天麻鉤藤藥對減輕高血壓小鼠心臟炎癥及改善射血功能的研究

高華健，林 珊，魯竹青，王天一，王乙連，褚劍鋒，3*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學陳可冀學術思想傳承工作室，福建 福州 350122）

高血壓是以體循環動脈壓升高為主要表現的一種常見疾病［1］。腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin-angiotensin-aldosterone systerm，RASS）的激活與高血壓關系密切［2］，其中血管緊張素Ⅱ（angio?tensin Ⅱ，Ang Ⅱ）可以收縮血管引起血壓上升，在持續的高血壓以及Ang Ⅱ的共同作用下，會引起心臟損傷，使心臟炎癥因子升高，升高的炎癥因子又會加重心臟損傷，引起心肌肥厚，最終導致心室重構［3-4］。雖然以天麻鉤藤藥對作為君藥的方劑如天麻鉤藤飲等常用于治療頭痛、眩暈和高血壓，但單獨研究天麻鉤藤藥對治療高血壓心臟損傷的實驗未見報道。本研究主要探討天麻鉤藤藥對高血壓小鼠心臟損傷的影響及機制，為臨床應用該藥對提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 16周齡的SPF級C57BL/6小鼠18只，雄性，體質量（25±30）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證號：SCXK（滬）2018-0016，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物實驗室，實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2019-0007。飼養在室溫22～25℃、相對濕度40%～70%的環境中，每天光照/黑暗各12 h，自由進食、飲水。動物處理方法符合中華人民共和國科技部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2 實驗藥材 天麻、鉤藤均購自安國市一方藥業有限公司。

1.3 實驗試劑 伊紅（貨號：G1100）、蘇木素（貨號：G1140）、Masson三色染色試劑盒（貨號：G1340）均購自北京索萊寶科技有限公司；AngⅡ（貨號：120183）、IL-6抗體（貨號：208113）、TNF-α抗體（貨號：41504）均購自英國Abcam公司；免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術有限公司，貨號：KIT-9720）；植入式膠囊微滲透壓泵（美國ALZET公司，貨號：2004）。

1.4 實驗儀器 CODA無創鼠尾血壓測量儀（美國Kent Scientific公司）；彩色多普勒超聲診斷儀（加拿大Visual Sonics公司）；全自動石蠟切片機（德國Leica有限公司）；生物組織包埋機（湖北孝感亞光有限公司）；光學顯微鏡（德國Leica有限公司，型號：DM4000B）；旋轉蒸發儀（上海豫康科教儀器設備有限公司）。

2 實驗方法

2.1 動物模型建立 18只雄性SPF級C57BL/6小鼠適應性喂養1周后，采用隨機數字表法分為對照組、模型組和藥對組，每組6只。模型組和藥對組在小鼠肩胛背部植入含有Ang Ⅱ的膠囊微滲透壓泵，以500 ng/（kg·min）持續釋放Ang Ⅱ，持續28 d［5-9］；對照組在小鼠肩胛背部皮下植入不含Ang Ⅱ的膠囊微滲透壓泵，同期泵入生理鹽水。

2.2 造模成功判定 分別于造模前1天，造模第7、14、21、28天測量血壓，當血壓較造模前1天血壓明顯上升且收縮壓≥140 mm Hg及舒張壓≥90 mm Hg時判定造模成功［10-12］。本實驗造模組造模后第7天血壓已大幅升高，第14天均已進入高血壓狀態。

2.3 天麻鉤藤藥液制備 取天麻10 g、鉤藤10 g加入200 mL蒸餾水中煎煮30 min，過濾并收集藥液，再加入蒸餾水煎煮1次后將2次藥液合并，通過旋轉蒸發儀去除多余水分，將藥液體積濃縮至20 mL，此濃度下1 mL藥液生藥含量視為1 g，濃度為1 g/mL，最后放入高壓鍋中高壓滅菌，分裝凍存于-80 ℃冰箱。使用時取出，在室溫下解凍稀釋后用于灌胃。

2.4 動物分組與給藥 造模第1天開始給藥，根據《藥理實驗方法學》中“人和動物按體表面積折算等效表劑量比率表”計算［13］，以人體劑量20 g/d換算，藥對組根據小鼠體質量變化調整母藥液濃度，以天麻鉤藤生藥量2.6 g/（kg·d）配置天麻鉤藤藥液，每次灌胃0.2 mL，對照組和模型組用等體積的生理鹽水灌胃，每日上午10點灌胃1次，持續4周。

2.5 動物取材 造模第28天后腹腔注射2%異氟烷麻醉小鼠后，去頭處死小鼠，開胸取出心臟組織，置于冰上，剔除大血管及結締組織，去除心房和心尖，只保留心室部分。將心臟組織浸入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋、切片。

2.6 觀察指標

2.6.1 血壓 造模前1天及造模后第7、14、21、28天分別測量1次血壓，使用CODA無創鼠尾血壓計測量小鼠血壓，每次預測試5次血壓，然后正式測量15次血壓。收縮壓、舒張壓、平均動脈壓均取平均值。

2.6.2 動物超聲檢測心臟功能 取材當天用異氟烷麻醉小鼠后，去除胸部毛發，采用彩色多普勒超聲診斷儀觀察3組小鼠心臟超聲影像，并分析左心室舒張末期內徑（LVEDD）、左心室收縮末期內徑（LVESD）、左室舒張末期容積（LVEDV）、左室收縮末期容積（LVESV）、室間隔厚度（IVS）、左室后壁厚度（LVPW）。通過公式計算左心室射血分數（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）。

2.6.3 HE染色法觀察心臟左心室組織的病理學表現 用切片機切取4 μm心臟左心室組織置于載玻片上，放入60 ℃烤箱中烘烤1 h后，進行脫蠟和水化操作，然后用蘇木素染色1 min，鹽酸酒精分化1 s，用伊紅染色5 s，風干后用中性樹膠封片，于光學顯微鏡下拍照觀察。

2.6.4 免疫組化法檢測心臟組織TNF-α、IL-6蛋白表達水平 將心臟組織切片置于60 ℃烤箱中烘烤1 h后，先進行常規脫蠟和水化操作；然后放入100 ℃的抗原修復液中浸泡10 min后，在室溫條件下冷卻，隨后打開免疫組化試劑盒（其中含有過氧化氫酶、封閉液、羊抗小鼠/兔IgG聚合物、鏈霉素等試劑），先滴加過氧化氫酶反應10 min，再用封閉液封閉1 h；然后滴加1抗（抗體稀釋比例TNF-α為1∶100，IL-6為1∶50），并置于4 ℃冰箱孵育過夜；次日滴加羊抗小鼠/兔IgG聚合物反應1 h，滴加鏈霉素反應10 min；然后進行DAB染色，再用蘇木素染核，最后在自來水中返藍，風干并用中性樹膠封片；最后在光學顯微鏡下觀察拍照，每個組織切片拍攝6個400倍光學顯微鏡下的視野，采用ImageJ圖像分析系統進行陽性率分析，蛋白表達水平采用陽性率表示。

3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行數據統計分析。計量資料屬正態分布的以（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，不符合正態分布的采用秩和檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

4 結 果

4.1 3組小鼠血壓比較 造模前3組收縮壓、舒張壓、平均動脈壓比較，差異均無統計學意義（P均＞0.05）；造模第7天開始，模型組、藥對組與對照組比較收縮壓、舒張壓、平均動脈壓明顯升高（P均＜0.05）；造模第28天藥對組與模型組比較，收縮壓、舒張壓、平均動脈壓明顯降低（P均＜0.05）。見圖1。

圖1 3組小鼠不同時間點血壓比較

4.2 3組小鼠LVEF、LVFS比較 與對照組小鼠比較，模型組LVEF、LVFS均降低（P均＜0.05），與模型組比較，藥對組LVEF、LVFS均升高（P均＜0.05）。見圖2。

圖2 3組小鼠超聲心動圖和LVEF、LVFS比較

4.3 3組小鼠心臟左心室組織病理學表現 對照組小鼠左心室心肌無壞死變性；模型組小鼠可見心肌變性和壞死，炎癥細胞浸潤（如圖中箭頭標記位置）；藥對組小鼠較模型組改善明顯，心肌細胞排列未見變性壞死和炎癥細胞浸潤。見圖3。

圖3 3組小鼠左心室組織病理HE染色圖（×400）

4.4 3組小鼠心臟組織TNFα、IL-6蛋白表達水平比較 與對照組比較，模型組心臟組織中TNF α蛋白表達水平升高；與模型組比較，藥對組心臟組織中TNF α蛋白表達水平下降（P＜0.05），見圖4。免疫組化檢測心臟組織中IL-6顯示：與對照組比較，模型組心臟組織中IL-6蛋白表達水平明顯升高；與模型組比較，藥對組心臟組織中IL-6蛋白表達水平下降（P＜0.05），見圖5。蛋白表達水平用陽性率表示。

圖4 3組小鼠TNF-α蛋白表達水平比較圖（×400）

圖5 3組小鼠IL-6蛋白表達水平比較圖（×400）

5 討 論

天麻鉤藤藥對具有平抑肝陽、熄風止痙的功效，是天麻鉤藤飲、清眩降壓湯等方劑的君藥。RAAS系統過度激活可影響血壓水平［14］，AngⅡ具有強烈的血管收縮效應［15］，導致血壓上升。此前已有研究表明天麻素可以舒張椎基底動脈，改善供血不足，具有舒張血管的能力［16］，而鉤藤堿和異構藤堿則可以通過阻滯鈣離子通道的方式舒張血管降低血壓［17］，含有這些單體成分的天麻鉤藤藥對也可能是通過舒張血管發揮降低血壓的作用。

現代醫學研究認為：一方面高血壓病可以誘發心臟炎癥，引起心臟損傷；另一方面由于心血管系統壓力負荷的增加，引起心肌肥厚，導致心室重構［18］，影響心臟的射血功能，心臟LVEF和LVFS指標會降低。高血壓病早期心臟炎癥因子TNF-α和IL-6可明顯增加［19］，高血壓可刺激TNF-α的合成［20］，而TNF-α可引起心肌肥大和細胞凋亡［21］。此外，高血壓還可導致心肌細胞產生IL-6，誘導成纖維細胞增殖以及向肌成纖維細胞轉化，導致心臟損傷從而影響心臟的射血功能［22-23］。本課題成功構建了AngⅡ誘導的高血壓小鼠模型，通過該模型觀察天麻鉤藤藥對的降壓效果以及改善高血壓小鼠心臟損傷和射血功能的作用。研究結果顯示：藥對組小鼠心臟組織中TNF-α和IL-6水平與模型組小鼠比較明顯降低，提示藥對可以減輕高血壓引起的炎癥反應；HE染色結果提示藥對組小鼠心臟損傷明顯減輕，心臟超聲結果提示藥對組LVEF和LVFS相對于模型組明顯升高，提示藥對可以改善高血壓小鼠的心臟射血功能。

綜上所述，天麻鉤藤藥對作為臨床應用廣泛的一種平肝潛陽的中藥配伍，可以使高血壓小鼠的血壓降低，減輕心臟損傷，改善高血壓小鼠心臟射血功能，為臨床實踐應用天麻鉤藤藥對防治高血壓病提供了動物實驗證據。