基于核酸適配體的差減熒光法檢測鰻弧菌(Vibrio anguillarum)*

范云庭 鄭 江① 薄 軍 江興龍 劉慧敏 黃將遠

基于核酸適配體的差減熒光法檢測鰻弧菌()*

范云庭1, 2鄭 江1, 2①薄 軍3江興龍1, 2劉慧敏1黃將遠1

(1. 集美大學水產學院 福建廈門 361021; 2. 鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心 福建廈門 361021; 3. 自然資源部海洋第三研究所 福建廈門 361005)

鰻弧菌()可感染鰻鱺、虹鱒和大菱鲆等多種水產動物, 是水產養殖中的一種重要病原菌, 對其進行快速檢測是病害防控的前提和基礎。利用鰻弧菌與其核酸適配體之間有較強的親和特異性, 首次建立了一種基于核酸適配體的可定量檢測鰻弧菌的差減熒光法。該方法對鰻弧菌有較好的特異性, 對鰻弧菌的檢測熒光值是其他菌(溶藻弧菌、哈維氏弧菌、銅綠假單胞菌、變形假單胞菌、嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌和大腸桿菌)的4～11倍, 對鰻弧菌的最低檢測限為102CFU/mL, 可用于102～108CFU/mL的范圍內的定量檢測。通過對不同鹽度海水和魚體組織樣品進行加標回收檢測, 結果表明, 回收率和相對標準偏差等指標均符合相應的標準, 說明該檢測方法可用于海水樣品和水產動物組織中鰻弧菌的檢測。

鰻弧菌; 核酸適配體; 親和特異性; 熒光強度

鰻弧菌()隸屬于弧菌科、弧菌屬, 生物學形態為短桿狀、兩端鈍圓、彎曲呈弧形, 是一種致病性較高的革蘭氏陰性菌(Hickey, 2018)。鰻弧菌可以感染多種魚類、蝦類和貝類, 對水產養殖和食品安全都有巨大的危害(王金龍等, 2020)。對鰻弧菌進行快速的檢測, 是其病害防治的前提和基礎。目前, 針對鰻弧菌等弧菌的檢測方法主要有微生物培養法(Da-Silva, 2018), 以基因為靶點的分子生物學法(孫晶晶等, 2015; Luo, 2018; Kim, 2019), 以及以抗體為基礎的免疫檢測法(吳斌等, 2016; Zhang, 2016; Yonekita, 2020; 王曉瑞等, 2021; 吳美嬌等, 2021)。微生物培養法耗時較長, 檢測限通常在103或104CFU/mL左右, 靈敏度不高, 難以定量。分子生物學法在區分同源性較高的弧菌時效果不夠理想(Sawabe, 2007; Wei, 2014)。而抗體等免疫檢測法則受抗體蛋白的制備、穩定性等因素影響較大, 實際應用中常常受到不同程度的限制。因此, 尋找和開發更為理想的針對鰻弧菌的檢測技術變得尤為重要。

核酸適配體(Aptamer)是通過SELEX技術(Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment)篩選出的一類寡核苷酸分子(趙麗萍等, 2020)。它對靶目標有較高的親和特異性, 具有分子量小、易修飾、組織滲透率高和靶目標范圍廣等諸多優點(Muhammad, 2021), 在金屬離子、小分子、蛋白質、細菌和細胞等靶目標的檢測分析中都得到廣泛應用(劉若冰等, 2020; 曲瑤等, 2020; 孫淼等, 2020; 趙晨等, 2020; 杜彩溢等, 2021; Yu, 2021)。因此, 篩選鰻弧菌的核酸適配體, 并將其應用于鰻弧菌的檢測, 將有望獲得較好的檢測效果。

本文利用前期獲得的對鰻弧菌有較好親和特異性的核酸適配體(鄭江等, 2022), 建立了可定量檢測鰻弧菌的技術——“差減熒光法”。該方法利用鰻弧菌特異性地結合溶液中帶有熒光標記的核酸適配體, 使溶液的熒光值下降, 而且該熒光下降幅度與鰻弧菌濃度成正比, 因此通過檢測溶液中熒光強度的變化就可以實現對鰻弧菌的定量檢測。文中進一步研究了該方法的特異性和定量檢測效果, 并通過加標回收法對海水和魚體組織進行了檢測驗證。相關研究對于鰻弧菌的病害防治以及核酸適配體的應用開發都具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 核酸適配體 核酸適配體為先前篩選并驗證的鰻弧菌核酸適配體H5 (鄭江等, 2022), 序列為5￠-TCAGTCGCTTCGCCGTCTCCTTCTCCCTCTTGTGCTCCCTCTTGTGCAGCCT GAGCACAAGAGGGA GACCCCAGAGGG-3￠, 在其5￠端標記FAM熒光基團, 核酸適配體的合成及熒光基團的標記均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.1.2 人工海水和養殖鰻鱺 速溶海水晶溶解于超純水中, 并用鹽度計標定, 配制出人工海水, 速溶海水晶購買自濟南衍德生物科技有限公司。歐洲鰻鱺()由集美大學龍舟池水產試驗場提供。

1.1.3 實驗用菌和培養基 鰻弧菌()、溶藻弧菌()、哈維氏弧菌()、遲鈍愛德華氏菌()、大腸桿菌()、銅綠假單胞菌()、變形假單胞菌()和嗜水氣單胞菌()均由集美大學病原微生物實驗室提供。胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB培養基), 用于鰻弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌、遲鈍愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌的培養; LB培養基(Luria-Bertani培養基), 用于大腸桿菌、銅綠假單胞菌和變形假單胞菌的培養。

1.1.4 結合緩沖液 20×結合緩沖液: NaCl 5.844 g、KCl 3.725 g、Tris-HCl 6.06 g、MgCl2·6H2O 2.033 g, 超純水定容至100 mL, 調pH至7.4。使用時用超純水稀釋為 2×和1×結合緩沖液。

1.2 特異性研究

1.2.1 熒光顯微鏡的定性觀察 將濃度為300 nmol/L的標記了熒光基團的核酸適配體置于金屬浴95 °C加熱5 min, 冰浴10 min。用2×結合緩沖液將6種細菌(遲鈍愛德華氏菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、哈維氏弧菌、大腸桿菌和鰻弧菌)分別稀釋至108CFU/mL。然后取上述菌的懸液各100 μL與100 μL的核酸適配體結合, 作為實驗組; 另取100 μL 2×結合緩沖液代替核酸適配體, 與100 μL菌液結合, 作為對照組。實驗組和對照組一同在常溫25 °C下、100 r/min搖床孵育30 min, 隨后6 000 r/min離心5 min, 棄上清, 1×結合緩沖液洗滌菌沉淀3次, 洗去未結合的核酸適配體,再用100 μL 1×結合緩沖液懸浮菌沉淀。玻片用無菌超純水和酒精沖洗后烘干, 取1～3 μL菌懸液樣品, 沿著一條斜線進行涂片, 再用酒精燈烘干固定, 冷卻后, 用番紅染色液染色1～3 min, 再用無菌超純水洗掉染色液。晾干后置于熒光顯微鏡下觀察, 并在亮度為71%, 伽馬值為0.65, 熒光強度為2檔的條件下分別拍攝明場和熒光場下的圖片。

1.2.2 差減熒光法檢測 將濃度為100 nmol/L的核酸適配體置于金屬浴95 °C加熱5 min, 冰浴10 min, 后續核酸適配體使用前都依此法處理。用2×結合緩沖液將8種細菌(溶藻弧菌、哈維氏弧菌、銅綠假單胞菌、變形假單胞菌、嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、大腸桿菌和鰻弧菌)分別稀釋至105CFU/mL。然后取上述菌的懸液各300 μL與100 μL的核酸適配體結合, 作為實驗組; 另取300 μL的2×結合緩沖液代替菌懸液, 與100 μL的核酸適配體結合, 作為對照組。實驗組和對照組都各3個平行。實驗組和對照組一同在常溫25 °C下、200 r/min搖床孵育1 h, 隨后6 000 r/min離心取上清液用Qubit3.0熒光定量儀測定實驗組和對照組的熒光強度, 則細菌結合的熒光值=對照組平均熒光值-實驗組平均熒光值。

1.3 定量研究及其工作曲線

將鰻弧菌用2×結合緩沖液分別稀釋至濃度為1、10、102、103、104、105、106、107和108CFU/mL, 然后取100 μL 100 nmol/L的核酸適配體分別與300 μL上述各濃度的鰻弧菌懸液結合, 作為實驗組; 對照組與特異性研究中的相同, 實驗組和對照組也都各3個平行。之后按照1.2.2的差減熒光法進行檢測, 得到鰻弧菌結合的熒光值, 然后以鰻弧菌濃度的常用對數為橫坐標, 以其結合的熒光值為縱坐標, 作圖并進行線性擬合, 可得到相應的工作曲線及其擬合方程。

1.4 海水樣品的檢測

為了研究該方法對海水樣品中鰻弧菌的檢測效果, 選用不同鹽度的海水樣品進行加標回收實驗。先配制鹽度為20、30、35和40的人工海水樣品, 然后分別取濃度為2×102和2×103CFU/mL的菌懸液各2 mL與2 mL上述不同鹽度的海水樣品混合配制成加標樣品, 此時加標樣品中鰻弧菌的濃度分別為102和103CFU/mL。隨后取100 μL 100 nmol/L的核酸適配體與300 μL加標樣品混合, 作為實驗組; 另外, 將150 μL的不同濃度海水樣品和150 μL的2×結合緩沖液混合代替菌懸液, 與100 μL 100 nmol/L的核酸適配體混合, 作為對照組。實驗組和對照組都各3個平行。后續按照1.2.2的差減熒光法進行檢測, 得到每個加標樣品中鰻弧菌結合的熒光值, 然后根據工作曲線及其回歸方程, 可計算出相應的回收量, 相應的回收率=回收量/加入量×100%。

1.5 魚體組織樣品的檢測

為了研究該方法對魚體不同組織中鰻弧菌的檢測效果, 選用不同的魚體組織進行加標回收實驗。將鰻鱺的腮、胃、腎、表皮和肌肉等組織器官取出并剪碎, 稱取0.5 g, 加入5 mL的2×結合緩沖液浸泡1 h, 然后離心取上清制成組織懸液(李改娟等, 2013)。再取濃度分別為2×102和2×103CFU/mL鰻弧菌懸液各2 mL, 與2 mL組織懸液樣品混合配制成加標樣品, 此時加標樣品中鰻弧菌濃度分別為102和103CFU/mL。隨后取100 μL 100 nmol/L核酸適配體與300 μL加標樣品混合, 作為實驗組; 另取150 μL的組織懸液和150 μL的2×結合緩沖液混合代替加標樣品, 與100 μL 100 nmol/L的核酸適配體混合, 作為對照組。實驗組和對照組都各3個平行。后續按照1.2.2的差減熒光法進行檢測, 得到每個加標樣品中鰻弧菌結合的熒光值。回收量和回收率的計算按1.4的方法進行計算。

1.6 統計分析

利用EXCEL軟件中的-檢驗函數對實驗數據進行組間差異分析,<0.05為差異顯著,<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 差減熒光法的檢測原理

檢測原理如圖1所示, 標記了熒光基團的核酸適配體為識別分子, 鰻弧菌為被檢測的靶目標。空白對照組中, 含有熒光基團的核酸適配體溶液與緩沖液混合, 由于體系中無鰻弧菌等樣品, 離心后無菌沉淀,核酸適配體也幾乎沒有損失, 溶液中的熒光強度基本沒有變化。而在實驗組中, 檢測體系中存在鰻弧菌, 由于鰻弧菌與其核酸適配體有較好的親和特異性, 鰻弧菌會與核酸適配體結合, 離心去掉菌沉淀后, 與鰻弧菌結合的含有熒光基團的核酸適配體也隨之被去除, 此時上清溶液中的熒光強度就會降低。用空白對照的熒光值減去實驗組的熒光值, 得到的差值就是鰻弧菌所結合的適配體的熒光值。而且鰻弧菌含量越高, 能結合的核酸適配體也就越多, 這個熒光差值就越大。因此, 通過分析空白對照組和實驗組中上清液的熒光差值可以實現對鰻弧菌的檢測。

圖1 基于核酸適配體的差減熒光法檢測鰻弧菌的示意圖

2.2 特異性研究

2.2.1 熒光顯微鏡的定性觀察 采用熒光顯微鏡法對鰻弧菌和其他5種菌(遲鈍愛德華氏菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、哈維氏弧菌和大腸桿菌)進行了定性檢測, 結果如圖2所示。可以看到, 這些細菌本身均無明顯的熒光, 但鰻弧菌與帶有熒光基團的核酸適配體結合后, 鰻弧菌呈現出較為明顯的熒光, 而其他菌均沒有呈現出明顯的熒光。說明該核酸適配體對鰻弧菌有較好的識別能力, 可用于鰻弧菌的識別檢測。

2.2.2 差減熒光法的檢測 通過熒光顯微鏡定性觀察, 確定了相應核酸適配體的識別效果。在此基礎上, 采用差減熒光法對濃度均為105CFU/mL的鰻弧菌和其他7種菌(溶藻弧菌、哈維氏弧菌、銅綠假單胞菌、變形假單胞菌、嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌和大腸桿菌)進行了檢測, 結果如圖3所示。可以看到, 鰻弧菌結合的熒光值要顯著高于其他菌(<0.01), 是其他菌熒光值的4～11倍, 說明鰻弧菌能特異性結合溶液中含有熒光的核酸適配體, 從而導致溶液中熒光強度的大幅降低。由此可知, 基于該核酸適配體的差減熒光法可特異性識別鰻弧菌。

圖2 放大200倍的熒光顯微鏡觀察圖

注: BF: 明場; FLUO: 熒光場; Van: 鰻弧菌; Van+Apt: 與核酸適配體混合后的鰻弧菌; Et: 遲鈍愛德華氏菌; Et+Apt: 與核酸適配體混合后的遲鈍愛德華氏菌; Val: 溶藻弧菌; Val+Apt: 與核酸適配體混合后的溶藻弧菌; Ah: 嗜水氣單胞菌; Ah+Apt: 與核酸適配體混合后的嗜水氣單胞菌; Vh: 哈維氏弧菌; Vh+Apt: 與核酸適配體混合后的哈維氏弧菌; Ec: 大腸桿菌; Ec+Apt: 與核酸適配體混合后的大腸桿菌。比例尺=100 μm

2.3 定量研究

鰻弧菌與核酸適配體結合后, 隨著鰻弧菌濃度的增大, 鰻弧菌結合的熒光強度也逐漸增大, 且鰻弧菌濃度的常用對數與其結合的熒光值呈現出良好的線性關系, 線性擬合系數達到0.990 2 (如圖4), 說明該方法在實驗范圍內有較好的線性, 可用于鰻弧菌的定量檢測。不過鰻弧菌在濃度1和10 CFU/mL下的熒光強度均接近0, 與空白差異不顯著(>0.05), 檢出有難度, 因此較為可靠和準確的檢測限應為102CFU/mL, 相應鰻弧菌的定量檢測范圍為102～108CFU/mL。

圖3 對鰻弧菌檢測的特異性

注: Val: 溶藻弧菌; Van: 鰻弧菌; Vh: 哈維氏弧菌; Pa: 銅綠假單胞菌; Pp: 變形假單胞菌; Ah: 嗜水氣單胞菌; Et: 遲鈍愛德華氏菌; Ec: 大腸桿菌

圖4 鰻弧菌檢測的工作曲線及其線性擬合曲線

2.4 海水樣品的檢測

采用差減熒光法對不同鹽度的海水和鹽度為0的淡水中菌的含量進行了加標檢測, 并按照標準曲線計算相應的含量和回收率, 結果如表1所示。可以看到, 不同鹽度的樣品, 添加量是100 CFU/mL時的加標回收率為80.13%～109.69%, 添加量是1 000 CFU/mL時的加標回收率為67.84%～121.33%, 這個回收率符合2020年的《中華人民共和國藥典》中對微生物計數的要求(國家藥典委員會, 2020)。同時, 該方法對海水樣品檢測的相對標準偏差均小于12%, 符合檢測體系標準(孔德莉等, 2021)。由此可知, 該檢測方法準確可靠, 可用于海水樣品中鰻弧菌的檢測。

表1 海水樣品中鰻弧菌的加標回收實驗結果

2.5 魚體組織樣品的檢測

采用差減熒光法對魚體器官進行檢測, 按照標準曲線計算得到相應的含量和回收率, 結果如表2所示。可以看到, 不同組織器官的樣品, 添加量是100 CFU/mL時對應的加標回收率為83.27%～105.86%,添加量是1 000 CFU/mL時對應的加標回收率為71.13%～94.09%, 該加標回收率也符合《中華人民共和國藥典》中對微生物計數的要求(國家藥典委員會, 2020)。同時, 該方法對魚體組織樣品檢測的相對標準偏差均小于12%, 符合檢測體系標準(孔德莉等, 2021)。因此, 該檢測方法對魚體組織樣品中的鰻弧菌也有較好檢測效果, 可用于水產品或食品中鰻弧菌的檢測。

表2 鰻鱺組織中鰻弧菌的加標回收實驗結果

3 討論

核酸適配體主要是通過其形成的特定三維結構, 如莖、環、發夾、假結、三鏈體或四鏈體等, 依靠氫鍵、范德華力、靜電作用等相互作用, 與靶標形成穩定復合物, 從而實現對靶標的識別和結合(Patel, 2000)。它具有親和特異性高、分子量小、易修飾、靶分子范圍廣等多種優點(Muhammad, 2021), 在分子識別等檢測領域展現出巨大的應用潛力。本文采用的鰻弧菌核酸適配體H5, 則是一種能夠進入鰻弧菌內部的核酸適配體, 前期的研究表明, 該核酸適配體很可能是先與鰻弧菌表面位點結合, 再通過胞吞作用進入菌體內部的(鄭江等, 2022)。因此鰻弧菌能夠特異性的結合吞噬這個帶有熒光基團的核酸適配體, 從而使溶液中的熒光強度下降, 本文則首次利用這種能進入菌體內的核酸適配體, 建立了差減熒光法, 實現了對鰻弧菌的定量檢測。

有關鰻弧菌的檢測方法主要有傳統的微生物培養法、以基因為靶點的分子生物學方法和抗體為基礎的免疫學方法。市售的檢測試劑盒主要采用的是微生物培養法, 該方法檢測時間較長(Da-Silva, 2018; 湯學敏等, 2019), 靈敏度不高, 對弧菌的檢測限一般在103～104CFU/mL左右, 無法實現定量檢測。比較而言, 分子生物學的檢測方法靈敏度較高。孫晶晶等(2015)報道了以鰻弧菌的4和這兩個毒力基因為靶點的雙重PCR檢測法, 其對鰻弧菌的檢測限為2.4×103CFU/mL, 定量范圍為2.4×103～2.4×108CFU/mL, 而以溶血素毒力基因4為靶點的LAMP檢測法, 其檢測限可達2.4×101CFU/mL, 定量范圍為2.4×101～2.4×108CFU/mL; Luo等(2018)報道了以鰻弧菌的基因為靶點的多重PCR檢測法, 其檢測限可達2.7×104CFU/mL, 定量范圍為2.7×104～2.7×107CFU/mL。在鰻弧菌的免疫學檢測方面, 吳斌等(2016)建立了鰻弧菌的膠體金免疫層析快速檢測方法, 其檢測限為6.3×104CFU/mL, 定量范圍為6.3×104～ 6.3×108CFU/mL; Zhang等(2016)建立了鰻弧菌的量子點標記免疫分析法, 其檢測限為103CFU/mL, 定量范圍為103～108CFU/mL。本文建立的基于核酸適配體的差減熒光法, 對鰻弧菌的檢測限為102CFU/mL, 定量范圍為102～108CFU/mL, 在檢測限和定量范圍上都居于較優的水平, 并能對海水樣品、魚體組織樣品進行較好的檢測, 體現出了較好的抗干擾性和應用前景。

4 結論

利用核酸適配體和鰻弧菌之間較好的親和特異性, 建立的一種基于核酸適配體的差減熒光法, 可定量檢測鰻弧菌, 該方法可特異性的識別鰻弧菌, 在102～108CFU/mL范圍內呈現出較好的線性關系, 最低檢測限為102CFU/mL, 在海水樣品和魚體組織樣品的檢測中, 均呈現了較好的檢測效果。

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DETECTION OFBY DIFFERENTIAL FLUORESCENCE METHOD USING APTAMER

FAN Yun-Ting1, 2, ZHENG Jiang1, 2, BO Jun3, JIANG Xing-Long1, 2, LIU Hui-Min1, HUANG Jiang-Yuan1

(1. Fisheries College of Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Engineering Research Center of the Modern Technology for Eel Industry, Ministry of Education, Xiamen 361021, China; 3. Third Institute of Oceanography, Ministry of Natural Resources, Xiamen 361005, China)

infects many aquatic animals such as eel, rainbow trout, and turbot, and is an important pathogen in aquaculture industry. Rapid detection is necessary to control of.-induced disease. Based on the strong affinity betweenand its aptamer, a quantitative differential fluorescence detection method of the pathogen was developed using the aptamer for the first time. The detection method is veryspecific, and the binding fluorescence values ofwas 4～11 times those of other bacteria such as,,,,,, and. The minimum detection limit ofreached 102CFU/mL and good linear relationship was found in the detection range of 102～108CFU/mL. Recovery experiments were carried out for the seawater samples with different salinities and different fish tissue samples. The results show that the detection indexes such as recovery rate and relative standard deviation were in line with the corresponding standards, indicating that the differential fluorescence method can be used in the detection ofin seawater samples and tissue samples of aquatic animals.Key words; aptamer; affinity specificity; fluorescence intensity

Q939; S917.1

10.11693/hyhz20220600172

*福建省自然科學基金項目, 2018J01455號, 2021J01823號; 鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心開放基金項目, RE202205號。范云庭, 碩士研究生, E-mail: fffanyunting@163.com

鄭 江, 博士, 教授, E-mail: zhengjiang618@163.com

2022-06-28,

2022-08-08