期), 光照強度不宜超過800 lx, 正常栽培時期比較合理的光照范圍為14 000～22 000 lx, 此光照條件下海帶生長正常, 且不易發病。這個光照強度所對應的水層深度基本與透明度相當, 被稱為海帶的合理受光水層。程曉鵬等(2020)在測定養殖海域海帶孢子體生長參數的基礎上, 設置暫養實驗, 測定了在不同光合有效輻射(PAR)梯度下海帶的光合活性變化, 發現快速光曲線隨著光合有效輻射的增強呈先升后降的趨勢, 海域養殖海帶孢子體干重生長率變化與快速光曲線變化一致。

目前, 關于光照條件對海帶生長的影響, 主要集中在生長速率、形態變化及產量方面, 而從藻類生理生化角度的探討相對較少。在低于1 200 lx的不同光照條件下, 培養3 d后的海帶幼苗多酚、可溶性糖及可總溶性蛋白含量隨光強降低而降低, 而葉綠素和β-胡蘿卜素含量則呈相反趨勢(黃健等, 2002)。程曉鵬等(2020)通過模擬實驗, 綜合分析了海帶孢子體對溫度和光照的生理響應。梁洲瑞等(2019)研究了極北海帶()幼苗在不同光照條件下的抗氧化酶活性, 認為這些酶在響應強光脅迫的過程中發揮作用。本文則通過設置營養鹽與光照強度組合的不同培養條件, 研究了強光對海帶幼苗光合作用及抗氧化酶的影響, 以期為海帶人工栽培提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用海帶()幼苗藻體長度為20～30 cm, 2022年2月17日從福建移栽青島即墨海區暫養3 d, 期間水溫5 °C, 苗繩捆墜石沉入水下2 m。后轉運至(山東東方海洋科技股份有限公司高新區分公司)暫養1 d后進行不同脅迫條件下的處理。暫養條件為: 溫度4 °C; 光照強度50 μE/(m2s); 光周期12L:12D。

1.2 方法

1.2.1 光響應曲線測定 取暫養后的藻體, 暗適應10 min后, 通過雙通道調制葉綠素熒光儀Dual-PAM-100 (Heinz Walz, Effeltrich, 德國)原位測定海帶光響應曲線。光化光(PAR)強度設定為16、26、75、131、353、795、1 701和3 444 μE/(m2s), 每一PAR梯度下的照射時間為10 s, 2次光化光間隔為20 s, 記錄至少3組不同光化光下的ETR(II)值, 取平均值后通過軟件Origin 9.0, 利用Eilers等(1988)建立的方程進行光響應曲線的耦合, 方程公式為: ETR=PAR/ (×PAR2+×PAR+), 計算得出PSII最大量子得率, 最大電子傳遞速率ETRmax, 以及半飽和光強或最小飽和光強Ik。

1.2.2 海區光照強度與海水深度關系測定 于2022年2月24日正午, 在煙臺高新區海區(37°28′N, 121°47′E)進行了不同深度水體中光照強度的測定。測定以水下光溫探頭(Pendant, HOBO, 美國)與透明度盤結合進行, 將探頭固定于透明度盤表面, 隨透明度盤逐漸下沉水下, 從水體表面開始至水下5 m, 每下降1 m保持1 min, 進行數據采集, 采集頻率設定為10次/min, 同時, 對海區透明度對應的水體深度也進行1 min的光強數據采集。

1.2.3 不同光照強度及不同營養鹽濃度處理 以煙臺高新區自然海區抽取的海水, 經沉淀、砂濾后作為本實驗低營養鹽培養用海水。同時, 在海水中添加硝酸鹽和磷酸鹽, 配制營養海水(氮終濃度10 mg/L, 磷終濃度1 mg/L)。分別在營養海水及自然海水中設置高強度[1 300～1 500 μE/(m2s)]、中等強度[700～900 μE/(m2s)]和低強度[約200 μE/(m2s)]脅迫光照條件, 對海帶幼苗進行處理, 不同強度的光照條件基于正午水面光照強度, 水下1 m處光照強度及水體透明度條件下對應的光照強度設定。連續進行5 d脅迫處理, 每日處理時間為6 h。在強光處理的第1、3和5天, 光照處理結束后, 測定藻體光合作用參數, 收集材料, 吸水紙吸干, 液氮速凍, –80 °C保存備用。同時, 在脅迫處理的第2天和第4天, 強光處理前對藻體光合參數進行測定。

本實驗以高亮度Led燈提供光照條件, 溫度監測顯示整個實驗期間溫度維持在4～6 °C。

1.2.4 光合參數測定 藻體在不同營養鹽濃度、脅迫光照條件處理后暗適應10 min, 使用調制葉綠素熒光儀Dual-PAM-100 (Heinz Walz, Effeltrich)測定其光合作用參數。具體測定程序: 初始熒光(o), 以12 μE/(m2s)的測量光測定獲得; 最大熒光參數(m), 使用飽和脈沖[SP, 強度6 000 μE/(m2s), 持續時間300 ms]測定; 可變熒光(v)由m和o的差值獲得。測定過程中光化光強度設定為57 μE/(m2s), 通過系統自帶程序, 測得光合作用各參數, 利用Origin 9.0軟件進行數據處理并作圖。

1.2.5 色素提取和含量測定 參考Thayer和Enriquez等人建立的方法(Thayer, 1990; Enriquez, 2010), 將–80 °C儲存的藻體約100 mg, 置研磨管, 液氮預凍, 于研磨儀(JX-FSTPRP-24, 凈信科技, 中國上海) 60 Hz震蕩破碎50 s, 暫停10 s, 連續破碎三次, 懸浮于甲醇/丙酮(1/1,/)中, 冰浴30 min, 3 000離心5 min (4 °C), 沉淀再次加入一定體積甲醇/丙酮提取液, 離心、收集合并上清。色譜測定前, 上清液用0.22 μm濾膜過濾, 所有步驟在黑暗低溫狀態下進行。

色素測定采用高壓液相色譜系統(Agilent 1200,美國)進行, 色譜柱為C18反相柱(4.6×250 mm), 流動相包括A (水)、B (甲醇)、C (乙腈)和D (乙酸乙酯), 具體色譜程序為: 0～15 min, I (15% A, 30% B, 55% C, 0% D)到II (0% A, 15% B, 85% C, 0% D)線性梯度; 15～17 min, II到III (15% A, 15% B, 35% C, 35% D)線性梯度; 17～40 min, III到IV (0% A, 30% B, 0% C, 70% D)線性梯度。柱溫50 °C, 流速0.75 mL/min, 檢測波長443 nm。色素定量標準品巖藻黃素、葉綠素及β-胡蘿卜素購于Sigma (Sigma-Aldrich, 美國)。色素標準曲線通過不同濃度標準品的峰面積繪制, 樣本中色素濃度根據標準曲線計算獲得。

1.2.6 過氧化氫(H2O2)和丙二醛(MDA)含量測定 取適量–80 °C凍存樣品, 按上述方法磨碎, 加適量過氧化氫測定試劑盒(南京建成)提取液, 再次震蕩后, 12 000, 4 °C離心10 min, 收集上清。按試劑盒操作步驟加樣, 酶標儀(M1000Pro, Tecan Ifinite, 瑞士)測定吸光值, 計算各樣本中H2O2含量。

采用植物MDA試劑盒(南京建成), 材料研磨及樣本制備方法同前。按照說明書步驟, 以無水乙醇為空白對照, 以10 nmol/mL的MDA標準品作為標準管, 使用酶標儀(M1000Pro, Tecan Ifinite, 瑞士), 測定波長340 nm, 對樣本中MDA含量進行測定。

1.2.7 總抗氧化能力及抗氧化酶比活性測定 樣本研磨及酶提取液的制備方法同1.2.6。使用T-AOC試劑盒(南京建成)測定不同條件下樣本總抗氧化能力的強弱, 測定波長593 nm, 吸光度的大小反應樣本中所含抗氧化物質的總體的抗氧化能力。

樣本研磨及酶提取液的制備方法同前。各抗氧化酶測定試劑盒均購自南京建成。超氧化物歧化酶(SOD)的測定基于WST-8的顯色反應, 通過比色法對樣本中相應的酶活進行測定; 過氧化氫酶(CAT)活性通過單位時間內405吸光度的變化計算獲得; 過氧化物酶(POD)活性通過單位時間內420吸光度的變化量測定獲得; 抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性根據單位時間內290吸光度的減少值計算。

1.2.8 抗氧化酶的實時熒光定量(qRT-PCR)檢測

(1) RNA提取 不同處理樣本的總RNA使用RNAprep Pure Plant Kit (中國北京天根)提取, 得到的RNA濃度通過Nanodrop Photometer分光光度計(IMPLEN, CA, 美國)測定。

(2) 反轉錄 依據TaKaRa反轉錄試劑盒操作說明書進行, 每個反應含總RNA 200 ng, 用量據前述RNA濃度測定確定。具體操作步驟包括: 1) 基因組DNA去除。5′gDNA Eraser Buffer 2 μL, gDNA Eraser 1 μL, Total RNA (200 ng), 添加RNase Free dH2O至10 μL; 42 °C 2 min; 2) 反轉錄反應。向步驟1)的反應液中加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL, RT Primer Mix 1 μL, 5′Primescript Buffer 4 μL, RNase Free dH2O 4 μL; 37 °C 15 min, 85 °C 5 s, 4 °C維持。cDNA模板置–20°C備用。

(3) 引物設計 以海帶脅迫條件下轉錄組數據為基礎, 篩選每種抗氧化酶基因中表達上調最明顯的基因序列為轉錄研究對象, Tublin ()為內參, 通過海帶基因組數據獲得目標分子核酸序列, Primer Premier 5.0設計引物。基因名稱及引物序列見表1。

表1 目標基因引物序列及PCR產物長度

(4) qRT-PCR條件優化及基因表達量測定 通過調整PCR反應參數, 對各引物擴增條件進行優化。擴增的片段連接PMD19-T載體, 轉化感受態細胞, 測序驗證。EZNATMplasmid mini kit質粒提取試劑盒提取質粒, 10倍梯度稀釋, 進行引物擴增效率檢測。選擇擴增效率在90%～110%的引物進行qRT-PCR實驗。

使用StepOne Plus Real-Time (ABI, Foster, 加州, 美國)多色實時熒光定量PCR儀, 2′SYBR Green Master Mix (Roche, 德國), 每個樣本設3個重復, 進行抗氧化酶基因轉錄水平的測定。qRT-PCR反應體系20 μL, 包括1 μL cDNA模板, 10 μL 2′SYBR Green Master Mix, 上下游引物各0.5 μL (濃度為10 μmol/L), 8 μL RNase-free水。反應程序: 預變性: 95 °C 10 min; 變性: 95 °C 10 s、退火: 根據不同引物設定, 退火時間15 s, 延伸: 72 °C 25 s, 40個循環; 65 °C 30 s, 61個循環。反應結束后, 通過2–ΔΔCt的方法計算目標基因相對表達強度(Livak, 2001)。

2 結果

2.1 海帶幼苗快速光響應曲線

如圖1所示, 隨光合有效輻射的增強, 海帶幼苗PSII電子傳遞速率[rETR(II)]呈先快速上升后緩慢下降的趨勢, 在光飽和點處達到最大相對電子傳遞速率。根據快速光曲線擬合結果, 計算得到PSII的最大量子得率α為0.394, 光飽和點下ETRmax約為64 μE/(m2s), 最小飽和光強Ik為163 μE/(m2s)。

2.2 海區光照強度與海水深度的對應關系

光照強度監測數據顯示(圖2), 2月24日正午水面光照強度可達到1 500 μE/(m2s), 而在水下1 m時迅速下降到約600 μE/(m2s), 此時, 受表層海水流動及波動的影響, 監測數據呈現鋸齒狀波動, 至水下2 m的區域, 光強下降到350 μE/(m2s), 隨著深度的增加, 光照強度的降低呈現減少的趨勢, 但在水下5 m的區域, 光強也可以達到約80 μE/(m2s)的水平。經測定, 本次測量水體透明度約為2.8 m, 此條件下光照強度約為200 μE/(m2s)。

圖1 海帶幼苗飽和光強曲線

圖2 不同海水深度對應的光照強度

2.3 強光脅迫對海帶幼苗光合作用參數的影響

如圖3所示, 在光照強度約200 μE/(m2s)條件下, 室內連續培養過程中, 樣本v/m均呈現持續降低的趨勢, 其中自然海水條件下下降更為迅速, 至第5天時降為初始值的三分之一; 而營養海水條件下, 雖然v/m也逐漸降低, 但下降速率和程度均顯著低于自然海水條件, 至第5天時, 仍達到了實驗開始時一半的水平。在經歷中等強光[700～900 μE/(m2s)]脅迫后, 與低強光[200 μE/(m2s)]培養條件相比, 藻體v/m呈現顯著降低的趨勢。在營養海水培養條件下, 樣本v/m在脅迫的第3～5天一直維持在0.3上下, 而自然海水培養條件下的藻體v/m持續降低, 直至第5天的0.2。高強光[1 300～1 500 μE/(m2s)]脅迫的藻體中, 無論營養海水還是自然海水培養條件下,v/m在脅迫的第1天就出現較強烈的下降, 而在后續高強光處理下, 雖然光合能力同樣持續下降, 但營養鹽條件對其影響不顯著,v/m基本均維持在0.1。

強光脅迫前, 海帶藻體v/m為0.72, 在不同強光脅迫1 d后, 高強光組及中等強光組, 無論在營養海水還是自然海水培養條件下, 藻體v/m均無法恢復至原初狀態(圖4); 而在低強光[200 μE/(m2s)]營養海水脅迫處理第4天后依舊可以恢復至原初水平, 低強光自然海水組在前3 d的強光處理下無明顯變化, 僅在第4天后降低至約0.6 (圖4)。另一方面, 在營養海水條件下, 中等強度高光處理1 d及3 d后,v/m恢復程度明顯高于自然海水條件下的樣本。

2.4 不同條件下海帶幼苗光合色素含量測定

如圖5所示, 除高強光導致的β-胡蘿卜素含量降低外, 其他強光處理各時間點β-胡蘿卜素含量均高于對照, 且在脅迫的第3天, β-胡蘿卜素含量相對較高。1 300～1 500 μE/(m2s)高強光處理下, 所有樣本中巖藻黃素含量均低于對照。同時發現, 在脅迫的第5天, 無論哪種程度的強光脅迫下, 巖藻黃素含量亦均低于對照, 且隨光強的減弱而含量有所升高, 營養海水培養下的藻體巖藻黃素含量高于自然海水。葉綠素含量與巖藻黃素的變化趨勢一致, 1 300～1 500 μE/(m2s)強光處理下明顯降低, 而在脅迫的第5天, 所有樣本中葉綠素含量均低于對照, 且在營養海水培養下的藻體葉綠素含量明顯高于自然海水(圖5)。

圖3 不同光照強度、營養鹽條件下海帶幼苗Fv/Fm的變化

圖4 脅迫處理不同時間海帶幼苗Fv/Fm的恢復

圖5 不同光照強度、營養鹽條件下海帶幼苗光合色素含量的變化

注: a. β-胡蘿卜素; b.巖藻黃素; c.葉綠素

2.5 不同條件下海帶幼苗過氧化氫及丙二醛含量測定

如圖6所示, 自然海水培養條件下, 強光脅迫過程中, 過氧化氫(H2O2)含量在不同強度脅迫光下均表現出先升后降的趨勢; 營養海水培養條件下, H2O2含量變化趨勢大致相同, 且隨脅迫時間的延長, 各樣本H2O2含量上調程度變得更加明顯。在脅迫的第5天, 營養海水培養條件下H2O2含量顯著高于同條件下自然海水中培養的藻體。

無論在自然海水還是營養海水培養條件下, 高強度強光下MDA含量隨脅迫時間呈現逐漸下降的趨勢, 中等及低等強光脅迫下, MDA含量呈現先上調再下降的趨勢, 但直至實驗結束, 藻體MDA含量均高于對照, 且營養海水培養條件下MDA含量高于自然海水培養下的含量(圖7)。

2.6 不同條件下海帶幼苗抗氧化酶比活力測定

整個強光脅迫實驗過程中, 各樣本總抗氧化能力(T-AOC)均高于對照, 且呈現隨脅迫時間延長先升高后降低的趨勢, 至實驗結束時, 藻體T-AOC已經出現明顯降低。此外, 在營養海水培養條件下, 藻體T-AOC顯著高于自然海水培養條件下的總抗氧化能力(圖8)。

與T-AOC相比, 整個光強脅迫實驗過程中, SOD僅在個別樣本中出現上調, 如在中等強光或低強光脅迫處理的中后期(圖8)。自然海水培養條件下, SOD比活性隨脅迫時間延長基本維持不變或略有下降; 營養海水培養條件下, 藻體SOD在中等強光脅迫下先上升再下降, 在低等強光照條件下, SOD比活性持續增加。自然海水條件下, POD比活性在強光脅迫下隨脅迫時間延長, 大體上呈現先上調再下降的趨勢; 而在營養海水條件下, POD活性在脅迫的起始和中間時段均略低于對照, 但在脅迫實驗結束時, 其活性出現顯著上調, 且上調程度隨光照強度增加而增強。GR

活性因藻體不同差異較大, 大體上在營養海水培養條件下活性較高。在脅迫至第5天時, 低強光下藻體GR酶活高于中等強光處理藻體, 中等強光下藻體GR酶活又高于高強光處理藻體。

2.7 不同條件下海帶幼苗抗氧化酶基因的表達變化

實時熒光定量結果顯示, 強光脅迫條件下, SOD表達除個別樣本外, 在大多數樣本中均上調, 且高強光組SOD表達隨脅迫時間延長而逐漸降低, 中等強度與低強度強光組表達大體上呈現先升高后降低的趨勢。同時, 營養海水培養條件下SOD表達量一般高于同光照下自然海水培養條件。在脅迫處理的中后期, SOD的表達呈現隨脅迫強光增加而其表達下調的趨勢。

圖6 不同光照強度、營養鹽條件下海帶幼苗H2O2的含量

圖7 不同光照強度、營養鹽條件下海帶幼苗MDA含量

圖8 海帶幼苗不同處理條件下抗氧化活性變化

注: a. 總抗氧化能力; b. SOD比活力; c. POD比活力; d. GR比活力

POD的表達變化較為劇烈, 自然海水培養條件下, 其表達在高強光下幾乎被抑制, 中等程度強光下, 其表達呈現先升后降的趨勢, 但上調程度基本與對照無明顯差別, 低強光下, 其表達在脅迫的起始階段明顯上調, 后持續降低, 至實驗末期不能檢測到其mRNA的表達。營養海水條件下, 除低強光脅迫下POD呈現先上調再下降的趨勢外, 其他條件下POD表達變化趨勢與自然海水培養的類似, 且表達水平高于自然海水培養的POD表達。

不同營養鹽條件下, GR的表達均出現顯著上調, 且在高強光條件下隨脅迫時間延長其表達持續降低, 而在低強度高光條件下, 自然海水培養藻體中, GR表達持續降低, 而營養海水培養下藻體GR表達呈現先升后降的趨勢。與未經脅迫的對照相比, 高強光脅迫下, GPX表達呈逐漸下調趨勢, 只有低強度強光脅迫時, 藻體GPX表達明顯上調, 且上調趨勢隨脅迫時間延長而逐漸降低, 同時發現, 大多數情況下, 營養海水培養條件下GPX表達量高于自然海水培養條件下GPX的表達。

3 討論

3.1 海帶飽和光強與藻體大小及生長環境密切相關

植物對光照強度的適應或需求存在一定的適宜范圍, 在合適的光照范圍內, 隨光照強度的增加, 光合效率增加, 但當超過飽和光強后, 光合作用反而會受到影響, 嚴重時還可能導致光合作用元件遭受損傷。關于海帶的飽和光強, 本實驗測定結果顯示其最小飽和光強(半飽和光強)為163 μE/(m2s), 明顯高于程曉鵬等(2020)的測定結果。研究表明, 海帶耐受的光照強度隨孢子體的變大而減弱(段德麟等, 2015), 我們使用的實驗材料為海帶幼苗, 長度在20～30 cm之間, 而程曉鵬等(2020)測定的海帶孢子體樣品葉長為(71.8±11.2) cm, 這可能是造成明顯差異的直接原因。而另據報道, 在海區分苗后的正常栽培時期, 海帶比較合理的光照范圍為14 000～22 000 lx, 約280～440 μE/(m2s) (張起信, 1994)。綜上, 關于海帶的飽和光強, 因藻體大小、生理狀態或測定方法, 抑或測定環境不同, 導致具體結果存在較大差異。但可以肯定的是, 其飽和光強相對較低。

圖9 海帶幼苗不同處理條件下抗氧化酶基因的表達變化

注: a. SOD基因相對表達量; b. POD基因相對表達量; c. GR基因相對表達量; d. GPX基因相對表達量

3.2 強光對海帶幼孢子體光合作用的影響

v/m是光系統Ⅱ(PSⅡ)最大光化學效率, 代表了PSⅡ反應中心原初光能轉化效率, 是光化學反應的重要參數, 在正常環境條件下, 植物v/m極少變化, 而當v/m明顯下降時, 就表示植物受到了強烈脅迫(盧從明等, 1995)。本實驗中無論是較低的200 μE/(m2s)強光處理組, 還是中等或1 300～ 1 500 μE/(m2s)的高強光處理組,v/m值均出現逐漸下降的趨勢。在不同光照強度處理組間, 相同處理條件下, 200 μE/(m2s)組v/m高于700～900 μE/(m2s)處理組, 又明顯高于1 300～1 500 μE/(m2s)處理組。說明實驗中使用的光照強度確實對測試的海帶藻體產生了脅迫傷害, 導致其v/m隨處理時間增加而降低。另外, 導致藻體v/m值逐漸降低的可能原因還包括實驗材料較大, 水體體積相對較小, 無流水刺激等。

PSII對環境的變化非常敏感, 在不利或者脅迫環境條件下PSII的活性比其他生理活性下降更快(Demmig-Adams, 1992; Aro, 1993; Andersson, 1997)。PSII的修復循環是葉綠體適應脅迫環境的重要機制之一, 但當PSII的損傷速率超過修復速率時, 就會導致藻體PSII無法被修復而降低(Tikkanen, 2014)。條斑紫菜中, Kang等(2022)認為酸處理后, 如果藻體v/m0.183, 則復蘇后光合作用可以得到恢復, 但當脅迫后v/m低于0.183時, 藻體PSII就可能已經遭受到了不可逆的損傷, 藻體光合作用會隨時間推移而持續下降。造成光合作用持續下降的原因可能是PSII的修復受到了影響。本研究中, 海帶在1 300～1 500 μE/(m2s)強光下脅迫6 h后, 自然海水培養下的藻體v/m降至0.2以下, 營養海水培養下的v/m降至約0.4, 但即使過夜復蘇, 也不能恢復至正常對照水平。但在700～900 μE/(m2s)光照強度下, 即使連續脅迫3 d,v/m已降至0.3, 過夜后也可恢復。由此可見, 海帶PSII能夠較長時間耐受700～900 μE/(m2s)的強光脅迫, 而且營養鹽含量較高的海水可能有助于PSII的修復。

對PSII造成破壞的最主要環境因素是強光, 強光導致的光抑制最顯著的結果是PSII光化學效率和光合碳同化量子效率的降低, 顯著特征之一是PSII的結構和功能的破壞。而在強光條件下, 低溫脅迫又明顯地促進了PSII光抑制的發生(?quist, 1993)和PSII蛋白合成的抑制(Allakhverdiev, 2004)。因此, 低溫與強光共同作用下, 藻體光合作用更容易受到影響。植物光合作用是溫度、光照、營養鹽水平等諸多因素共同作用的結果(劉露等, 2013), PSII復合體中被破壞的蛋白質的周轉對維持其功能狀態非常重要, 即高效的蛋白合成系統及營養鹽供應可能也是影響植物適應能力的重要因素。正如本研究所示, 在實驗進行的第3天開始, 營養海水培養條件下, 在強光處理及復蘇后的v/m值均高于天然海水培養的藻體, 這種差別在實驗進行的后期更為明顯(圖3和圖4)。據此推測, 水體營養鹽水平對海帶響應逆境脅迫具有積極意義, 即在營養鹽相對較豐富的水體中, 藻體具有更高的逆境耐受能力。

3.3 海帶幼孢子體對波動光的適應

本研究中, 我們采用了恒定強光對海帶進行了脅迫處理。雖然我們的研究結果表明, 200 μE/(m2s)的光照強度已經構成了海帶幼苗的脅迫光強, 但自然界中光合生物總是處在不斷變化的光照條件下的, 海水表面的飽和太陽光強可以達到2 000 μE/(m2s), 有時甚至更強(Long, 1994)。此外, 海洋因具有規律且連續的波浪、棱鏡效應, 從而產生亮帶或斑塊的水平波(Schubert, 2001), 導致海洋藻類頻繁地暴露在不斷波動的光環境中。由于海帶藻體在波浪作用下的相互遮擋造成的光強變化, 也導致海帶處在一種光照條件劇烈波動的環境中。據報道, 在翻滾培養(tumbled culture)模式下, 50 000 lx可見光及400 μW/cm2紫外光共同作用10～20 s的條件下, 海帶最大熒光得率未表現出明顯下降, 而且在此光照條件下, 對海帶處理50～60 s, 低溫復蘇24 h后, 其光合作用可以得到完全恢復(Pang, 2008)。這很好地解釋了為什么不同研究人員測定得到的海區栽培海帶飽和光強顯著低于海區實際光照強度, 而海帶仍可以正常生長的原因。即自然栽培的海帶在海浪的作用下, 藻體間通常會出現彼此的遮擋, 從而使得藻體不至于長時間處于脅迫強光照射下, 同時, 也可能因為海帶因具有適應這種波動光照條件的能力, 故可正常生長發育。

海帶之所以能夠適應波動光, 是因為其光能捕獲系統由葉綠素/-巖藻黃素-葉綠素蛋白復合物FCP (fucoxanthin-chlorophyll proteins)構成。這種捕光色素系統不僅在弱光條件下能有效捕獲光能, 最大限度地吸收藍光和綠光, 在強光條件下還能耗散多余能量(Wang, 2019)。在此領域研究較多的是具有極高生理“柔性”, 可適應復雜和動態環境的海洋硅藻(Kooistra, 2007)。研究證明, 硅藻中FCP復合物可通過巖藻黃素及其相關蛋白的相互作用的改變或修飾, 實現向光系統轉移多余能量(Tanabe, 2020), 從而發揮能量耗散的作用, 這種機制在藻類應對光脅迫時至關重要(Derks, 2015; Wang, 2019)。

這種機制可能包括兩個過程, 分別為短期(S/min)的質子梯度和光系統活性調節, 以及長期(h/d)的光合色素和Rubisco等碳代謝酶(Long, 1994)的合成。質體MEP途徑中的DXS (一種光誘導的酶, 通過促進類胡蘿卜素合成實現光保護)在劇烈的波動光下增加(Athanasakoglou, 2019), 光照條件的劇烈波動還可能會嚴重刺激這些依賴光的基因表達。本研究中, 我們雖僅使用了恒定強光開展了脅迫實驗, 結果顯示海帶中β-胡蘿卜素含量除在1 300～1 500 μE/(m2s)強光處理下降低外, 其他條件下均上調, 說明β-胡蘿卜素的合成對海帶響應強光脅迫具有重要作用, 而巖藻黃素與葉綠素的合成隨脅迫時間的延長出現明顯的降低, 尤其在實驗末期, 說明強光降低了葉綠體中類囊體的數量, 并對葉綠素及巖藻黃素的合成產生負面影響(Lichtenthale, 1983), 這也暗示藻體狀態可能受到了較嚴重的影響, 導致各色素含量降低。同時發現, 在脅迫的第3天, 雖然在自然海水培養條件下具有相對較高的色素含量, 但在脅迫實驗的末期, 營養海水中培養的藻體具有更強的強光耐受能力。

3.4 強光脅迫導致的抗氧化酶活性降低影響了海帶幼孢子體光合生理活性

光抑制條件下, PSII的原初電子受體被過度還原(Vass, 1992), 或者PSII的受體側及供體側之間的電荷發生重組而產生活性氧自由基(ROS) (Keren, 1997)。這些ROS如不能被及時清除, 就可能直接攻擊PSII的光化學反應中心。研究發現, 在外源H2O2添加或H2O2清除酶被抑制的條件下, PSII的修復受到了抑制(Nishiyama, 2001)。因此, 葉綠素吸收的過多的光能可能導致PSII光化學反應中心失活(Ohnishi, 2005), 而胞間H2O2和1O2的水平的增加可明顯抑制PSII修復, 增加光抑制的程度(Nishiyama, 2001, 2004; Allakhverdiev, 2004)。

逆境中藻體產生的ROS主要通過抗氧化系統被清除, 這包括酶促抗氧化系統和非酶促抗氧化系統, 而總抗氧化能力是用來衡量機體抗氧化系統功能狀況的綜合性指標, 反映了機體對外來刺激的代償能力及機體自由基代謝的狀態。本文結果顯示, T-AOC在強光脅迫的第3天上調, 而在脅迫第5天時又呈下降趨勢。同時發現, 在營養鹽含量較高的處理組中, 各樣本T-AOC均高于天然海水處理組樣本(圖8), 說明在整個強光脅迫處理過程中, 海帶總抗氧化能力在一定程度上得到了誘導, 尤其在營養鹽相對豐富的條件下。然而強光脅迫或實驗中培養條件的限制, 最終影響了海帶正常生理過程, 導致末期T-AOC下調。

生物體酶促抗氧化系統包括SOD、POD、CAT及GR等多種抗氧化酶, 其中, SOD存在于所有需氧生物, 通過歧化作用將O2–轉化為O2和H2O2, 形成了植物在逆境中清除ROS的第一道防線。本研究結果顯示, 在強光脅迫6 h的條件下, 藻體內SOD活性均受到了抑制, 而在脅迫處理的第3天, SOD比活性的微弱上調(圖8), 說明海帶細胞內SOD在對強光脅迫的適應過程中發揮重要作用, 而脅迫培養的末期, 高營養鹽條件下SOD活性相對較高, 也證明水體營養鹽含量對抗逆機制的維持確實具有一定意義。與酶活測定結果不同的是, SOD的表達除在1 300～1 500 μE/(m2s)高強光脅迫的第5天外, 其他營養海水培養條件下的表達均上調, 且在脅迫的第3天, SOD表達最為活躍(圖9), 同樣證明海帶在強光脅迫的第3天具有最強的抗氧化響應能力。而在處理的第5天, SOD的表達已受到抑制, 受影響程度隨光照強度增加而增加。

梁洲瑞等(2019)報道, 極北海帶幼苗中, SOD和POD可協同作用清除細胞內由高光導致的ROS累積, 對高光逆境發生積極響應。本研究也發現在天然海水處理組, 各強光處理的第3天, POD活性最高, 而營養鹽含量較高的海水中, POD活性上調時間出現后移, 因此, POD的活性與藻體的營養狀態存在較強的關聯。從POD基因的表達方面, 也得到類似結果。因此, 強光脅迫與營養缺乏的疊加, 最終會導致細胞受到越來越嚴重的氧化損傷, POD表達及比活下降。葉綠體中的H2O2主要是通過Halliwell-Asada途徑被清除, 極北海帶幼苗產生的H2O2主要通過抗壞血酸過氧化物酶(APX)和GR進行了清除(梁洲瑞等, 2019)。本研究發現GR比活性在脅迫處理的第5天, 強度大于700～900 μE/(m2s)的光照條件下, GR活性顯著降低, 因此, 在光照強度大于700～900 μE/(m2s)的條件下, 無論是天然海水還是營養鹽含量較高的海水中, 海帶幼體均受到了較為嚴重的氧化損傷。GR的轉錄結果也顯示, 在脅迫處理的第3天具有相對較強的脅迫響應能力, 而在脅迫的第5天藻體表達GR的能力均受到了一定程度的抑制。

在脅迫條件下, 植物細胞中酶促和非酶促過程均會導致ROS產生的增強, 各種形式的ROS在抗氧化酶的作用下最終轉化成毒性較小的H2O2而被代謝。細胞內H2O2的水平不僅與其清除有關, 而且與其產生密切關聯。本實驗起始階段, 強光下H2O2的累積說明藻體可能已經受到較為嚴重的損傷, 導致積累的H2O2不能被及時清除。這種累積效應在低營養鹽培養的樣本中更為明顯, 因此導致H2O2在強光脅迫的第3天出現明顯的累積。相比較而言, 在高營養鹽處理組中, H2O2的積累在脅迫的第5天發生, 因此, 高營養鹽培養下的藻體具有更強的抗氧化能力。而此時海水處理組H2O2水平下調, 說明藻體中合成H2O2的代謝可能已經受到了抑制。形成的過氧化氫, 即使在低濃度下, 也會通過氧化酶蛋白的巰基來抑制酶的活性(Noctor, 1998)。通過Haber-Weiss反應, H2O2可以轉化為羥自由基而引起脂質過氧化, 從而導致細胞膜的氧化損傷(Kehrer, 2000)。本實驗中, 不同強光脅迫下, 營養海水培養組中海帶藻體均具有較高的MDA含量, 但其光合活性及抗氧化能力均高于天然海水處理組, 其原因有待進一步研究。

4 結論

海帶光合捕光色素蛋白復合體由葉綠素/-巖藻黃素-葉綠素蛋白復合物(FCP)構成, 這使得其對自然海區劇烈波動的光照條件具有較高的生理適應“柔性”。在弱光條件下, 可以最大限度地吸收藍光和綠光, 而在瞬時強光條件下, 又可對過剩的能量吸收進行有效耗散。然而, 巖藻黃素屬于還原性分子, 容易被氧化失活, 持續強光照射對海帶捕光色素復合體可能造成較嚴重傷害。本研究證明海帶幼苗可較長時間耐受700～900 μE/(m2s)的強光脅迫, 而在海區栽培的現場條件下, 波浪引起的藻體擺動及藻體間相互遮擋等效應, 可較大幅度地提升藻體可耐受強光的能力。另一方面, 海帶抗氧化酶活性在強光脅迫時上調, 抗氧化酶基因表達上調, β-胡蘿卜素合成增加, 這也是海帶應對強光脅迫的重要生理機制之一。同時,海水營養鹽水平對光系統的修復及抗氧化能力的維持均具有重要意義。因此, 在水流和波浪較大的栽培海區, 海水交換充分, 營養供應充足, 海帶接受的光照強度處于劇烈變動狀態, 生長通常較好; 但當栽培海區長時間水流不暢, 波浪較小, 水質太過清澈的時候, 海帶遭受持續的強光脅迫, 就可能導致其光系統損傷的發生, 并最終引發病爛發生。

致謝 特別感謝福建省國家級學會創新驅動服務站(中國海洋湖沼學會-福建一嘉海帶苗業有限公司)董志安提供實驗用海帶幼苗; 江蘇省啟東市連濤水產養殖專業合作社李平在山東青島即墨海區對材料的適應性暫養。謹致謝忱。

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EFFECTS OF STRONG LIGHT STRESS ON PHOTOSYNTHESIS AND PHYSIOLOGY OFSEEDLINGS

NIU Jian-Feng1, 2, 6, FENG Ze-Zhong1, 4, SUN Zhen-Jie1, 4, WANG Wei-Wei3, ZHANG Xiao-Wen5, LIANG Guang-Jin3, WANG Li-Jun1, 2, 6, LI Xiao-Jie3, WANG Guang-Ce1, 2, 6

(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China; 3. Provincial Key Laboratory of Algae Genetic Breeding and Cultivation Techniques of Shandong, Shandong Oriental Ocean Sci-tech Co. Ltd., Yantai 264003, China; 4. Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China; 5. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 6. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao, 266071, China)

is one of the main species of algae cultivated in China, and its cultivation scale and yield rank first in the world. In the production season of 2021～2022, a large-scale disease disaster outbreak occurred in the area of Rongcheng, Shandong, causing huge losses to the local aquatic economy. The causes of the disease may come from many aspects. Among them, the excessive strong solar irradiance and the low nutrient level in the seawater could be accounted. Based on the results of the minimum saturated light intensity of, the concentrations of nitrogen and phosphorus in natural seawater, the effects of different strong light on the physiology ofat different seawater nutrient levels were studied. Results showed that the PSII of seedlings ofcould be well maintained under 700～900 μE/(m2s) for a long time and the relatively high nutrient level of seawater contributed to the repairment of PSII under high light stress conditions. However, under the light condition of 1 300～1 500 μE/(m2s), the recovery of PSII was damaged and the contents of fucoxanthin, chlorophylland β-carotene decreased significantly. Through the whole experiment of light stress, the total antioxidant capacity (T-AOC) and specific activities of antioxidant enzymes of the algae were generally up-regulated from the beginning of treatment to the third day, but decreased on the fifth day of experiment. Moreover, the enzyme activities of the algae incubated with nutrient seawater were higher than those incubated with the natural seawater. The expression of antioxidant enzyme genes also showed a similar trend. In summary, the antioxidant enzyme system was active for several days below 900 μE/(m2s) and the addition of exogenous nutrients could extend the activity maintenance period. This provided some clues to understanding of outbreak of disease disaster in Rongcheng.Key words high light stress; scavenging of reactive oxygen species; repairment of photosystem;seedlings; antioxidant enzymes; fucoxanthin; β-carotene

Q539; Q51

10.11693/hyhz20220500127

*國家重點研發計劃“藍色糧倉科技創新”重點專項項目, 2018YFD0901500號; 財政部和農業農村部: 國家現代農業產業技術體系資助, CARS-50號。牛建峰, E-mail: jf_niu@qdio.ac.cn

李曉捷, 碩士生導師, 研究員, E-mail: yeslxj@sina.com; 王廣策, 博士生導師, 研究員, E-mail: gcwang@qdio.ac.cn

2022-05-11,

2022-07-04