β-谷甾醇在辣椒疫霉菌生長發(fā)育中的作用研究

李 巖 任穎鴿 賀依琳 車志平 田月娥

（河南科技大學園藝與植物保護學院，河南 洛陽 471000）

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）是世界范圍內農作物、花卉及林木植物上的一種重要的植物病原卵菌。該病菌變異性強，適應性廣，爆發(fā)性強，能給寄主植物造成毀滅性的疫病病害［1-2］。在適宜的環(huán)境條件下，辣椒疫霉菌可以進行無性繁殖，在被侵染植物的表面產生大量孢子囊。孢子囊成熟后易脫落，脫落的孢子囊可以隨雨水或灌溉水移動至新的寄主周圍，也可以在水中釋放出大量游動孢子［1］。游動孢子具有趨化性，能夠定向游動到植物組織周圍［3］。孢子囊也可以和游動孢子一樣直接萌發(fā)形成芽管，芽管刺穿植物角質層，形成附著孢并定殖在寄主植物組織內部。成功侵染的辣椒疫霉菌在寄主體內大量定殖，形成菌絲、孢子囊，完成多次再侵染，最終造成病害的爆發(fā)流行［1］。辣椒疫霉菌屬于異宗配合的植物病原卵菌，除了無性生殖產生的孢子囊或菌絲體能作為初侵染源外，辣椒疫霉菌還可以在適宜的條件下，通過有性生殖產生厚壁的卵孢子。卵孢子抗逆性強，可以在土壤中存活多年。在適宜的條件下，疫霉菌的卵孢子也可以作為初侵染源，萌發(fā)并侵染寄主植物，造成危害［1，4］。另外，疫霉菌在田間自然條件下，能夠通過有性重組使疫霉菌在表型和基因水平上發(fā)生遺傳變異，從而產生致病性更強和適應性更廣的毒性菌株［5］。

植物甾醇是一類在植物中廣泛存在的生物活性物質［6］。β-谷甾醇是一種常見的植物甾醇，廣泛存在于各種植物種子、莖葉和植物油中［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇具有極高的營養(yǎng)價值與較強的生物活性，其在抗氧化、抗炎、抗高血脂、抗腫瘤、免疫調節(jié)等方面表現(xiàn)出良好的藥理作用，已被廣泛應用于醫(yī)藥、食品、保健品等領域［9-10］。茍亞峰等［11］研究發(fā)現(xiàn)，從圓滑番茄枝葉中提取到的β-谷甾醇對引起胡椒瘟病的辣椒疫霉菌（P. capsici）具有較好的抑制作用。當β-谷甾醇濃度為0.6 mg·mL-1時，其 對 胡 椒 瘟 病 菌 的 抑 菌 率 可 達61.78%。這為進一步開發(fā)β-谷甾醇在植物病害防控中的應用價值提供了依據(jù)。

β-谷甾醇屬于四環(huán)三萜類化合物，是真核生物細胞膜的主要組成成分［12］。前人研究表明，疫霉屬卵菌因其基因組缺乏甾醇合成必要的基因，從而自身不能合成甾醇［13］。Jiang等［14］對大豆疫霉、橡樹疫霉和辣椒疫霉的代謝研究發(fā)現(xiàn)，由于缺乏甾醇合成所必需的細胞色素P450家族CYP51基因，疫霉屬卵菌屬于甾醇缺陷型，必須從寄主中獲取甾醇來完成自身的發(fā)育過程。研究證實，疫霉屬病菌可利用外源的甾醇類物質供其生長發(fā)育［15］。然而，外源甾醇對疫霉菌生長發(fā)育的作用仍不清楚［16］。因此，本研究以辣椒疫霉菌模式菌株LT263為供試菌株，以β-谷甾醇為外源甾醇，研究其在不同濃度下對辣椒疫霉菌菌絲生長、菌絲形態(tài)、細胞膜透性、孢子囊形成及卵孢子形成的影響，以期明確β-谷甾醇在辣椒疫霉菌各生長發(fā)育階段中的作用，為開發(fā)由辣椒疫霉菌引致的植物疫病防控新途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株：辣椒疫霉菌模式菌株LT263（A2交配型）由南京農業(yè)大學植物保護學院植物與疫霉互作實驗室惠贈。辣椒疫霉菌A1和A2交配型標準菌株由中國農業(yè)大學植物保護學院惠贈。

培養(yǎng)基：10% V8固體培養(yǎng)基（10% V8汁，0.02% CaCO3，2%瓊脂粉）用于培養(yǎng)辣椒疫霉菌；測試用培養(yǎng)基為不含任何甾醇的基礎培養(yǎng)基，配方參照文獻［15］。

試劑：β-谷甾醇為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；DM2500顯微鏡，Leica Microsystems， 德國；DDS-307雷磁電導率儀，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1β-谷甾醇對辣椒疫霉菌菌絲生長速率作用的測定 采用菌絲生長速率法［17-18］測定β-谷甾醇對辣椒疫霉菌LT263菌絲生長的影響。稱取0.01 gβ-谷甾醇，經丙酮溶解后，配制成濃度為1.0 mg·mL-1的母液。采用倍半稀釋法用無菌蒸餾水再次稀釋。將10% V8固體培養(yǎng)基熔化并冷卻至50 ℃左右，向其中加入1 mL不同濃度的供試化合物，與V8培養(yǎng)基混勻，制成終濃度分別為0.2、1.0、5.0、25.0和125.0 μg·mL-1的含β-谷甾醇10%V8培養(yǎng)基。每個培養(yǎng)皿中加入15 mL 10% V8固體培養(yǎng)基。待其凝固后，在生長旺盛的辣椒疫霉菌LT263菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，將菌絲面貼于培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)皿中央，以加入等體積溶劑的V8培養(yǎng)基作為對照，每個處理3個重復。將培養(yǎng)皿倒置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。采用十字交叉法每24 h測量菌落直徑并拍照。抑菌率的計算公式如下：

1.3.2β-谷甾醇對辣椒疫霉菌菌絲生長量累積作用的測定β-谷甾醇對辣椒疫霉菌菌絲生長量的影響通過稱量菌絲的干重、鮮重進行測定。根據(jù)1.3.1中得到的β-谷甾醇有效抑制中濃度（effective concentration， EC50）值，配制含供試化合物終濃度為EC50的含β-谷甾醇V8液體培養(yǎng)基，從辣椒疫霉菌3 d齡菌株邊緣取5個菌餅（直徑5 mm）接入培養(yǎng)基中，以加等量溶劑作為空白對照。每個三角瓶中接5個菌餅，每個處理3個重復。將三角瓶置于振蕩培養(yǎng)箱（25 ℃，150 r·min-1）中黑暗振蕩培養(yǎng)3 d后，收集菌絲。將每個三角瓶中的菌絲團用150 mL無菌水沖洗3次后，去除菌餅，用布氏漏斗抽濾后，稱量菌絲鮮重，計算鮮重抑制率。然后將菌絲團放入烘箱中，60 ℃烘干4 h，待冷卻后稱量其干重，計算干重抑制率。相關計算公式如下：

1.3.3β-谷甾醇對辣椒疫霉菌細胞膜透性作用的測定 采用電導率法測定β-谷甾醇處理辣椒疫霉菌后菌絲體細胞膜通透性的變化［17，19］。在生長3 d的辣椒疫霉菌LT263菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，接入10% V8液體培養(yǎng)基中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)3 d，收集菌絲。用滅菌蒸餾水沖洗3次后，用布氏漏斗抽干菌絲表面的培養(yǎng)基和水分。根據(jù)1.3.1中得到的β-谷甾醇EC50值，取濃度為10.0 μg·mL-1的β-谷甾醇水溶液20 mL，加入1 g菌絲。以蒸餾水作為對照。于室溫下分別處理30、60、90、120和150 min后，用雷磁電導率儀測量處理后溶液的電導率。150 min后將菌絲體煮沸并冷卻后再測定最終電導率。每個處理3個重復。按公式計算菌絲體的相對電導率（σr）：

式中，σt為某時間的電導率，μS·cm-1；σ0為煮沸后的電導率，μS·cm-1。

1.3.4β-谷甾醇對辣椒疫霉菌孢子囊形成作用的測定 分別配制含0.2、1.0、5.0、25.0和125.0 μg·mL-1β-谷甾醇的10% V8固體培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)皿中加入15 mL上述培養(yǎng)基。用直徑5 mm的打孔器在培養(yǎng)3 d的辣椒疫霉菌LT263菌落邊緣打取菌餅，置于上述培養(yǎng)基中央，以添加等量溶劑作為對照，每個處理3個重復。采用許亞池等［20］的方法，將上述培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱（25 ℃）中先黑暗培養(yǎng)5 d，然后轉至28 ℃光照培養(yǎng)箱中全光照培養(yǎng)5 d，然后在顯微鏡下隨機選取10個視野，統(tǒng)計孢子囊個數(shù)，每個處理3個重復，按照公式計算β-谷甾醇對孢子囊形成的抑制率：

1.3.5β-谷甾醇對辣椒疫霉菌卵孢子形成作用的測定 采用皿內對峙培養(yǎng)的方法進行測定。分別配制含0.2、1.0、5.0、25.0和125.0 μg·mL-1β-谷 甾 醇 的10%V8固體培養(yǎng)基，以加入等量溶劑作為對照，每個培養(yǎng)皿中加入15 mL上述培養(yǎng)基。在培養(yǎng)3 d的兩株標準菌株［辣椒疫霉菌LT263（A2）和A1交配型菌株］菌落邊緣分別打取菌餅。參考Tian等［21］測定交配型的方法，每個培養(yǎng)皿中央放置一個標準菌株LT263和一個標準菌株A1，兩個菌絲塊之間相距2 cm。每個處理3個重復。接好菌的培養(yǎng)皿置于25 ℃黑暗條件下倒置培養(yǎng)10～14 d。待對照培養(yǎng)皿內兩個菌落交界處產生大量卵孢子時停止培養(yǎng)，在顯微鏡下重復隨機選取12個視野，統(tǒng)計卵孢子個數(shù)，參照1.3.4計算卵孢子形成抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，應用Duncan氏新復極差法和Tukey法檢驗各處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 β-谷甾醇對辣椒疫霉菌菌絲生長的影響

由圖1可知，不同濃度β-谷甾醇對辣椒疫霉菌菌絲生長的作用不同。當β-谷甾醇濃度為0.2和1.0 μg·mL-1時，處理后辣椒疫霉菌菌落直徑大于對照菌落直徑，β-谷甾醇對辣椒疫霉菌菌絲生長表現(xiàn)為促進作用；當β-谷甾醇濃度為5.0 μg·mL-1時，對辣椒疫霉菌菌絲生長表現(xiàn)為輕微的抑制作用；當β-谷甾醇濃度增加至25.0 μg·mL-1時，抑制作用顯著增強；當β-谷甾醇濃度為125.0 μg·mL-1時，則完全抑制辣椒疫霉菌菌絲的生長，EC50為10.0 μg·mL-1。

圖1 β-谷甾醇對辣椒疫霉菌菌絲生長的影響Fig.1 Effects of β-sitosterol on mycelium growth of Phytophthora capsici

2.2 β-谷甾醇對辣椒疫霉菌菌絲形態(tài)的影響

顯微觀察發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉菌在不同濃度β-谷甾醇處理后的菌絲形態(tài)存在差異（圖2）。β-谷甾醇濃度為0.2和1.0 μg·mL-1時，菌絲形態(tài)與對照形態(tài)相同，菌絲體粗細均勻，菌絲細而直，分枝間距較大且距離菌絲頂端較遠。隨著β-谷甾醇濃度的增加，辣椒疫霉菌菌絲形態(tài)出現(xiàn)明顯異常。β-谷甾醇濃度為25.0 μg·mL-1處理后的菌絲頂端膨大、分枝增多，菌絲增粗，生長受到限制。表明低濃度β-谷甾醇對辣椒疫霉菌菌絲形態(tài)沒有影響，高濃度β-谷甾醇對辣椒疫霉菌菌絲形態(tài)有致畸作用。

圖2 β-谷甾醇處理對辣椒疫霉菌菌絲形態(tài)的影響Fig.2 Effect of β-sitosterol on mycelium morphology of Phytophthora capsici

2.3 β-谷甾醇對辣椒疫霉菌菌絲生物量累積的影響

用β-谷甾醇處理辣椒疫霉菌3 d后，發(fā)現(xiàn)菌體的菌絲生長受到不同程度的影響（表1）。β-谷甾醇濃度為1.0 μg·mL-1時，其對辣椒疫霉菌菌絲生長表現(xiàn)為促進作用，處理后菌絲的鮮、干重分別為2.100和0.102 g，高于對照的2.000和0.097 g，此時，β-谷甾醇對鮮、干重的抑制率分別為-5.00%和-5.20%。β-谷甾醇濃度為10.0 μg mL-1時，其對辣椒疫霉菌菌絲生長表現(xiàn)為明顯的抑制作用，處理后菌絲的鮮、干重分別為1.151和0.042 g。此時，β-谷甾醇對鮮、干重的抑制率分別為42.50%和56.70%。

表1 β-谷甾醇對辣椒疫霉菌菌絲生物量累積的影響Table 1 Effect of β-sitosterol on accumulation of mycelium of Phytophthora capsici

2.4 β-谷甾醇對辣椒疫霉菌細胞膜透性的影響

為了進一步確定β-谷甾醇對辣椒疫霉菌菌絲體產生的影響，以β-谷甾醇對辣椒疫霉菌菌絲生長的抑制中濃度EC50值為濃度，測定β-谷甾醇處理后辣椒疫霉菌的電導率，計算相對電導率，以此反映處理后辣椒疫霉菌菌絲體細胞膜透性的變化，結果如圖3所示。在測定的150 min內，β-谷甾醇處理后辣椒疫霉菌菌絲體相對電導率隨時間的延長呈現(xiàn)增長趨勢，逐漸趨于穩(wěn)定，且在整個處理時間段內，所有處理組數(shù)據(jù)均高于空白對照組，說明10.0 μg·mL-1β-谷甾醇處理會增大細胞膜通透性，破壞菌體細胞，從而導致細胞內容物外泄，影響菌體生長，達到抑制菌絲生長的效果。

圖3 β-谷甾醇對辣椒疫霉菌菌絲體細胞膜相對電導率的影響Fig.3 Effect of β-sitosterol on the membrane relative permeability of Phytophthora capsici mycelium

2.5 β-谷甾醇對辣椒疫霉菌孢子囊形成的影響

β-谷甾醇對辣椒疫霉菌孢子囊形成的作用與其對菌絲生長的作用一致。由圖4可知，當β-谷甾醇濃度為0.2 μg·mL-1時，處理后辣椒疫霉菌產孢量顯著高于對照；當β-谷甾醇濃度為1.0、5.0和25.0 μg·mL-1時，對辣椒疫霉菌孢子囊的形成表現(xiàn)為顯著的抑制作用，且隨著β-谷甾醇濃度的增大，辣椒疫霉菌孢子囊形成數(shù)量顯著減少。表明β-谷甾醇對辣椒疫霉菌孢子囊形成的作用表現(xiàn)為低濃度促進，高濃度抑制。

圖4 β-谷甾醇對辣椒疫霉菌孢子囊形成的影響Fig.4 Effect of β-sitosterol on sporangium formation of Phytophthora capsici

2.6 β-谷甾醇對辣椒疫霉菌卵孢子形成的影響

在配制的5個β-谷甾醇濃度下，辣椒疫霉菌經0.2 μg·mL-1β-谷甾醇處理后，視野中觀察到的辣椒疫霉菌卵孢子平均數(shù)量為56個，對照組為47個，處理組高于對照組；濃度為1.0、5.0和25.0 μg·mL-1的β-谷甾醇對辣椒疫霉菌卵孢子的形成有明顯的抑制作用，且隨著β-谷甾醇濃度的升高，辣椒疫霉菌產生的卵孢子數(shù)減少，平均數(shù)量依次為27、21和12個，較對照組明顯減少（圖5）。綜上，低濃度β-谷甾醇對辣椒疫霉菌卵孢子形成有促進作用，高濃度β-谷甾醇對辣椒疫霉菌卵孢子形成有抑制作用。

圖5 β-谷甾醇對辣椒疫霉菌卵孢子形成的影響Fig.5 Effect of β-sitosterol on oospore formation of Phytophthora capsici

3 討論

β-谷甾醇是最常見，也是大多數(shù)植物中含量最豐富的甾醇類物質。β-谷甾醇不僅在人體和動物中具有重要的生理功能，還是疫霉屬和腐霉屬植物病原卵菌進行正常生長發(fā)育所需的重要外源甾醇［13-14］。前人研究表明，腐霉屬和疫霉屬卵菌在甾醇缺乏的培養(yǎng)基上傾向于營養(yǎng)生長。然而，在培養(yǎng)基中添加甾醇類物質，不僅能夠促進營養(yǎng)生長，還能促進雌器、雄器的發(fā)育及卵孢子的形成［21-22］。Elliott等［22］研究了幾種甾醇及相關物質對惡疫霉（Phytophthora cactorum）有性繁殖的促進作用，發(fā)現(xiàn)供檢測的物質中只有29-異巖藻甾苷和β-谷甾醇對促進惡疫霉產生卵孢子的效果最好。本研究測定不同濃度梯度β-谷甾醇對辣椒疫霉菌生長發(fā)育的結果表明，β-谷甾醇對辣椒疫霉菌生長發(fā)育具有重要影響，具體表現(xiàn)為低濃度促進，高濃度抑制。當β-谷甾醇濃度為0.2 μg·mL-1時，對辣椒疫霉菌菌絲生長促進的幅度達到4.5%；當β-谷甾醇濃度高于5.0 μg·mL-1時，其對辣椒疫霉菌的菌絲生長及孢子囊和卵孢子形成表現(xiàn)出抑制作用，且隨著β-谷甾醇濃度的升高，其抑制作用隨之增強。

本研究中，當β-谷甾醇濃度為0.2和1.0 μg·mL-1時，其對辣椒疫霉菌生長發(fā)育的促進作用與前人對致病疫霉（P. infestans）［22］、大豆疫霉（P. sojae）［23］和惡疫霉（P. cactorum）［24］的研究結果一致。Elliott等［22］研究發(fā)現(xiàn)，疫霉屬病菌在添加了β-谷甾醇的V8培養(yǎng)基中產生的卵孢子數(shù)量比不添加甾醇的相同培養(yǎng)基更多。Medina等［23］比較了在不同培養(yǎng)基中添加或不添加β-谷甾醇對疫霉菌菌絲生長以及孢子囊和卵孢子產生的影響，發(fā)現(xiàn)含有β-谷甾醇的V8培養(yǎng)基不僅對致病疫霉的菌絲生長具有很好的促進作用，而且經β-谷甾醇處理后，致病疫霉菌株產生的孢子囊和卵孢子數(shù)量顯著高于對照黑麥瓊脂（rye-agar， RA）培養(yǎng)基。Marshall等［24］研究發(fā)現(xiàn)，谷甾醇能促進大豆疫霉菌的營養(yǎng)生長和有性繁殖，其促進作用類似于對惡疫霉菌的生理作用［13］。以上研究均證實了β-谷甾醇在疫霉屬卵菌生長發(fā)育中的重要性，本研究結果進一步證實，β-谷甾醇對辣椒疫霉菌生長發(fā)育產生的影響與其濃度密切相關。

辣椒疫霉菌的繁殖方式包括無性繁殖和有性生殖。孢子囊和游動孢子是辣椒疫霉菌進行無性繁殖的主要形式，其數(shù)量和產生速度是影響辣椒疫病流行的關鍵［25］。本研究結果表明，當β-谷甾醇濃度高于5.0 μg·mL-1時，隨著濃度的升高，辣椒疫霉菌孢子囊形成的數(shù)量呈下降趨勢；當濃度增至10.0 μg·mL-1時，與對照相比，其對孢子囊形成的抑制率可達70.0%。卵孢子是辣椒疫霉菌有性生殖的產物，不僅可以作為初侵染源直接萌發(fā)侵染寄主，而且在有性生殖過程中的遺傳重組加大了病菌的變異性和致病性［4］。本研究結果表明，β-谷甾醇對辣椒疫霉菌卵孢子形成的抑制作用同其對孢子囊形成的抑制作用趨勢一致。當濃度為10.0 μg·mL-1時，與對照相比，其對辣椒疫霉菌卵孢子形成數(shù)量的抑制率可達55.3%。可見，在一定濃度下，β-谷甾醇是有效的辣椒疫霉菌生長發(fā)育抑制物質，在病菌生長發(fā)育的不同階段均可產生很好的抑制效果，減緩病菌的再侵染及病害的發(fā)展蔓延。

微生物細胞膜是微生物的一種半透性保護屏障，也是多種殺菌劑的作用位點［27］。當受到外界環(huán)境或物質破壞時，會導致細胞膜流動性及半透性喪失，細胞內的電解質大量滲漏，胞內滲透壓失衡，致使溶液中的電導率上升，最終使得細胞生理功能降低，細胞趨于死亡［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，10.0 μg·mL-1β-谷甾醇對菌絲生長有較強的抑制作用。經該濃度的β-谷甾醇處理后，辣椒疫霉菌菌絲溶液的電導率升高，表明辣椒疫霉菌細胞膜通透性增加。這可能是因為該濃度的β-谷甾醇使得辣椒疫霉菌中的電解質大量泄漏，使得細胞內滲透壓不平衡，最終導致辣椒疫霉菌細胞死亡。該結果與山蒼子精油對辣椒疫霉菌細胞膜通透性作用的研究結果類似，均具有破壞作用［27］。這為β-谷甾醇應用于由辣椒疫霉菌引致的植物疫病提供了思路。

植物甾醇是穩(wěn)定植物細胞膜磷脂雙分子層的必需類固醇分子，也是疫霉屬和腐霉屬卵菌缺乏甾醇合成必要基因的真核生物生命周期中的必需物質［28］。天然來源的植物甾醇安全性非常高，其在有效劑量內就能夠降低人和動物的膽固醇，且對人和動物均無毒副作用［29］，但不同植物β-谷甾醇的含量不同［7，30］。因此，在植物疫霉病害防控中可以利用現(xiàn)代生物技術，提高植物甾醇，特別是β-谷甾醇的表達量，以此控制疫霉屬植物病原卵菌引發(fā)的植物疫霉病害，為病害防控提供新途徑。

4 結論

本研究通過外源添加的方式，研究了不同濃度下β-谷甾醇對辣椒疫霉菌菌絲形態(tài)及菌絲生長、菌絲生物量累積、細胞膜透性、孢子囊形成及卵孢子形成的影響，明確了β-谷甾醇在辣椒疫霉菌生長發(fā)育各階段中的作用。結果表明，不同濃度β-谷甾醇對辣椒疫霉菌的生長發(fā)育作用不同，具體表現(xiàn)為低濃度促進，高濃度抑制。高濃度β-谷甾醇抑制辣椒疫霉菌菌絲的生長，對菌絲形態(tài)有致畸作用；同時，可增大辣椒疫霉菌細胞膜透性，破壞菌絲體；抑制辣椒疫霉菌孢子囊的形成和游動孢子的釋放；影響辣椒疫霉菌有性生殖，導致卵孢子形成數(shù)量顯著減少。