粗毛纖孔菌產胞外黑色素發酵條件優化及其抗氧化活性研究

李曉敏 袁 源 薛帆正 吳小平 傅俊生 ，

（1福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002； 2福建農林大學菌物研究中心，福建 福州 350002）

粗毛纖孔菌［Inonotus hispidus（Bull.） P. Karst.］是一種名貴的藥用真菌，收錄于中國藥用真菌名錄，別名粗毛黃褐孔菌，隸屬于擔子菌門傘菌綱繡革孔菌目繡革孔菌科纖孔菌屬［1-2］。粗毛纖孔菌作為傳統中藥“桑黃”，具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、保肝、增強免疫力等藥理價值［3-5］。在現代藥理學上，粗毛纖孔菌的藥用成分也逐漸被挖掘，如多糖、多酚、黃酮、萜類等活性物質［6-8］。黑色素也是粗毛纖孔菌的活性成分之一，但關于粗毛纖孔菌黑色素的相關研究鮮有報道。

黑色素是一類分布極其廣泛的天然生物色素，是一種由酚類或吲哚氧化聚合形成的大分子［9］。黑色素具有良好的抗氧化［10］、抗腫瘤［11-12］、抗輻射、抗病毒、抑菌、自由基清除能力［13-14］、保肝［15］等生物活性，可廣泛應用于農業、工業、醫藥等領域（如農藥光保護劑［16］、生物吸附劑［17］、天然藥物［18］等）。有研究表明，粒毛盤菌（LachnumYM226）黑色素及其衍生物對H22荷瘤小鼠具有抗腫瘤活性［12］；在食品加工方面，黑色素可作為一種天然著色劑、抗氧化劑、抑菌劑，應用于食品添加劑中起到調色、抗氧化等作用［19］；在工業上，因黑色素具有較強的抗氧化性、光保護性，可應用于防曬霜、抗衰老等產品開發，如斯氏假單胞菌產生的黑色素可以提高防曬霜的防曬系數［20］；在醫學領域，索拉菲尼（肝癌化療藥物）與黑色素結合構建水溶性的納米藥物遞送的載體可用于小鼠腫瘤的治療［21］。

許多大型真菌都含有黑色素，這使得真菌成為獲取黑色素的重要來源。目前研究較多的有短梗霉屬、木耳屬、粒盤菌屬、層孔菌屬等來源的黑色素［22］。液體發酵培養有利于快速制備發酵產物，易于產業化。在發酵培養過程中，發酵菌種、培養基配方以及培養條件等因素發揮著重要的作用［23］。培養基可以為微生物提供生長過程中所必需的營養要素，如碳源和氮源等，而發酵培養溫度、轉速等培養條件則會對微生物的生長速度和代謝物的合成產生影響［23］。目前國內外對粗毛纖孔菌產黑色素的液體深層發酵工藝研究的報道較少。本研究通過單因素試驗結合正交試驗優化粗毛纖孔菌的液體發酵培養基配方及發酵條件，以期從發酵液中獲得大量的胞外黑色素，并對其抗氧化活性進行評價，為粗毛纖孔菌黑色素高效生產及天然黑色素的開發應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粗毛纖孔菌菌株：MS-5，由福建農林大學菌物研究中心從寧夏中衛市野生棗樹上生長的粗毛纖孔菌子實體分離獲得（NCBI登錄號：MF183947）。透析袋MD44（截留分子量為8 000～14 000 D）購于北京索萊寶科技有限公司。

試劑：葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、果糖、木糖、蔗糖、玉米粉、淀粉、乳糖、胰蛋白胨、酵母提取粉、牛肉浸膏、硝酸鉀、硝酸銨、酒石酸銨、脲、硫酸鎂、維生素B1（vitamin B1，VB1）、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、水楊酸、30%過氧化氫溶液（H2O2）、硫酸亞鐵溶液（FeSO4）等購自國藥集團化學試劑有限公司。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl， DPPH）、2，2’-聯氮-雙（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽［2，2’-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate） diammonium salt， ABTS］等購自北京索萊寶科技有限公司。

PDB加富培養基：200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、5 g胰蛋白胨、2 g硫酸鎂、1.5 g磷酸二氫鉀、10 mg VB1、1 L水，pH自然。

1.2 主要儀器與設備

VS-1300-U超凈工作臺，安泰空氣技術有限公司；LDZF-50L立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械有限公司；SPX-250B-Z恒溫培養箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；EG720KG3-NR1微波爐，美的微波爐電器制造有限公司；UV-5200紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；Thermo Scientific Nicolet 10紅外光譜儀，武漢德盟科技有限公司；Varioskan Flash多功能酶標儀，美國Thermo公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 粗毛纖孔菌發酵液黑色素（IHEM）產量的測定 參照羅青等［24］的方法，并稍作修改。將粗毛纖孔菌發酵液過濾收集濾液，使用濃度為6 mol·L-1的HCl將濾液pH值調節至1.5～2.0，置于4 ℃靜止過夜。次日，將酸化過的發酵液于10 000 r·min-1離心10 min后棄上清，并使用去離子水將沉淀重復洗滌至pH呈中性，隨后離心收集沉淀。將沉淀冷凍干燥即獲得粗毛纖孔菌發酵 液 黑色素（extracellular melanin ofInonotus hispidus，IHEM）粗品，并稱重測其IHEM含量。沉淀依次采用有機試劑氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、無水乙醇、75%乙醇和蒸餾水沖洗，于10 000 r·min-1離心5 min，去上清。將 沉 淀先 用0.1 mol·L-1NaOH復溶，再用0.1 mol·L-1HCl將溶液pH調節至中性，流水透析48 h，將其冷凍干燥獲得IHEM純品，用于檢測IHEM的光譜特征及化學抗氧化試驗。后續單因素試驗及正交試驗均以未除雜的IHEM粗品含量作為評價指標（即IHEM含量）。

1.3.2 初始培養基及發酵條件 初始培養基為PDB加富培養基，初始發酵條件為接種7片直徑為0.7 cm的粗毛纖孔菌于裝有100 mL培養基的250 mL三角瓶中，每組試驗設定3個生物學重復，并將三角瓶置于25 ℃、160 r·min-1搖床中發酵培養10 d，培養結束后收集粗毛纖孔菌發酵液，并按照1.3.1的方法對其黑色素進行提取。

1.3.3 單因素試驗 （1）碳源篩選試驗：以PDB加富培養基作為基礎培養基，碳源分別替換為甘露醇、玉米粉、蔗糖、果糖、淀粉、乳糖、木糖、葡萄糖和麥芽糖，以不添加碳源為對照組，氮源為胰蛋白胨，pH自然（pH值5.7），置于25 ℃、160 r·min-1的搖床中黑暗培養10 d，測定IHEM含量。

（2）氮源篩選試驗：以上述篩選的碳源培養基為基礎，氮源分別替換為酵母提取粉、胰蛋白胨、牛肉浸膏、硝酸鉀、硝酸銨、酒石酸銨和脲，以不添加氮源為對照組，碳氮比為4∶1，pH自然（pH值5.7），置于25 ℃、160 r·min-1的搖床中黑暗培養10 d，測定IHEM含量。

（3）碳氮比試驗：以上述篩選的碳源、氮源為條件，碳氮比分別設定為4∶1、5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1和80∶1，以碳氮比4∶1為對照組，置于25 ℃、160 r·min-1的搖床中黑暗培養10 d，測定IHEM含量。

（4）維生素篩選試驗：以上述篩選的碳源、氮源、碳氮比為條件，維生素分別替換為VB1、葉酸（vitamin B9，VB9）、生物素（vitamin H，VH）、維生素B6（vitamin B6，VB6）、核 黃 素（riboflavin∕vitamin B2，VB2）、抗壞 血酸（vitamin C，VC）、尼克酸（nicotinic acid，Vpp），以不添加維生素為對照組，置于25 ℃、160 r·min-1的搖床中黑暗培養10 d，測定IHEM含量。

（5）pH值篩選試驗：以上述篩選的碳源、氮源、碳氮比和維生素為條件，設定培養基pH值依次為5、5.5、6、6.5、7、7.5和8，以初始pH自然為對照組（pH值5.7），置于25 ℃、160 r·min-1的搖床中黑暗培養10 d，測定IHEM含量。

（6）搖床轉速篩選試驗：以上述篩選的碳源、氮源、碳氮比、維生素、pH值為條件，以轉速160 r·min-1為對照組，將粗毛纖孔菌分別置于25 ℃，120、140、160、180和200 r·min-1的搖床中黑暗培養10 d，測定IHEM含量。

（7）溫度篩選試驗：基于上述配方繼續優化，將粗毛纖孔菌分別置于24、25、26、27和28 ℃的搖床中，以培養溫度25 ℃作為對照組，在160 r·min-1條件下黑暗培養10 d，測定IHEM含量。

1.3.4 正交試驗 基于單因素試驗結果，以IHEM含量為評價指標，對碳源、氮源、pH值和轉速進行正交優化，每個分組設定3個重復，詳見表1。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.3.5 IHEM紫外全吸收光譜檢測 稱取1 mg IHEM，溶解于濃度為0.1 mol·L-1的NaOH溶液中，50～60 ℃水浴加熱并充分混勻，30 min后黑色素完全溶解，于3 000 r·min-1條件下離心10 min，將上清液置于200～700 nm波長范圍內測定紫外全吸收光譜［25］。

1.3.6 IHEM紅外光譜檢測 參考李琦等［26］的方法，采用溴化鉀壓片法，在模具中加入1～2 mg純化后的IHEM粉末和200 mg KBr純品粉末，使用油壓機將其壓成透明薄片，在波數范圍4 000～400 cm-1、掃描次數32、分辨率4 cm-1參數下測定其紅外吸收光譜。

1.4 IHEM化學抗氧化活性測定

1.4.1 DPPH自由基清除率測定 參照Ai等［27］的方法并稍作修改。在96孔板中依次滴加100 μL不同濃度的可溶性IHEM溶液（0.012 5、0.025、0.05、0.25、0.5、1、2、5 mg·mL-1）和120 μmol·L-1DPPH溶液，室溫黑暗反應30 min，在波長517 nm處測定吸光度值，記為AX。分 別 以100 μL無水乙醇 代 替IHEM溶液 和DPPH溶液，測定波長517 nm下的吸光度值，記作A0和AX0。同時，以VC作為陽性對照組，采用同樣的方法測定其DPPH清除率。試驗設定3個重復，取平均值。清除率計算公式如下：

1.4.2 ABTS自由基清除率測定 參照王榮等［28］的方法并稍作修改。將7.0 mmol·L-1ABTS溶液與2.45 mmol·L-1過硫酸鉀水溶液充分混勻，25 ℃黑暗保存12～16 h，獲得ABTS+母液。用去離子水將ABTS+母液稀釋至734 nm處吸光值為（0.70±0.02），30 ℃水浴30 min獲得ABTS+工作液。在96孔板中分別滴加100 μL不同濃度的可溶性IHEM溶液（0.012 5、0.025、0.05、0.25、0.5、1 mg·mL-1）和ABTS+工作液，將其混勻后25 ℃避光反應20 min，在734 nm波長處測定其吸光度值，記為AX。分別以100 μL去離子水代替IHEM溶液和ABTS+工作液，測定734 nm波長下的吸光度值，記為A0和AX0。采用同樣的方法對VC的ABTS清除率進行測定并作為對照組。試驗設定3個重復，取平均值，清除率計算同公式（1）。

1.4.3 羥基自由基清除率測定 參照白生文等［29］的方法并稍作修改。在96孔板中依次加入9 mmol·L-1的水楊酸-乙醇溶液、9 mmol·L-1的FeSO4溶液、不同濃度（0.012 5、0.025、0.05、0.25、0.5、1、2、5 mg·mL-1）的可溶性IHFM溶液和8.8 mmol·L-1的H2O2溶液各15 μL，最后加入165 μL去離子水，混合均勻并置于37 ℃恒溫水溶鍋中水浴15 min，測定510 nm波長下的吸光度值，記為AX。以15 μL去離子水替代樣品溶液和H2O2測定吸光度，測定510 nm波長下的吸光度值，記為A0和AX0。試驗設定3個重復，取平均值，清除率計算同公式（1）。

1.5 數據分析

用SPSS 25.0統計軟件對試驗數據進行分析。數據表示為平均值±標準差。采用t檢驗進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 主要營養要素篩選結果

由圖1-A可知，相比未添加碳源的對照組，添加甘露醇、玉米粉可以極顯著提高發酵液中黑色素的含量（P<0.01），添加蔗糖和果糖也顯著提高了發酵液中黑色素的含量（P<0.05），其中甘露醇促進效果最好。因此選擇甘露醇作為碳源繼續進行優化試驗。

由圖1-B可知，相比未添加氮源的對照組，酵母提取粉極顯著促進了粗毛纖孔菌發酵液產黑色素，胰蛋白胨次之，牛肉浸膏第三。硝酸銨、酒石酸銨等無機氮源添加處理的IHEM含量與對照無顯著差異。綜上所述，酵母提取粉為最適氮源。

以PDB加富培養基中的碳氮比4∶1作為對照組。由圖1-C可知，發酵液中黑色素的含量隨著碳氮比的增加而減少，當碳氮比為4∶1（即甘露醇20 g，酵母提取粉5 g）時，IHEM的含量最高，因此選擇碳氮比4∶1繼續進行優化試驗。

圖1 碳源、氮源及碳氮比對IHEM含量的影響Fig.1 Effects of carbon source， nitrogen source and carbon nitrogen ratio on IHEM content

2.2 生長因子篩選結果

由圖2可知，相比未添加維生素的對照組，添加VB1的發酵液顏色深于對照組的發酵液，且VB1極顯著提高了IHEM含量，而其他維生素均顯著或極顯著降低了IHEM含量。因此，粗毛纖孔菌發酵培養基的最適維生素為VB1。

圖2 維生素對IHEM含量的影響Fig.2 Effect of vitamin on IHFM content

2.3 培養條件篩選結果

由圖3-A可知，初始pH自然條件下的IHEM含量最高，調節培養基的pH會不同程度地降低發酵液中IHEM的含量，其中pH自然條件下發酵液顏色最深，故而選擇pH自然繼續進行優化試驗。

由圖3-B可知，發酵液中IHEM的含量在轉速為160 r·min-1時最高，而后隨 著轉速 升 高，發 酵液中IHEM的含量降低，故選擇160 r·min-1繼續進行優化試驗。

由圖3-C可知，發酵液中IHEM的含量隨著溫度升高呈先升高后降低的趨勢，在溫度為25 ℃時最高，故選擇25 ℃繼續進行優化試驗。

圖3 不同培養條件對IHEM含量的影響Fig.3 Effects of different culture conditions on IHEM content

2.4 正交試驗結果

基于單因素試驗結果，選擇碳源、氮源、pH值、轉速較佳的前三種方案開展三水平四因素的正交優化試驗，以IHEM含量為指標，探究促進粗毛纖孔菌高產黑色素的最優培養條件。

通過對正交試驗結果進行直觀分析（表2），發現在4個單因素的各均值中，碳源為甘露醇的均值最大，氮源為牛肉浸膏的均值最大，pH值為6的均值最大，轉速為180 r·min-1的均值最大。在此條件下，第3個優化組合的IHEM含量最高，達到3.29 g·L-1。如圖4所示，觀察比較各組合發酵液的顏色，同樣發現第3個優化組合的發酵液顏色最黑，由此表明粗毛纖孔菌在該配方下可獲得較高含量的IHEM。通過對極差（R）進行比較分析，發現4個因素的極差由大到小依次為轉速>碳源>氮源>pH值，說明轉速是影響IHEM含量的主要因素。方差分析結果表明（表3），4個因素的F值從大到小依次為轉速>碳源>氮源>pH值，與直觀分析結果一致。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

圖4 正交試驗中各種配方對應的粗毛纖孔菌發酵液Fig.4 The fermentation broth of Inonotus hispidus corresponding to each recipe in the orthogonal test

表2 IHEM含量正交試驗結果直觀分析Table 2 Intuitionistic analysis of IHEM content by orthogonal test

2.5 IHEM紫外全吸收光譜和紅外光譜分析

紫外全吸收光譜和紅外光譜是鑒定黑色素基本特征的重要途徑［30］。如圖5-A所示，IHEM在紫外光區210 nm波長處具有最大吸收峰，其吸光值向可見光區逐漸下降，該特征符合黑色素的吸收特征［31］。在260 nm及280 nm處無吸收峰，表明IHEM純品無核酸和蛋白質，提取的IHEM純品相對較純。如圖5-B所示，IHEM在波數3 430.887 cm-1處具有較強且寬的特征吸收，與吲哚環內-OH基團連接的-NH基團相對應，寬而強的吸收峰可能與-NH、-OH中形成了氫鍵有關［31］。2 923.679 cm-1對應脂肪族-CH，1 637.337 cm-1對應C=O拉伸或芳香C=C拉伸［32］。1 540.910 cm-1的峰值與-NH彎曲振動有關，1 438.697 cm-1左右的峰值則與-CN拉伸峰有關，說明其具有典型的黑色素吲哚結構［32］。632.564 cm-1處吸收帶較弱，說明芳香環已被取代形成共軛體系［33］。以上結果表明，通過提取純化獲得的IHEM符合傳統黑色素的結構特征。

圖5 IHEM光譜特性分析Fig.5 Spectral properties analysis of IHEM

2.6 IHEM體外抗氧化活性分析

在明確IHEM為黑色素后，研究其抗氧化活性。VC是一種強抗氧化劑，能有效抵御自由基對人體的傷害，降低脂質過氧化等作用。由圖6可知，IHEM對ABTS自由基的清除效果最好，其次是清除DPPH自由基的能力，清除羥基自由基的效果較弱，其半最大效應濃度（concentration for 50% of maximal effect， EC50）依 次 為0.019、0.170和1.932 mg·mL-1。當IHEM濃度為0.25 mg·mL-1時，其對ABTS自由基的清除效果與VC無顯著差異，表明可溶性IHEM具有良好的體外抗氧化活性。

圖6 IHEM的抗氧化活性Fig.6 The antioxidant activity of IHEM

3 討論

在活性物質研究中，研究較多的是來源于子實體活性物質的生物學活性。藥用真菌發酵液中含有豐富的代謝產物，結構多樣，且發酵液比子實體更易獲取，周期更短，是活性物質的重要來源之一［34］。黑色素作為粗毛纖孔菌的活性成分之一，存在于子實體和發酵液中，但對于液體發酵黑色素的研究鮮有報道。液體發酵在微生物工業生產中發揮著重要作用，通過優化培養基配方來提高黑色素的生物產量，可以為黑色素在工業、農業、食品、醫藥等領域的開發利用奠定基礎。

本研究單因素試驗結果表明，甘露醇作為碳源可顯著提高IHEM含量，這與其具有調節滲透壓、抗逆性等活性相關［35］。甘露醇可通過調節粗毛纖孔菌的滲透壓來促進粗毛纖孔菌的代謝，進而提高IHEM的含量。氮源可分為有機氮源和無機氮源。本試驗發現，酵母提取粉、胰蛋白胨和牛肉浸膏等有機氮源均能顯著提高IHEM含量，但硝酸鉀、硝酸銨、酒石酸銨、脲等無機氮源未顯著提高IHEM含量，表明有機氮能為IHEM的產生提供優質的有機營養；當脲為氮源時，粗毛纖孔菌幾乎不產黑色素，可能是因為脲作為一元堿影響了培養基的pH值，從而不利于粗毛纖孔菌的正常生長。IHEM含量隨著碳氮比的增加而逐漸減少，當碳氮比為4∶1時，IHEM含量最高，可能與氮源及粗毛纖孔菌黑色素合成途徑相關。維生素作為一種生長因子［36］，不同維生素可能具有不同作用，本研究發現，添加VB1可顯著提高IHEM含量，而其他維生素對IHEM產生有一定的抑制作用，這可能是因為VB1能促進菌體的生長，從而促進黑色素的生成，這與唐少軍等［7］的研究結果相似。同時，培養條件也會影響微生物的生長情況和代謝產物的合成［26］。本研究結果表明，培養基pH值為5.5、5.7（自然）和6時的IHEM含量均較高，推測粗毛纖孔菌在弱酸性條件下更易產生黑色素，而強酸或強堿條件可能會影響菌絲的細胞膜透性；搖床轉速亦會影響IHEM含量，隨著培養轉速的增加，IHEM含量呈先增后減的趨勢，轉速為140、160、180 r·min-1時的IHEM含量較高，表明適當加快轉速有利于增加發酵液中的溶解氧含量，以促進黑色素的產生，但轉速過大會對菌絲體造成機械損傷，不利于菌絲體的生長及黑色素的產生，轉速過低可能會導致發酵液中的溶解氧含量不足以供給粗毛纖孔菌生長所需；粗毛纖孔菌在25 ℃時的IHEM含量最高，可能是由于溫度過高會影響真菌細胞內的酶活力及粗毛纖孔菌的生長與代謝。

通過測定IHEM清除自由基的能力，發現IHEM具有良好的抗氧化活性，這與袁源等［37］報道的黑木耳黑色素具有良好抗氧化性的結果基本一致。表明IHEM可以作為新型抗氧化劑應用在食品、化妝品等領域。本研究為粗毛纖孔菌黑色素的開發及應用提供了新思路。

4 結論

本研究通過單因素試驗探索了碳源、氮源、碳氮比、溫度等因素對粗毛纖孔菌產胞外黑色素的影響，在此基礎上以正交試驗優化了發酵培養基和發酵條件。結果表明，粗毛纖孔菌高產胞外黑色素的最佳培養基配方為甘露醇20 g·L-1、牛肉浸膏5 g·L-1、碳氮比4∶1、維生素B110 mg·L-1，最優發酵條件為初始pH值6、轉速180 r·min-1以及發酵溫度25 ℃，在此培養條件下，IHEM含量高達3.29 g·L-1，較優化前提高了17.32倍，表明該培養配方可作為大量生產IHEM的有效配方。以紫外全吸收光譜和紅外光譜對胞外黑色素進行鑒定，光譜特征符合黑色素的吸收特征。黑色素抗氧化試驗結果表明，黑色素具有良好的抗氧化活性。