高溫脅迫對(duì)虹鱒(Oncorhynchus mykiss)肝臟中抗氧化酶活性和免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響*

董福霖 黃天晴 劉恩慧 谷 偉 王高超 郭福元 王炳謙 徐革鋒

高溫脅迫對(duì)虹鱒()肝臟中抗氧化酶活性和免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響*

董福霖1, 2黃天晴1劉恩慧1谷 偉1王高超1郭福元3王炳謙1徐革鋒1①

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所 冷水性魚類產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟 黑龍江哈爾濱 150070; 2. 上海海洋大學(xué) 上海 201306; 3. 煙臺(tái)經(jīng)海海洋漁業(yè)有限公司 山東煙臺(tái) 264006)

夏季高溫對(duì)虹鱒()網(wǎng)箱養(yǎng)殖會(huì)產(chǎn)生極大威脅, 高溫脅迫會(huì)造成虹鱒應(yīng)激甚至死亡。為探究高溫脅迫對(duì)虹鱒肝臟抗氧化響應(yīng)及相關(guān)免疫基因的影響, 選取虹鱒“水科一號(hào)”幼魚[(24.8±10.0) g]為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 通過連續(xù)升溫達(dá)到高溫脅迫條件, 篩選出高溫敏感組和耐受組, 并對(duì)它們的抗氧化酶活性、免疫相關(guān)基因表達(dá)和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (RAPD)片段化進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明: 敏感組與耐受組的超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性含量不存在顯著性差異(>0.05), 但均顯著高于對(duì)照組(<0.05); 敏感組的缺氧誘導(dǎo)因子-1α ()白細(xì)胞介素-1β ()以及熱休克蛋白10 ()基因的相對(duì)表達(dá)量較耐受組的分別高1.8倍、1.28倍和16.5倍(<0.05); 耐受組的熱休克蛋白70 ()基因的表達(dá)比敏感個(gè)體高1.37倍(<0.05); RAPD圖譜反映出敏感組的DNA損傷比耐受組更嚴(yán)重。高溫脅迫對(duì)虹鱒幼魚、和基因產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)答性表達(dá)上調(diào), 且RAPD針對(duì)高溫耐受個(gè)體可有效進(jìn)行識(shí)別。

虹鱒; 高溫脅迫; 缺氧誘導(dǎo)因子-1α; 熱休克蛋白; RAPD

虹鱒()屬于鮭形目、鮭科、大麻哈魚屬, 自從1959年引入我國(guó)以后, 成為我國(guó)廣泛養(yǎng)殖的冷水魚品種, 截止到2020年底, 我國(guó)的虹鱒產(chǎn)量達(dá)到了3.8萬t (農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等, 2021)。虹鱒適宜的水溫是12～18 °C, 當(dāng)超過20 °C時(shí), 虹鱒的攝食量就會(huì)減少, 生長(zhǎng)速度放緩, 當(dāng)超過26 °C時(shí), 虹鱒出現(xiàn)浮頭, 呼吸頻率降低, 并且有些魚出現(xiàn)側(cè)游、腹部向上的現(xiàn)象(馬芳, 2019)。同時(shí)姜旭陽等(2019)對(duì)虹鱒幼魚的溫度耐受性研究表明, 虹鱒幼魚的高溫臨界溫度為26.5 °C。所以夏季高溫是虹鱒養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中最大的威脅之一, 因此研究高溫脅迫條件下虹鱒的生理響應(yīng)和調(diào)控機(jī)制, 開展功能基因篩選和驗(yàn)證, 對(duì)耐高溫品種的選育具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是指在應(yīng)激情況下生物體內(nèi)的細(xì)胞新合成的或超量合成的一類蛋白質(zhì)(王艷妮, 2016), 主要作用是保護(hù)機(jī)體抵抗不良環(huán)境刺激, 幾乎存在于所有生物體(周彥靜, 2017), 對(duì)模式物種的廣泛研究揭示了熱休克蛋白的三個(gè)主要家族: 熱休克蛋白90 (heat shock proteins 90, HSP90, 85～90 kDa)、熱休克蛋白70 (heat shock proteins 70, HSP70, 68～73 kDa)和低分子量熱休克蛋白(16～47 kDa) (Demeke, 2016)。熱休克蛋白10 (heat shock proteins 10, HSP10)參與細(xì)胞過程中的免疫反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡環(huán)節(jié)。而HSP70則是目前研究最廣泛的分子伴侶之一, 并在應(yīng)激耐受過程中通過折疊新生多肽和恢復(fù)熱損傷蛋白方式起作用(Zhang, 2014)。白細(xì)胞介素-8 (Interleukin- 8,)和白細(xì)胞介素-1 (Interleukin-1,)是兩種重要的促炎細(xì)胞因子, 也是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物(Corripio- Miyar, 2007)。其中(Interleukin-1β)在微生物入侵、組織損傷和包括自身免疫性疾病在內(nèi)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用(Ma, 2016)。缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia inducible factor,)一類高度保守的轉(zhuǎn)錄因子家族, 是氧穩(wěn)態(tài)和低氧適應(yīng)性反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子(Semenza, 1999)。(Hypoxia inducible factor 1α,)通過調(diào)節(jié)供氧和新陳代謝基因的表達(dá)來協(xié)調(diào)生物對(duì)缺氧的反應(yīng)(Hochachka, 2001; Semenza, 2012)。

過高的溫度通過產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species, ROS)進(jìn)而導(dǎo)致魚體出現(xiàn)氧化應(yīng)激(Madeira, 2013), 并進(jìn)一步造成氧化損傷, 魚類對(duì)此的應(yīng)對(duì)方式主要是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá), 調(diào)控多種酶的合成, 而超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)和過氧化氫酶(catalase, CAT)是魚類應(yīng)對(duì)應(yīng)激的關(guān)鍵酶(姜旭陽等, 2021)。為了響應(yīng)ROS的生成, SOD將超氧化物陰離子分解為過氧化氫, CAT將過氧化氫分解為氧和水(Kim, 2017), 避免過多的活性氧對(duì)核酸、蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)造成損傷(Tomanek, 2010)。有許多研究表明, 高溫與SOD和CAT的活性變化顯著相關(guān), 在對(duì)翹嘴鱖(i) (張晨光等, 2021)、褐牙鲆() (徐冬冬等, 2010)以及梭鱸() (Li, 2019)等魚的研究中發(fā)現(xiàn), 高溫顯著改變了肝臟中SOD和CAT的活性, 因此SOD和CAT的活性變化可以看作魚類高溫應(yīng)激狀態(tài)的指示物。而腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α, TNFα)則是一種重要的炎癥因子。

高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致魚類產(chǎn)生單鏈和雙鏈DNA的斷裂和染色體碎片。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)技術(shù)是一種可靠的、靈敏的DNA損傷檢測(cè)技術(shù)(賴金龍等, 2015)。目前利用RAPD檢測(cè)魚類的DNA損傷基本集中在重金屬脅迫方面, 如重鉻酸鉀對(duì)鯉魚() (Kumar, 2015)以及鈾對(duì)斑馬魚() (Lerebours, 2013)的毒性研究, 而使用RAPD研究高溫對(duì)魚類的DNA損傷較少, 本研究評(píng)估了RAPD作為檢測(cè)高溫脅迫下虹鱒DNA損傷標(biāo)志物的可行性。

本研究以虹鱒“水科一號(hào)”新品種為實(shí)驗(yàn)材料開展高溫脅迫實(shí)驗(yàn), 通過比較高溫脅迫下不同實(shí)驗(yàn)組中魚的抗氧化酶活性、免疫相關(guān)基因表達(dá)和DNA片段化的研究, 為高溫脅迫下虹鱒應(yīng)答機(jī)制的解析和耐高溫品系的選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

虹鱒“水科一號(hào)”幼魚體質(zhì)量(24.8±10.0) g, 體長(zhǎng)(13.2±5.0) cm,來自黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚類試驗(yàn)站。

實(shí)驗(yàn)水族箱為循環(huán)控溫玻璃水族箱, 規(guī)格為150 cm×60 cm×50 cm, 水深為50 cm。實(shí)驗(yàn)魚在水族箱中馴養(yǎng)兩周, 連續(xù)曝氣, 水溫控制在(16.0±0.2) °C, pH值7.2～7.5, 溶解氧7.8～10.0 mg/L, 每日投喂商業(yè)飼料兩次, 投喂30 min后清理剩余飼料。試驗(yàn)期間, 投喂方式、pH值、溶解氧與馴養(yǎng)期間保持一致。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在(16.0±0.2) °C水溫下馴養(yǎng)兩周后, 選取體質(zhì)健康、規(guī)格均一的虹鱒90尾進(jìn)行試驗(yàn), 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, (26.0±0.2) °C下12 h可以區(qū)分出敏感組和耐受組。實(shí)驗(yàn)組共60尾, 平均分在兩個(gè)玻璃水族箱中, 從(16.0±0.2) °C開始升溫, 每日升高1 °C, 直至(26.0±0.2) °C后12 h進(jìn)行采樣。此時(shí), 每個(gè)水族箱中能保持游泳平衡、可以自由游動(dòng)的個(gè)體定義為耐受組,失去平衡、無法自游動(dòng)的個(gè)體定義為敏感組。同時(shí), 另外選取體質(zhì)健康、規(guī)格均一的虹鱒30尾始終在(16.0±0.2) °C下飼養(yǎng), 此組為對(duì)照組。

1.3 RNA的提取和cDNA的合成

每組采集6尾魚的肝臟組織迅速置于液氮中, 后存于–80 °C中保存, 直到用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RNA的提取采用bioflux公司的總RNA提取試劑盒, 按照說明書進(jìn)行肝臟組織的RNA提取。

cDNA的反轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa公司的PrimeScript RT試劑盒, 按照說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄, 加入500 ng的Total RNA, 2 μL 5×PrimeScript RT Master Mix混勻后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng): 37 °C 15 min, 85 °C 5 s, 4 °C 1 min。反轉(zhuǎn)錄成的cDNA在–20 °C中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SOD、CAT以及TNF-α的活性檢測(cè)

每組采集6尾魚的肝臟放于凍存管中并于–80 °C中保存。將肝臟組織在生理鹽水中勻漿, 隨后在4 °C, 6 000 r/min下離心10 min。取上清用于SOD、CAT以及TNF-α的活性的測(cè)定。SOD、CAT活性測(cè)定按照南京建成生物工程研究所試劑盒(A001-1, A007-1-1)及相關(guān)說明測(cè)定。TNF-α活性測(cè)定按照上海酶聯(lián)試劑盒(ml077404)及相關(guān)說明測(cè)定。

1.5 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA-PCR

每組采集3尾魚的尾鰭到裝有無水乙醇的采樣管中, 并在4 °C保存, 直到用于下一步實(shí)驗(yàn)。DNA提取使用biospin組織基因組DNA提取試劑盒按照說明進(jìn)行提取, 使用ScanDrop測(cè)定濃度和純度后, 放–20 °C保存?zhèn)溆谩?/p>

采用了5個(gè)隨機(jī)引物(表1)對(duì)三個(gè)組的DNA多態(tài)性進(jìn)行了測(cè)試。25 μL反應(yīng)體系由30 ng基因組DNA、2.5 μL 10×buffer、5 μL dNTP、1.25 μL引物(10 mmol/L)、2.5 μL Mg2+(5 mmol/L)以及H2O組成。反應(yīng)在伯樂C1000 PCR儀中按照: 95 °C預(yù)變性反應(yīng)4 min, 95 °C變性1 min, 36 °C退火45 s, 72 °C延伸1 min, 45個(gè)循環(huán), 最后72 °C延伸5 min。最終PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中于110 V電壓下電泳30 min, 并在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行觀察和拍照。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)GenBank已公布的虹鱒的編碼序列(AF304864.1)、cDNA全序列(AB196465)、的編碼序列(AJ298294),的編碼序列(AJ279069)、的編碼序(BT073047.1)以及大西洋鮭()的編碼序列(BT043672.1)使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR上、下游引物。所有引物合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。引物序列見表2。

表1 RAPD引物序列

表2 基因引物序列及相關(guān)信息

注: F表示正向引物; R表示反向引物

使用TaKaRa公司的TB Green?Premix Ex TaqTM進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR, 條件如下: 30 s的95 °C預(yù)變性, 40個(gè)循環(huán)的PCR反應(yīng)(95 °C, 5 s; 60 °C, 34 s), 最后, 95 °C 15 s, 60 °C 60 s, 95 °C 15 s。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示, 采用Spss 26中的One-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析以及T檢驗(yàn)對(duì)不同實(shí)驗(yàn)處理組進(jìn)行顯著性分析,<0.05表示存在顯著差異, 并用GraphPad Prism8.0作圖。使用Image Lab軟件對(duì)RAPD-PCR的產(chǎn)物進(jìn)行條帶分析。

2 結(jié)果

2.1 高溫脅迫下肝臟中SOD、CAT的活性和TNF-α含量分析

高溫脅迫條件下虹鱒肝臟中SOD和CAT的活性均呈現(xiàn)了顯著上升的趨勢(shì), 敏感組和耐受組均顯著高于對(duì)照組(<0.05), 其中敏感組和耐受組中SOD活性分別是對(duì)照組的1.2倍和1.1倍; 而CAT的活性, 兩組則均為對(duì)照組的1.4倍。同時(shí), SOD和CAT的活性在敏感組和耐受組中均未發(fā)現(xiàn)顯著差異(圖1a, 1b)。TNF-α含量在熱應(yīng)激后, 未發(fā)生顯著變化(圖1c)。

圖1 高溫脅迫下虹鱒肝臟組織中SOD和CAT的活性和TNF-α含量

注: 圖中柱上標(biāo)記不同的字母代表不同實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)存在顯著差異(<0.05)

2.2 RAPD-PCR分析

對(duì)RAPD-PCR的結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn), 在采用相同的五條隨機(jī)引物的情況下, 對(duì)照組和耐受組分別產(chǎn)生了19.3個(gè)和19.6個(gè)DNA條帶, 而敏感組則產(chǎn)生了24個(gè)DNA條帶(圖2)。

2.3 高溫脅迫下il-1β、il-8、hif-1α、hsp10和hsp70基因的表達(dá)分析

通過qRT-PCR方法檢測(cè)了和基因在不同實(shí)驗(yàn)組肝臟中的表達(dá)水平。如圖3a所示,的表達(dá)在敏感組和耐受組表現(xiàn)出不同的趨勢(shì), 相比與對(duì)照組, 敏感組中表達(dá)上調(diào), 而在耐受組中未發(fā)現(xiàn)明顯變化; 敏感組中的表達(dá)分別為對(duì)照組和耐受組的1.7倍和1.8倍。如圖3b、圖3c所示,和兩個(gè)基因表達(dá)均大幅上調(diào), 顯著高于對(duì)照組(<0.05),在敏感組和耐受組中沒有觀察到差異, 而敏感組的相對(duì)表達(dá)為耐受組的1.28倍。兩個(gè)熱應(yīng)激蛋白相關(guān)的基因和在熱應(yīng)激后也顯著上調(diào)(<0.05); 兩個(gè)基因在敏感和耐受組的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組, 敏感組中的相對(duì)表達(dá)量為耐受組的16.5倍, 而表達(dá)量為耐受組的0.72倍(圖3d, 3e)。

圖2 對(duì)照組(a)、敏感組(b)和耐受組(c) RAPD-PCR分析結(jié)果

注: 圖中標(biāo)注不同的字母代表不同實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)存在顯著差異(<0.05)

圖3 高溫脅迫下虹鱒肝臟中hif-1α (a)、il-1β (b)、il-8 (c)、hsp70 (d)和hsp10 (e)基因的相對(duì)表達(dá)

注: 圖中標(biāo)注不同的字母代表不同實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)表達(dá)存在顯著差異(<0.05)

3 討論

水產(chǎn)養(yǎng)殖中高溫脅迫造成魚體疾病暴發(fā)頻率升高、代謝及免疫能力下降等一系列危害, 直接影響?zhàn)B殖的經(jīng)濟(jì)效益。本研究在26 °C的高溫脅迫條件下, 通過虹鱒是否游泳失衡、同時(shí)無法自由游動(dòng)區(qū)分出敏感組和耐受組, 在此基礎(chǔ)上研究了兩者之間肝臟中的抗氧化酶活性和免疫相關(guān)基因表達(dá)上的差異, 為進(jìn)一步探究虹鱒高溫脅迫調(diào)控機(jī)制和培育虹鱒耐高溫優(yōu)良品系提供理論依據(jù)。

高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致魚類體內(nèi)產(chǎn)生氧化損傷, 其中氧化應(yīng)激下的SOD和CAT活性的變化已經(jīng)有許多報(bào)道(楊洪帥等, 2014;孫永旭等, 2019)。快速的升溫會(huì)導(dǎo)致魚類體內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS和自由基, 而SOD和CAT則是快速清除活性氧和自由基的酶類(史鯤鵬等, 2018)。本研究中, 敏感組和耐受組的SOD活性和CAT的活性顯著高于照組(<0.05)。說明高溫使敏感組和耐受組均產(chǎn)生了氧化應(yīng)激, 體內(nèi)的活性氧和自由基增多, 魚體通過增強(qiáng)抗氧化酶活性來消除多余的活性氧以及自由基, 減輕肌體損傷。而敏感組與耐受組的CAT和SOD差異不顯著, 原因可能是虹鱒在接近極限耐受溫度條件下, 應(yīng)激個(gè)體的CAT和SOD酶活性達(dá)到閾值, 導(dǎo)致虹鱒的抗氧化酶活性對(duì)高溫的響應(yīng)不敏感。TNF-α是一種內(nèi)源性致熱原, 在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究中的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中TNF-α含量不存在顯著差異, 與在豬(胡艷欣等, 2006)、大鼠(Lan, 2019)中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果一致,我們認(rèn)為這可能與TNF-α內(nèi)源性致熱原的性質(zhì)有關(guān), 同時(shí)在虹鱒熱應(yīng)激時(shí)肝臟中TNF-α發(fā)揮的免疫作用較小。

此外, 活性氧增多還會(huì)導(dǎo)致DNA氧化損傷, 包括鏈斷裂、堿基錯(cuò)配等(Zhou, 2011)。在本研究中, DNA損傷通過RAPD圖譜反映出來, 敏感組相比于對(duì)照組和耐受組出線了條帶強(qiáng)度的改變和擴(kuò)增條帶的增加現(xiàn)象, 說明高溫敏感組遭受到了更嚴(yán)重的DNA損傷。RAPD是一種經(jīng)濟(jì)、快速、簡(jiǎn)單的分子標(biāo)記, 同時(shí)RAPD對(duì)魚類傷害較小, 只需要尾鰭就可以進(jìn)行檢測(cè), 我們認(rèn)為, 在虹鱒養(yǎng)殖過程中, 可以用RAPD評(píng)估虹鱒熱應(yīng)激狀態(tài), 可以作為虹鱒高溫耐受的標(biāo)志, 同時(shí)開發(fā)相關(guān)的RAPD標(biāo)記, 用于輔助耐高溫品系的選育。

高溫脅迫產(chǎn)生的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)的表達(dá)量的變化,發(fā)揮自己的生物學(xué)功能, 減少高溫應(yīng)激對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的損害(Iwama, 1998)。在本研究中, 敏感組和耐受組的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組均顯著上升(<0.05), 而耐受組又顯著高于敏感組(<0.05)。類似結(jié)果也在西伯利亞鱘() (田照輝等, 2013)和大黃魚() (Xu, 2018)發(fā)現(xiàn)。我們推測(cè),在虹鱒在應(yīng)對(duì)熱應(yīng)激上起到了保護(hù)組織和細(xì)胞的作用。的相對(duì)表達(dá)也在高溫脅迫后上調(diào), 并且敏感組中上調(diào)幅度顯著大于耐受組(<0.05)。而的主要功能是參與免疫反應(yīng)以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡(Akyol, 2006;趙考考, 2011), 我們推測(cè), 敏感組中肝臟受到更嚴(yán)重的損傷, 細(xì)胞凋亡程度大于耐受組, 所以敏感組中表達(dá)量顯著高于耐受組。炎癥反應(yīng)是機(jī)體產(chǎn)生的一種自身保護(hù)性反應(yīng), 目的是修復(fù)受損組織, 消除有害刺激(郭勛等, 2020)。同時(shí)機(jī)體的炎癥反應(yīng)也是檢測(cè)健康狀態(tài)的重要指標(biāo)之一,和是兩種重要的促炎因子, 在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用(Liang, 2022)。本研究中表達(dá)均發(fā)生上調(diào), 但敏感組中的表達(dá)顯著高于耐受組, 說明高溫導(dǎo)致虹鱒幼魚產(chǎn)生肝臟的炎癥反應(yīng), 敏感組肝臟受損更加嚴(yán)重。此外我們認(rèn)為表達(dá)差異是導(dǎo)致虹鱒溫度耐受性的差異原因之一。

氧氣和容量限制的熱耐受性(OCLTT)是P?rtner提出的一個(gè)基于血液中O2的熱依賴性和有氧能力的相應(yīng)變化的綜合概念(P?rtner, 2017; Jutfelt, 2018)。這一假說認(rèn)為, 呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)在極端溫度下會(huì)受到損害, 從而限制了組織和細(xì)胞獲得氧氣的能力。基于這個(gè)理論, Joyce等(2020)做出了一個(gè)推論, 缺氧和耐熱性是相關(guān)的, 同時(shí)在Anttila等(2013)對(duì)大西洋鮭的研究中表明, 臨界最高溫度與耐缺氧能力呈顯著正相關(guān)。控制代謝和氧氣供應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá), 在協(xié)調(diào)細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用,是參與血管生成、紅細(xì)胞生成和葡萄糖代謝的基因, 同時(shí)也被證明在黑鯽() (Rissanen, 2006)中參與調(diào)節(jié)體溫和缺氧之間的相互作用。在本研究中, 敏感組中的表達(dá)量顯著高于(<0.05)對(duì)照組和耐受組, 而耐受組和對(duì)照組間則未發(fā)現(xiàn)顯著的差異。在Saravia等(2021)對(duì)南極魚()的研究中發(fā)現(xiàn)肝臟中在臨界最高溫度時(shí)表達(dá)顯著升高, 這與本研究中的敏感組表現(xiàn)出了相同的趨勢(shì)。而作為一些基因表達(dá)的重要調(diào)控因子, 會(huì)對(duì)缺氧做出反應(yīng)(Cai, 2014), 因此我們推測(cè), 敏感組和耐受組表現(xiàn)出的差異是因?yàn)槊舾薪M對(duì)溫度更為敏感, 為彌補(bǔ)高溫帶來的損傷, 加快了代謝率和呼吸頻率, 所以上調(diào)了的表達(dá), 因此我們認(rèn)為耐缺氧能力是影響虹鱒溫度耐受性的重要因素。

4 結(jié)論

以上結(jié)果表明、和在虹鱒高溫脅迫中發(fā)揮重要作用, 我們認(rèn)為可以從這些基因中發(fā)掘潛在的SNP位點(diǎn), 作為虹鱒高溫選育潛在的分子標(biāo)記。而RAPD可以用于評(píng)估虹鱒熱應(yīng)激狀態(tài), 并作為虹鱒高溫耐受的潛在標(biāo)志。

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EFFECT OF THERMAL STRESS ON ACTIVITY OF ANTIOXIDANT ENZYMES AND EXPRESSION OF IMMUNE-RELATED GENES IN LIVER OF RAINBOW TROUT ()

DONG Fu-Lin1, 2, HUANG Tian-Qing1, LIU En-Hui1, GU Wei1, WANG Gao-Chao1, GUO Fu-Yuan3, WANG Bing-Qian1, XU Ge-Feng1

(1. Cold Water Fish Industry Technology Innovation Strategic Alliance, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Heilongjiang Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin 150070, China; 2. Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Yantai Jinghai Marine Fishery Co. Ltd., Yantai 264006, China)

High summer temperatures poses a threat to rainbow troutin net pens, causing thermal stress or even death. To investigate the effects of thermal stress on the antioxidant response of rainbow trout liver and related immune genes, we selected juvenile rainbow trout [(24.8±10.0) g] as the experimental subjects and screened the sensitive and tolerant groups by gradual temperature increases to a thermal stress point. Polymorphic DNA (RAPD) fragmentation was studied in a comparative manner.Results show that the levels of superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities in the sensitive group showed no significant difference from those in the tolerant group (>0.05) but the control group (<0.05). The levels of hypoxia inducible factor 1α (), interleukin-1β (), and heat shock proteins10 () in the sensitive group had no significant difference from those in the tolerant group (<0.05). The relative expression of,, andwere 1.8, 1.28, and 16.5 times higher in the sensitive group than in the tolerant group (<0.05), respectively.The expression of heat shock proteins 70 () in the tolerant group was 1.37 times higher of that in the sensitive group (<0.05). The expression ofandin the sensitive group was significantly higher than that in the tolerant group, indicating that the high temperature led to an inflammatory response in the liver of juvenile rainbow trout, and the liver of the sensitive group was more severely damaged, which is consistent with the RAPD profile reflecting that the DNA damage in the sensitive group was more severe than that in the tolerant group. The expression ofin the tolerant group was significantly higher than that in the sensitive group becauseplays a role in protecting tissues and cells in rainbow trout in response to the heat stress. It is suggested that the difference inandexpression is one of the reasons for the difference in thermal tolerance and the ability to tolerate hypoxia is an important factor in thermal tolerance for rainbow trout. Meanwhile, the RAPD is an effective tool for identifying individuals with thermal tolerance.Key words rainbow trout; thermal stress; hypoxia-inducible factor-1α; heat shock protein; RAPD

S917.4

10.11693/hyhz20220300064

*中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng), HSY202010Q號(hào); 財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部: 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助, CARS-46號(hào); 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目, 2020TD32號(hào); 煙臺(tái)開發(fā)區(qū)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目, 2021TD003號(hào)。董福霖, 碩士研究生, E-mail: 924570125@qq.com

徐革鋒, 碩士生導(dǎo)師, 研究員, E-mail: xugefeng@hrfri.ac.cn

2022-03-16,

2022-05-06