柴胡疏肝散對慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激抑郁模型大鼠的抗抑郁作用研究

滕海英，肖建平，付仰志，石小峰

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州 350003；2.福建省康復(fù)技術(shù)重點實驗室，福建 福州 350003）

抑郁癥是一種高病死率、高致殘率，以情緒障礙為主要表現(xiàn)的慢性精神類疾病，嚴(yán)重影響人們的身心健康［1］。目前抗抑郁西藥在治療抑郁癥的過程中仍存在毒副作用大且易復(fù)發(fā)的局限性［2］，因此許多學(xué)者將關(guān)注的焦點指向天然藥用植物和中藥復(fù)方，以期從中獲取有效的抗抑郁藥物。柴胡疏肝散是疏肝理氣代表方劑，以疏肝解郁、行氣止痛為主要功效，諸藥相輔相成，具有良好的抗抑郁作用［3］。PI3K/Akt信號通路作為近幾年重點關(guān)注的機(jī)制通路之一，其在中藥抗抑郁治療以及作用機(jī)制研究方面受到人們的重點關(guān)注［4］。有研究發(fā)現(xiàn)柴胡疏肝散的抗抑郁作用可能受到PI3K/Akt信號通路的影響［5］，因此本研究探討柴胡疏肝散對慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激（CUMS）抑郁模型大鼠海馬PI3K/Akt信號通路以及去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）的影響，為柴胡疏肝散在抗抑郁的臨床研究和應(yīng)用方面提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量180～200 g，由福州諾敦斯生物科技有限公司提供，動物許可證號為SCXK（浙）2019-0002，置于福建省中醫(yī)藥科學(xué)院比較醫(yī)學(xué)實驗中心飼養(yǎng)。除正常組外，單籠孤立飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境安靜，室溫（20±2）℃，濕度（50±10）%，每日光照12 h，自由攝食和飲水。

1.2 藥物與試劑 柴胡疏肝散顆粒劑購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院顆粒藥房；文拉法辛膠囊（成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號：201203，規(guī)格：25 mg/粒）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、上樣緩沖液、轉(zhuǎn)模緩沖液均購自上海碧云天生物科技有限公司；兔抗p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt均購自武漢亞科因生物科技有限公司，貨號：ABP50495、ABP 52202、ABP0030、ABP0059；NE試劑盒、5-HT試劑盒均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號：2202R23、2202R16；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（德國Millipore公司）。

1.3 實驗儀器 PowerPac Basic型電泳儀、Mini Trans- blot型轉(zhuǎn)印槽、Gel Doc XR＋凝膠成像分析系統(tǒng)、680全自動酶標(biāo)儀均購自美國Bio-Rad公司。

2 實驗方法

2.1 藥液的制備 柴胡疏肝散（柴胡12 g，陳皮12 g，炙甘草3 g，白芍9 g，川芎9 g，香附9 g，枳殼9 g），由福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院顆粒藥房配制免煎顆粒劑，一劑藥加蒸餾水5 mL，研磨均勻后，加蒸餾水定容至14 mL，即得濃度為4.500 g/mL柴胡疏肝散藥液，另取柴胡疏肝散藥液與蒸餾水1∶1及1∶3稀釋，即得濃度為2.250、1.125 g/mL柴胡疏肝散藥液。取3粒文拉法辛膠囊粉末，加蒸餾水10 mL，研磨均勻后，加蒸餾水定容至25 mL，即得濃度為3 mg/mL文拉法辛溶液。

2.2 實驗建模 將48只SD大鼠隨機(jī)分為正常組8只和建模組40只，建模組參照文獻(xiàn)［6］的方法以CUMS結(jié)合孤養(yǎng)方法構(gòu)建抑郁癥大鼠模型。在實驗第1～28天，每日對建模組施加不規(guī)律的禁食（24 h）、禁水（24 h）、束縛（3 h）、傾斜籠（45°，24 h）、潮濕（24 h）、冷水游泳（10 ℃，5 min）、熱刺激（45 ℃，3 min）、夾尾5 min等CUMS條件，選擇1～2種條件隨機(jī)安排，以避免大鼠產(chǎn)生適應(yīng)。當(dāng)大鼠主要表現(xiàn)為飲水量顯著降低、毛色暗淡、體質(zhì)量減輕、糖水偏好指數(shù)下降等抑郁癥狀時，提示建模成功［7］。

2.3 分組與給藥 建模成功后，將40只建模組大鼠隨機(jī)平均分為模型組、文拉法辛組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。低、中、高劑量組分別以1.125、2.250、4.500 g/mL柴胡疏肝散藥液（相當(dāng)于臨床人日用量的6.3、12.6、25.2倍），文拉法辛組以3 mg/mL文拉法辛溶液（相當(dāng)于臨床人日用量的6.3倍）［6］，正常組與模型組以生理鹽水，每日均按體質(zhì)量0.5 mL/100 g灌胃1次，連續(xù)給藥14 d。給藥期間，除正常組外，其余各組繼續(xù)給予CUMS。

2.4 組織標(biāo)本的采集 實驗結(jié)束后，大鼠經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥麻醉，腹主動脈采血，分離血清，-80 ℃凍存。采血后，斷頸處死，斷頭取腦，冰上剝離海馬組織，生理鹽水沖洗，迅速置入液氮，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱凍存。

2.5 指標(biāo)測定

2.5.1 大鼠體質(zhì)量 記錄實驗前后各組大鼠體質(zhì)量，比較各組大鼠體質(zhì)量變化情況。

2.5.2 大鼠行為學(xué)觀察 ① 糖水偏好實驗（SPT）：大鼠單籠飼養(yǎng)，實驗前先訓(xùn)練大鼠24 h糖水適應(yīng)；按照文獻(xiàn)［8］方法，經(jīng)1瓶白水與1瓶1%蔗糖水飲用適應(yīng)12 h和禁食禁水12 h后，在禁食下給予1瓶白水與1瓶1%蔗糖水飲用，記錄12 h白水和蔗糖水的消耗量，計算大鼠糖水偏好指數(shù)，計算公式：糖水偏好指數(shù)＝糖水消耗量/（白水消耗量＋糖水消耗量）×100%。② 強(qiáng)迫游泳實驗（FST）：按照文獻(xiàn)［9］方法在底部直徑20 cm、高度45 cm的透明圓柱形游泳筒內(nèi)進(jìn)行FST。實驗前1 d進(jìn)行15 min的強(qiáng)迫游泳適應(yīng)性訓(xùn)練，水溫保持（25±1）℃，攝像機(jī)記錄6 min，記錄時間6 min內(nèi)后4 min大鼠呈現(xiàn)不動狀態(tài)的時間。

2.5.3 Western blot檢測海馬組織p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白相對表達(dá)量并計算p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值 海馬組織經(jīng)組織裂解液裂解后，勻漿后離心取上清液，進(jìn)行蛋白相對表達(dá)量測定。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉1 h，兔一抗GAPDH（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、PI3K（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔二抗（1∶10 000）孵育1 h，顯影后應(yīng)用Image-J軟件分析條帶灰度值，GraphPad Prism 6軟件統(tǒng)計分析并作圖。內(nèi)參為GAPDH，目標(biāo)蛋白條帶與GAPDH灰度值的比值為相對表達(dá)量。

2.5.4 ELISA法檢測海馬組織NE、5-HT含量 根據(jù)NE、5-HT的ELISA試劑盒的說明書方法進(jìn)行測定，利用全自動酶標(biāo)儀檢測450 nm吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品劑量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料符合正態(tài)分布的以（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量比較 干預(yù)后與正常組比較，模型組體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01），表現(xiàn)為抑郁特征；干預(yù)后與模型組比較，文拉法辛組、低劑量組、中劑量組、高劑量組體質(zhì)量均升高（P均＜0.05或0.01）；干預(yù)后與文拉法辛組比較，低、中、高劑量組體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)前后體質(zhì)量比較（±s） g

表1 各組大鼠干預(yù)前后體質(zhì)量比較（±s） g

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

3.2 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較 干預(yù)后與正常組比較，模型組糖水偏好指數(shù)顯著降低，強(qiáng)迫游泳不動時間顯著延長（P均＜0.01），表現(xiàn)為抑郁行為特征；干預(yù)后與模型組比較，文拉法辛組、低劑量組、中劑量組、高劑量組糖水偏好指數(shù)均升高，強(qiáng)迫游泳不動時間均減少（P均＜0.05或0.01）；與文拉法辛組比較，低劑量組糖水偏好指數(shù)降低（P＜0.05），中、高劑量組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05），結(jié)果表明柴胡疏肝散具有改善抑郁行為的作用。見表2。

表2 各組大鼠的行為學(xué)指標(biāo)比較（±s）

表2 各組大鼠的行為學(xué)指標(biāo)比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01；與文拉法辛組比較，4） P＜0.05。

3.3 各組大鼠海馬組織p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白相對表達(dá)量與p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比較 柴胡疏肝散可能通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路關(guān)鍵蛋白發(fā)揮抗抑郁作用，上調(diào)相關(guān)通路蛋白PI3K、Akt的磷酸化水平。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比較

3.4 各組大鼠海馬組織NE、5-HT含量比較 柴胡疏肝散可提高CUMS抑郁模型大鼠海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平，見表3。

表3 各組大鼠海馬組織NE、5-HT含量比較（±s） ng/L

表3 各組大鼠海馬組織NE、5-HT含量比較（±s） ng/L

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01；與文拉法辛組比較，4） P＜0.05。

4 討 論

柴胡疏肝散出自《景岳全書》，是疏肝解郁的代表方劑，方中柴胡為君藥，疏肝理氣，暢達(dá)氣機(jī)；川芎、香附活血理氣，輔助柴胡疏肝解郁；陳皮、枳殼燥濕化痰，理氣健脾；白芍養(yǎng)血柔肝；甘草調(diào)和藥性。諸藥相輔相成，共奏良好抗抑郁作用［3］。柴胡疏肝散治療抑郁癥臨床療效的Meta分析研究提示：單用柴胡疏肝散在改善抑郁癥狀和有效率方面明顯優(yōu)于抗抑郁藥，且無嚴(yán)重不良反應(yīng)［10］。文拉法辛作為臨床上常見有效的抗抑郁藥物，在國內(nèi)外抗抑郁動物研究中均有明顯作用［6］。根據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》中大鼠的給藥等效劑量相當(dāng)于人的6.3倍，本實驗采用文拉法辛臨床常用劑量（75～225 mg/d）的劑量中值150 mg/d換算大鼠實驗給藥劑量，結(jié)果表明文拉法辛可改善抑郁模型大鼠抑郁狀態(tài)。

本實驗采用CUMS抑郁模型，其理論依據(jù)是通過模擬人類日常的不良應(yīng)激因素，長期、慢性、不可預(yù)知的刺激誘發(fā)加速動物抑郁癥的發(fā)展。CUMS抑郁模型是在國內(nèi)外研究中廣泛使用的模型，多采用孤養(yǎng)結(jié)合CUMS建立抑郁模型，具有高度有效性［11］。本實驗結(jié)果表明：CUMS影響大鼠的日常活動，表現(xiàn)出精神倦怠、飲食減少、毛色暗淡、體質(zhì)量減輕、易激惹，提示建模成功。經(jīng)柴胡疏肝散治療后，大鼠的狀態(tài)明顯改善，提示柴胡疏肝散具有抗抑郁作用。

PI3K/Akt信號通路作為近幾年研究的重要通路之一，其在抗抑郁治療和作用機(jī)制的研究逐漸被關(guān)注［12］。研究發(fā)現(xiàn)抑郁患者的PI3K和Akt酶活性降低，與抑郁障礙發(fā)生密切相關(guān)［13］。有研究發(fā)現(xiàn)CUMS抑郁模型小鼠海馬組織PI3K和Akt的磷酸化水平下調(diào)，甘草酸可激活PI3K/Akt通路，上調(diào)相關(guān)蛋白活性，從而改善小鼠抑郁癥狀［14］。文拉法辛通過影響PI3K/Akt信號通路提高BDNF的表達(dá)，抑制海馬組織神經(jīng)元的凋亡，從而發(fā)揮抗抑郁作用［15］。有學(xué)者通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對柴胡疏肝散抗抑郁作用的分子水平機(jī)制分析，發(fā)現(xiàn)其主要與PI3K/Akt信號通路有關(guān)［5］。本實驗結(jié)果表明：柴胡疏肝散可逆轉(zhuǎn)CUMS抑郁模型大鼠海馬組織p-PI3K和p-Akt的抑制作用，上調(diào)PI3K和Akt的磷酸化水平，表明柴胡疏肝散通過激活PI3K/Akt通路發(fā)揮抗抑郁作用。

研究顯示在抑郁癥的發(fā)病和抗抑郁藥物治療機(jī)制中，NE、5-HT受體起著重要作用，抑郁癥患者血清NE、5-HT明顯低于正常人［16］。有研究發(fā)現(xiàn)百合逍遙散可上調(diào)抑郁模型大鼠海馬組織的NE與5-HT含量，與氟西汀聯(lián)用可增強(qiáng)抗抑郁療效［17］。本實驗結(jié)果表明：柴胡疏肝散可上調(diào)CUMS抑郁模型大鼠海馬組織的NE、5-HT含量，與文拉法辛組在上調(diào)CUMS抑郁模型大鼠海馬組織的NE、5-HT方面具有等效性。

綜上，柴胡疏肝散可通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路，改善CUMS抑郁模型大鼠的抑郁行為，以及提高海馬組織NE、5-HT含量，充分證實了柴胡疏肝散對CUMS抑郁模型大鼠具有抗抑郁的治療作用，為本方治療抑郁癥的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。