溶藻弧菌體外刺激泥蚶(Tegillarca granosa)血細胞后早期轉錄組研究*

鐘愛華 王迎賓 畢瀾方 徐浩磊

溶藻弧菌體外刺激泥蚶()血細胞后早期轉錄組研究*

鐘愛華 王迎賓 畢瀾方 徐浩磊

(浙江海洋大學水產學院 浙江舟山 316022)

泥蚶()是我國傳統養殖貝類, 細菌性疾病導致的死亡已成為制約泥蚶養殖業發展的重要因素, 血細胞是泥蚶免疫防御的執行者, 血細胞能直接吞噬異物, 能通過包囊作用將異物包裹, 血細胞還在炎癥反應和傷口修復中發揮作用。采用RNA-seq測序技術研究了溶藻弧菌體外刺激后泥蚶血細胞3 h和6 h時轉錄組動態變化, 與未受刺激血細胞相比, 3 h時1 790個基因表達發生顯著改變, 包括1 319個上調基因和471個下調基因; 6 h時3 183個基因表達發生顯著改變, 包括2 629個上調基因和554個下調基因。KEGG通路富集分析發現溶藻弧菌刺激后免疫相關多個信號通路或生物學過程發生顯著改變, 如吞噬體、細胞凋亡、蛋白酶體、內質網加工、局部黏附等。部分免疫相關基因表達豐度3 h時變化不顯著而6 h時發生顯著改變, 部分免疫相關基因3 h和6 h時表達豐度均顯著改變。研究結果為泥蚶血細胞早期免疫反應提供了新的見解, 為泥蚶抗病機理研究提供了理論基礎。

泥蚶(); 溶藻弧菌(); 血細胞; 轉錄組

貝類沒有淋巴細胞介導的特異性體液免疫和細胞免疫, 只有以血細胞為基礎的固有免疫, 貝類血細胞能吞噬外源性或內源性抗原, 還能產生各種非特異性體液因子參與宿主免疫防御。吞噬后的病原主要通過兩條途徑被殺傷, 第一條途徑是吞噬小體與含有水解酶的溶酶體融合, 水解消化病原微生物, 包拉米蟲感染后歐洲扁牡蠣()血細胞中多種水解酶活力上升(Xue, 2000); 第二條途徑是通過呼吸暴發激活細胞膜上的NADPH氧化酶, 從而產生大量活性氧來殺滅病原微生物。

近年來, 隨著高通量轉錄組測序技術的應用, 對特定組織、器官mRNA進行全貌分析成為可能。通過對特定組織或器官所表達的mRNA分析, 能明確細胞內的調控網絡及分子機制。目前, 轉錄組測序已應用于魚類、蝦蟹類和貝類, 如環境適應機制、免疫反應機制研究。Zhao等(2015)研究了鹽度脅迫下凡納濱對蝦血細胞轉錄組, 發現差異表達基因涉及免疫信號通路、細胞凋亡和能量代謝等。Hu等(2022)研究了溶解氧和溫度對硬殼蛤()鰓轉錄組影響, 發現內質網蛋白質加工和泛素介導的蛋白質水解在響應低氧和高溫脅迫中發揮重要作用。Ren等(2021)通過轉錄組測序, 獲得了菲律賓蛤仔的Toll樣受體種類及其對溶藻弧菌的響應特征。

溶藻弧菌()屬弧菌科、弧菌屬, 是一種短桿狀革蘭氏陰性菌, 無莢膜和芽孢, 與哈維氏弧菌、副溶血弧菌并稱海洋三大優勢弧菌, 其中溶藻弧菌居首, 是海洋中常見的條件致病菌。泥蚶()屬軟體動物門(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、列齒目(Taxodonta)、蚶科(Arcidae), 是我國傳統養殖貝類。統計顯示2015年以來我國蚶類養殖總面積約4.534萬hm2, 總產量約417.31萬t。隨著泥蚶養殖規模的擴大, 病害問題日益突出, 當外界條件不良或生物本身抵抗力下降時, 往往能引發弧菌病流行, 近年來多地養殖泥蚶大量死亡, 弧菌病是導致死亡的重要原因。弧菌性疾病輕則影響泥蚶產量, 重則導致泥蚶大量死亡, 造成巨大經濟損失, 使泥蚶養殖業面臨挑戰, 因此開展泥蚶抗病機制研究十分必要。血細胞是泥蚶免疫防御的主要執行者, 細菌入侵后, 血細胞會對入侵者做出反應以清除細菌。目前有關泥蚶研究主要集中在養殖技術、病害防治以及功能基因克隆等方面(李太武等, 2003; 朱澤聞等, 2011; 許家輝等, 2018), 溶藻弧菌入侵后泥蚶血細胞mRNA表達量變化規律研究較少, 本文擬研究溶藻弧菌體外刺激泥蚶血細胞后早期轉錄組動態變化, 明確泥蚶免疫反應的分子途徑, 以確定有助于改善泥蚶健康狀況和降低死亡率的免疫性能標記, 探索泥蚶免疫應答的分子機制, 以期為泥蚶抗病機理研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本準備

實驗用泥蚶來自浙江省舟山市南珍市場, 選擇反應迅速、貝殼完整的泥蚶, 運回實驗室暫養5 d。暫養結束后, 隨機選30個大小近似一致的泥蚶, 每15個泥蚶一組, 用無菌解剖刀小心割開閉殼肌后, 用無菌注射器從外套腔中小心抽取血淋巴置于無菌離心管中, 每組取10 mL血淋巴, 1 000 r/min離心3 min后, 去上清液, 用10 mL無菌Hanks液(NaCl: 8 g/L, Na2HPO4·12H2O:0.126 g/L; KH2PO4: 0.068 g/L, KCl: 0.48 g/L, MgSO4: 0.098 8 g/L, CaCl2: 0.148 g/L, D-葡萄糖: 18 g/L, NaHCO3: 0.358 g/L)重懸浮。

實驗用溶藻弧菌為CICC21664標準菌株, 將菌株劃線接種在TCBS培養基上, 37 °C培養24 h后, 挑取形態特征一致的菌落, 用無菌Hanks液制成懸浮液后, 調整細菌密度至5×1010CFU/mL。每組血淋巴中加入100 μL溶藻弧菌懸浮液, 混勻后, 混合液置于25 °C培養箱中孵育。一組于孵育0 h、3 h和6 h取混合液1 mL, 置于無菌離心管中, 1 000 r/min離心3 min后, 去上清液, 向沉淀中加入2 mL Trizol (Invitrogen, CA, USA)裂解液, 用移液器反復吹打裂解液, 直到無明顯細胞團塊, 室溫靜置5 min, 待細胞完全裂解后保存于–80 °C超低溫冰箱中用于轉錄組測序。一組用于血細胞染色觀察。

1.2 RNA提取、cDNA文庫構建與測序

總RNA提取按照Trizol? Reagent試劑盒操作步驟進行, 獲得的總RNA用RNA 1000 Nano LabChip Kit 試劑盒(Agilent, CA, USA)和Bioanalyzer 2100進行定性定量檢測, 選取高質量RNA (濃度≥200 ng/μL, OD260/OD280在1.8～2.2, 總量≥5 μg, RIN>9.0)進行文庫構建。提取的總RNA用包含Oligo(dT)的磁珠富集mRNA, 然后用片段化試劑(Fragmentation Buffer)將富集的mRNA隨機打斷成短片段, 以短片段mRNA為模板, 用六堿基隨機引物(Random hexamers)合成cDNA第一鏈, 隨后加入RNaseH、dNTPs、DNA Polymerase I和緩沖液合成二鏈cDNA, 加入End Repair Mix將雙鏈的cDNA修復成平末端, 然后在3’端加上堿基A并加上接頭。獲得的cDNA進行PCR擴增, 共15個循環, 擴增試劑盒為Sample Preparation Kit (Illumina, San Diego, CA), 擴增產物用1%瓊脂糖電泳后, 回收200～300 bp的條帶, 用TBS380 (Picogreen)定量檢測后, 進行高通量測序, 測序平臺為Illumina HiSeq NovaSeq 6000, 測序讀長為雙端PE150。

1.3 轉錄組de novo組裝

測序獲得的原始數據(Raw Date)使用Fastp去除reads中的接頭序列, 去除沒有插入片段的reads, 修剪掉序列3’末端質量值小于20的堿基, 若修剪后的序列仍有質量值小于10的堿基, 則整條序列去除, 否則保留, 去除含模塊堿基N的reads, 舍棄質量修剪以及去除接頭后長度小于30 bp的序列, 剩余序列用于后續分析。過濾后的數據(Clean reads), 用Trinity軟件從頭進行組裝, 首先將reads拼接為長片段contigs, 去除冗余后將contigs分組, 然后將contigs連接成兩端不能再延長的片段即為Unigenes。

1.4 基因功能注釋

NCBI-NR (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Swiss- Prot (https://www.uniprot.org/)數據庫注釋分析采用DIAMOND (Buchfink, 2015)軟件, 期望值為<1e-5; 使用BLAST2GO、HMMER3NR和KOBAS軟件在GO (http://www.geneontology.org)、Pfam (http://pfam.xfam.org/)和KEGG (http://www. genome.jp/ kegg/)數據庫中進行比對, 對Unigenes信息進行注釋。

1.5 差異表達基因分析

先采用RSEM軟件將質控后的Clean reads數據與組裝的Unigene序列進行比對, 獲得Unigene的read數目, 然后計算每百萬讀段中來自于某轉錄本的讀段數TPM (Transcripts Per Kilobase Million), 確定Unigene的表達量。使用R軟件中的DEGseq包篩選差異表達基因, 差異表達基因選擇標準為多重檢驗矯正后的-adjust值<0.001且|log2Fold Change|>1。采用KOBAS軟件進行差異表達基因KEGG通路富集分析。

1.6 血涂片染色

溶藻弧菌和泥蚶血細胞孵育后0、1、3、6和24 h, 取血細胞制作血涂片, 制作的血涂片采用瑞氏吉姆薩染色液(南京建成)染色, 染色方法參考說明書稍作修改, 具體為染色液A液染色1 min, 然后加B液染色8 min, 染色完成后水洗, 晾干后顯微鏡下觀察, 10×100倍下采用佳能數碼相機拍照。

2 結果

2.1 測序數據質控和組裝

在0 h、3 h和6 h, 泥蚶血細胞中分別獲得7.11 G、7.01 G和6.96 G原始數據(raw bases), 經修剪、過濾不合格序列后, 三個時間點有效數據(clean bases)分別為6.81 G、6.71 G和6.67 G, 有效序列(clean reads)分別為45 984 396、45 465 728和45 249 166條, 有效序列Q20質量得分為97.99%、97.85%和97.53%, Q30得分為93.85%、93.63%和93.02%, GC含量為41.55%、40.97%和40.43%。

獲得的有效序列經從頭組裝后, 共獲得24 456個Unigenes, 最長Unigene長度為17 988 bp, 最短Unigene長度為201 bp, N50長度為879 bp。

2.2 基因功能注釋

組裝后的Unigenes分別比對到NR、Swiss-Prot、Pfam、GO和KEGG五個數據庫, 10 649個基因在五個數據庫中獲得注釋, 注釋率為43.54% (圖1)。比對結果顯示, 10 402個Unigenes與NR數據庫中已知基因同源, 其中18.45%序列與歐洲扇貝()同源、16.30%序列與蝦夷扇貝()同源、10.67%序列與太平洋牡蠣()同源(圖2), 89%序列相似度高于60%, 其中49.68%序列相似度在80%～100%, 40.99%序列相似度在60%～80%。

為了解泥蚶血細胞中表達基因和蛋白功能, 將24 456個Unigenes在GO數據庫中進一步比對分析, 7 934個Unigenes在GO數據庫中獲得注釋, 這些基因被歸為“生物學過程”、“細胞成分”和“分子功能”三類, 細胞過程(3 129個Unigenes)、細胞組分(3 517個Unigenes)和結合(3 972個Unigenes)是三大類中包含Unigenes最多的次級GO類別(圖3)。

圖1 Unigenes注釋信息

圖2 Unigenes同源性分析

圖3 基因GO功能注釋

注: 紅色為生物學過程類別, 綠色為細胞成分類別, 藍色為分子功能類別

根據KEGG數據庫比對結果, 可將7 358個Unigenes分為5個分支33個二級通路, 包含Unigenes最多的二級通路是信號轉導(942個Unigenes), 其次是運輸和分解代謝(640個Unigenes)。

2.3 差異表達基因分析

基因表達豐度按照TPM來計算, 獲得表達豐度后, 采用DEGseq軟件進行差異表達分析, 差異表達基因篩選標準為-adjust<0.001且|log2(FoldChange)| >1。溶藻弧菌和泥蚶血細胞孵育3 h, 1 790個基因表達發生顯著改變, 包括1 319個上調基因和471個下調基因; 孵育6 h (與0 h相比), 3 183個基因表達發生顯著改變, 包括2 629個上調基因和554個下調基因(圖4)。

與0 h相比, 1 113個基因在3 h和6 h時均上調, 其中254個基因3 h表達量顯著高于0 h且6 h表達量顯著高于3 h, 表達量持續上調; 205個基因在3 h時上調6 h無顯著變化, 1 516個基因在3 h無顯著變化但在6 h時上調。與0 h相比, 267個基因在3 h和6 h時均下調, 其中8個基因表達量持續下調, 204個基因在3 h時下調6 h無變化, 286個基因在3 h時無變化6 h時發生下調; 另有1個基因3 h時上調而6 h時下, 部分差異表達基因列于表1。

2.4 差異表達基因富集分析

根據KEGG數據庫注釋信息, 進一步分析了差異表達基因通路富集, 通路顯著富集的標準為矯正后的值(-adjust)<0.05,-adjust越小, 富集越顯著。結果顯示, 3 h時1 790個差異表達基因共富集到226條通路上, 其中25條KEGG通路顯著富集, 富集程度最高的三條通路為吞噬體、細胞凋亡和局部黏附(圖5)。富集到吞噬體通路的25個差異表達基因中13個基因上調12個基因下調, 在吞噬過程中發揮重要作用的絲狀肌動蛋白、Ras相關蛋白Rab-5B、Syntaxin7/13/18在3 h樣本中表達豐度升高5倍以上, 囊泡轉運蛋白SEC22和鈣網蛋白等基因上調, 微管蛋白α和β下調。富集到細胞凋亡通路的31個基因中25個上調6個下調, 細胞凋亡通路關鍵基因腫瘤壞死因子超家族成員10、組織蛋白酶Z、Fas相關死亡結構域蛋白、凋亡調控蛋白Bcl-2、半胱氨酸蛋白酶7等均上調, 凋亡誘導因子1等下調。局部黏附通路中有32個基因上調5個基因下調, 基質蛋白2、Vitrin蛋白、Ras基因家族成員Q、局部黏附激酶1等基因均上調, β-連環蛋白等下調。胞吞通路中有33個基因上調4個基因下調, 低密度脂蛋白受體結合蛋白、囊泡蛋白分類相關蛋白37、帶電多泡體蛋白1/2/4、熱休克蛋白70等基因均上調。

圖4 溶藻弧菌刺激后泥蚶血細胞中差異表達基因火山圖

注: a. 刺激3 h和0 h相比差異表達基因火山圖; b. 刺激6 h和0 h相比差異表達基因火山圖

表1 部分差異表達基因統計

圖5 溶藻弧菌刺激3h時差異基因KEGG富集圖(僅示前20條富集通路)

3 183個在6 h時差異表達基因共富集到245條KEGG通路, 差異顯著的富集通路有34條, 富集程度最高的三條通路為蛋白酶體、細胞凋亡和內質網蛋白加工(圖6)。富集到蛋白酶體通路的上調基因有25個, 無下調基因, 蛋白酶活化劑700 (PA700)的多個亞基均上調, 20S蛋白酶體α1、α2、α3、α4、α5、α6、α7、β1、β2、β4、β6和β7亞基均上調。富集到細胞凋亡通路的基因有52個, 上調基因45個, 下調基因7個, Caspase蛋白2在6 h時上調, 腫瘤壞死因子超家族成員10和組織蛋白酶Z表達豐度顯著高于3 h, 凋亡誘導因子1下調但與3 h時相比無顯著差異。29個上調基因和8個下調基因富集到吞噬體通路, 囊泡相關膜蛋白3、溶酶體相關膜蛋白1/2、組織蛋白酶L1等在6 h時上調, 微管蛋白α和β表達豐度與3 h時無差異。51個上調基因和5個下調基因富集到內質網蛋白加工通路, 其中內質網相關降解途徑中的多個蛋白如Derlin-1等上調。52個上調基因和4個下調基因富集到胞吞通路, 部分上調基因與3 h時無差別, 但表皮生長因子受體、吞蛋白A3、囊泡蛋白分類相關蛋白22/25/28/36/、帶電多泡體蛋白5等在6 h時發生上調。

圖6 溶藻弧菌刺激6h時差異基因KEGG富集圖(僅示前20條富集通路)

另外, 溶酶體水解酶α-N-乙酰半乳糖胺酶、α-半乳糖苷酶和抗酒石酸酸性磷酸酶5表達豐度在3 h時和6 h時持續上調, 6 h時β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、α-l-巖藻糖苷酶、N-乙酰氨基半乳糖-6-硫酸酯酶、N-巰基葡萄糖胺巰基水解酶和酸性神經酰胺酶等上調; Sialin在3 h和6 h下調, 但3 h和6 h時表達豐度變化不顯著。MAPK通路中重要基因絲裂原活化蛋白激酶激酶4持續上調, 6 h時絲裂原活化蛋白激酶激酶3/6均上調。

2.5 血細胞染色觀察

泥蚶血細胞主要由紅色顆粒細胞、嗜堿性顆粒細胞和無色透明細胞組成, 紅色顆粒細胞數量最多且具有吞噬活性, 嗜堿性顆粒細胞較少也能吞噬溶藻弧菌。1 h時, 兩種具有吞噬活性的細胞(后文統一稱為吞噬細胞)胞漿中有大量被吞噬的溶藻弧菌, 被吞噬的溶藻弧菌染色后呈小顆粒狀, 顯微鏡下觀察呈藍紫色(圖7a); 3 h時吞噬細胞中能觀察到被吞噬的小顆粒狀溶藻弧菌、中等大小的顆粒以及少量大顆粒(圖7b); 6 h時吞噬細胞中大顆粒數量較3 h時增多(圖7c); 24 h時, 血涂片中觀察到部分細胞破裂后的細胞核, 吞噬細胞中仍能觀察到被吞噬的溶藻弧菌、中等大小的顆粒以及大顆粒, 部分細胞中溶藻弧菌數量較少(圖7d, 7e, 7f, 7g)。部分細胞有大量的偽足伸出(圖7h)。

3 討論

細菌入侵后, 宿主免疫系統會啟動一系列防御機制以應對細菌感染。血細胞是泥蚶免疫防御的重要執行者, 血細胞的免疫防御反應包括吞噬、呼吸暴發以及形成結節和包囊等, 在免疫防御過程中, 血細胞內許多基因表達會發生改變以響應細菌入侵。溶藻弧菌是海洋中優勢菌和條件致病菌, 溶藻弧菌感染后泥蚶免疫細胞早期響應特征還不是很清楚, 本文采用體外實驗, 研究了溶藻弧菌刺激后泥蚶血細胞轉錄組早期動態變化特點。通過轉錄組測序, 共獲得24 456個Unigenes, 溶藻弧菌刺激3 h時鑒定出1 790個差異表達基因, 刺激6 h時鑒定出3 183個差異表達基因, 隨著時間延長, 差異表達基因增加, 這種表達模式表明免疫反應是一個不斷變化、動態發展的多基因參與過程, 副溶血弧菌感染早期中華長文蛤()肝臟中基因表達也呈現出相似規律(Yu, 2019)。通過基因功能分析發現, 這些差異基因涉及吞噬體、溶酶體、蛋白酶體、內吞、剪接體、MAPK信號通路、細胞凋亡等, 表明泥蚶血細胞響應涉及眾多基因和多個生物學過程, 溶藻弧菌刺激后厚殼貽貝()血細胞也有類似響應特征(Dong, 2017)。

圖7 泥蚶血細胞染色結果

注: a. 溶藻弧菌和血細胞孵育1 h; b. 溶藻弧菌和血細胞孵育3 h,箭頭所示為溶藻弧菌; c. 溶藻弧菌和血細胞孵育3 h, 箭頭所示為中等大小顆粒和大顆粒; d. 溶藻弧菌和血細胞孵育6 h; e, f, g. 溶藻弧菌和血細胞孵育24 h, 箭頭所示為細胞核; h. 具偽足的紅色顆粒細胞

吞噬體是一種囊泡, 在吞噬微生物或微生物蛋白質的過程中, 通過質膜及其相關脂質和蛋白質的內陷形成。泥蚶屬低等無脊椎動物, 沒有淋巴細胞介導的體液免疫和細胞免疫, 血細胞的吞噬作用是抵抗細菌感染的重要途徑(孫敬鋒等, 2006; Casem, 2016; Burgos-Aceves, 2017)。泥蚶吞噬體相關基因序列多數還不是很清楚, 本研究通過轉錄組測序獲得了多個泥蚶吞噬體通路相關基因, 如絲狀肌動蛋白、Ras相關蛋白Rab-5B、囊泡轉運蛋白SEC22、鈣網蛋白等序列及表達量, 絲狀肌動蛋白在偽足和吞噬小泡形成中發揮重要作用, 吞噬小泡形成后立即與內體融合, 吞噬體和內體之間的膜融合需要Rab5 (Gorvel, 1991; Rybin, 1996), 溶藻弧菌刺激3 h, 絲狀肌動蛋白、RAB5等基因的表達量顯著增加, 表明刺激早期, 吞噬發揮重要的免疫作用, 6 h時這些基因依然高表達, 暗示6 h血細胞依然能吞噬溶藻弧菌, 這與形態學觀察相一致。

從吞噬細胞質膜上斷裂后, 新生的吞噬體最終會與溶酶體融合(Desjardins, 1994; Flannagan, 2012)。本研究通過轉錄組測序獲得多種泥蚶溶酶體酶編碼基因, 包括蛋白酶5種[組織蛋白酶(Cathepsin A/C/L/Z) 4種, 內肽酶(Legumain) 1種], 糖苷酶12種(如β-半乳糖苷酶, α-葡萄糖苷酶, α-l-巖藻糖苷酶), 硫酸酯酶2種, 脂肪酶2種, 核酸酶1種, 磷酸酶1種, 神經酰胺酶1種, 天冬氨酰氨基葡糖苷酶1種, 棕櫚酰蛋白硫酯酶1種, 共計26種水解酶的編碼基因, 這些溶酶體酶的水解作用是殺傷和清除病原微生物重要方式。溶藻弧菌和血細胞孵育3 h時, 3種水解酶表達量增加, 6 h時13種水解酶表達量增加, 表明早期主要是免疫細胞吞噬階段, 隨著吞噬體與溶酶體融合, 溶酶體水解酶開始發揮水解作用, 以殺傷和清除吞噬細胞吞噬的溶藻弧菌, 太平洋牡蠣中也有相似發現, 弧菌感染后血細胞溶酶體酶活力增加(Wang, 2017)。研究還發現部分水解酶還能釋放到血淋巴中, 水解改變病原表面的分子結構, 有利于免疫細胞識別病原微生物(Cheng, 1983; Xue, 2000), 這些水解酶的發現有助于泥蚶以及其他雙殼貝類免疫機制研究。

蛋白酶體是一種多亞單位蛋白水解復合物, 中心是具有催化作用的20s蛋白酶體, 兩個末端由調控亞復合物組成的PA700, 蛋白酶體是細胞質和細胞核中非溶酶體蛋白質降解的中心酶, 具有多種蛋白水解酶活性, 參與各種生物過程, 如錯誤折疊蛋白質和短命調節蛋白質的降解(Coux, 1996; DeMartino, 1999; Unno, 2002)。本研究獲得了泥蚶PA700多個亞基和20S蛋白酶體多個亞基, 3 h時部分蛋白酶體亞基表達量上調, 6 h大多蛋白酶體亞基表達量上調, 表明隨著時間推移蛋白酶體活性不斷增加, 也暗示泛素-蛋白質酶體通路在泥蚶免疫反應中發揮重要作用。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是真核生物中高度保守的信號轉導通路, 該信號轉導通路能將不同的細胞外刺激與廣泛的細胞內反應聯系起來, 從而在細胞的生長、分化、應激、炎癥反應等多種生理過程中發揮作用, MAPK通路有3種主要的分支路線: ERK、JNK和p38 MAPK (Roberts, 2000; Roux, 2004)。Zhang等(2019)研究發現弧菌刺激后中華長文蛤() p38 MAPK持續磷酸化, 表明MAPK信號通路在貝類免疫防御中發揮作用。本研究發現溶藻弧菌刺激后, 3 h、6 h絲裂原活化蛋白激酶激酶4 (MKK4)持續上調, MKK4能激活c-Jun氨基末端激酶(JNK), 暗示JNK信號通路在泥蚶血細胞免疫反應中發揮生理作用(Roberts, 2000; Chen, 2021); 6 h時絲裂原活化蛋白激酶激酶3和6 (MKK3, MKK6)均上調, MKK3和MKK6能激活p38 MAPK (Roberts, 2000; Chen, 2021), 結果表明p38 MAPK途徑在泥蚶血細胞抗溶藻弧菌感染中發揮防御作用; MKK4早于MKK3和MKK6上調暗示c-Jun氨基末端激酶信號通路早于p38 MAPK途徑發揮生理作用。

細胞凋亡(Apoptosis)是由基因控制的細胞自主的、有序的死亡, 這是一種可以清除受損細胞或感染病原體細胞的機制, 細胞凋亡在后生動物中普遍存在(Cohen, 1992; Bertheloot, 2021)。本研究通過轉錄組測序發現細胞凋亡通路的多個重要基因在3 h和6 h時均上調, 如半胱氨酸蛋白酶2和7, 包拉米蟲感染后扁牡蠣血細胞也發生凋亡(Gervais, 2016), 表明凋亡也是一種清除細菌感染的方式。

4 結論

本文通過體外實驗, 研究了溶藻弧菌刺激早期泥蚶血細胞轉錄譜, 分析了刺激3 h和6 h血細胞中差異表達基因, 3 h時1 790個基因表達發生改變, 6 h時鑒定出3 183個差異表達基因, 表明免疫反應是一個不斷變化、動態發展的多基因參與過程。差異表達基因富集到多條KEGG信號通路, 3 h時富集程度最高的通路有吞噬體、細胞凋亡和局部黏附, 6 h時富集程度最高的三條通路有蛋白酶體、細胞凋亡和內質網蛋白加工, 表明這些通路在免疫反應中發揮重要作用。通過轉錄組測序獲得了多種溶酶體酶編碼基因、蛋白酶體亞基編碼基因, 這些免疫相關基因的發現有助于早期免疫反應標志物的發現。本文結果可為研究泥蚶血細胞免疫反應以及抗病機理提供有效資料, 為泥蚶綠色健康養殖提供新的思路。

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THE TRANSCRIPTOMIC ANALYSIS OFHEMOCYTES OF BLOOD CLAM () CHALLENGED WITH

ZHONG Ai-Hua, WANG Ying-Bin, BI Lan-Fang, XU Hao-Lei

(College of Fishery, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

Blood clam () is a traditional cultured shellfish in China. The mortality caused by bacterial diseases has become an important issue restricting the development of clam breeding industry. Hemocytes are the executor of immune defense, and they can directly swallow foreign bodies and wrap them up by encapsulation. Hemocytes also play a role in inflammatory reaction and wound repair. In this paper, RNA sequencing was used to study the dynamic changes of transcriptome ofhemocytes stimulated byin 3 h and 6 h. Compared with unstimulated hemocytes, the expression of 1 790 genes were significantly changed at 3 h, including 1 319 up-regulated genes and 471 down-regulated genes. In 6 h, the expression of 3 183 genes changed significantly, including 2 629 up-regulated genes and 554 down regulated genes. KEGG pathway enrichment analysis found that many immune-related signal pathways or biological processes changed significantly afterstimulation, such as phagosome, apoptosis, proteasome, endoplasmic reticulum processing, local adhesion and other pathways. The expression abundance of some immune-related genes did not change significantly in 3 h, but changed significantly in 6 h, and the expression abundance of some immune-related genes changed significantly in 3 h and 6 h. This study provided a new insight into the early immune response of the hemocytes of blood clam and a theoretical basis for the study of disease resistance mechanism of blood clam.Key words;; hemocytes; transcriptome

S917.4

10.11693/hyhz20220500123

*浙江省教育廳項目, Y202044632號。鐘愛華, E-mail: zhongpe@zjou.edu.cn

2022-05-10,

2022-07-21