接觸輝光放電等離子體對Fusarium solani的殺菌作用機制及動力學模型研究

萬強貴 王 婷 田立鵬 李春愛 蔡 夢 蒲陸梅

（甘肅農業大學理學院，甘肅 蘭州 730070）

茄病鐮刀菌（Fusarium solani）是一種自然界中分布廣泛的真菌類群，其抗逆性強，寄主生存方式多樣，是一些重要農業植物的宿主特異性病原體。相關研究表明，Fusarium solani能引起黃瓜冠腐病、牡丹根腐病以及豆科和瓜類植物根莖腐爛病等［1-3］，這些病害嚴重影響了我國的農業生產，造成了巨大的經濟損失。此外，在免疫力低下或免疫力障礙的患者中，Fusarium solani還可引發侵襲性真菌病，嚴重時可造成生命體死亡［4］。

目前，關于控制Fusarium solani病害的方法，主要包括物理、化學、生物防治等。物理和化學防治是采用各種試劑或紫外線輻射處理等，殺菌效果好，使用方便，但長期使用不僅會增強病原菌抗藥性，而且會造成嚴重的環境污染［5-7］，危害人體健康。生物防治是利用一些具有拮抗作用的菌種進行防控，如木霉屬［8］、菌種提取物［9］等，但它們對溫度、濕度等環境因素要求較高［10］。因此，尋找一種安全高效、無污染、易實行的處理方法至關重要。

接觸輝光放電等離子體（contact glow discharge plasma，CGDP）作為一種新興的高級氧化技術，在材料合成［11］、廢水處理［12］、生物醫藥［13］等方面取得了廣泛的應用。研究也表明，CGDP產生的高能活性粒子對細菌、真菌和病毒等具有較高的清除率［14］。此外，CGDP還具有操作簡單、反應條件溫和等特點，其生成的強氧化性物質·OH和H2O2等，特別適用于食品中毒素的降解以及微生物的滅活［15］，且無二次污染物的生成，是一種更安全、更高效、更環保的技術方法。

本研究以Fusarium solani作為目標菌株，通過CGDP處理，研究電壓強度、孢子初始濃度、抗壞血酸濃度對殺菌效果的影響，通過菌落生長情況、細胞膜完整性、孢子形態、活性粒子（·OH、H2O2、NO3-）濃度、pH值等指標分析CGDP的殺菌機制；采用Linear、Weibull和Log-Logistic 3種數學模型分析不同電壓下輝光放電等離子體殺菌動力學特性，旨在篩選最適合描述低溫等離子體殺菌過程的動力學模型，為低溫等離子體殺菌技術的發展提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Fusarium solani菌株由甘肅農業大學理學院實驗室提供（從當歸中分離）。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）、孟加拉紅瓊脂（rose bengal agar，RBA），青島高科技工業園海博生物技術有限公司；無水硫酸鈉，分析純，上海中泰化學試劑有限公司；甲基紫，分析純，上海中泰化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

接觸輝光放電等離子體發生器（自制，圖1）；LDZX-50KBS型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；HPX-150恒溫恒濕培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；DH1722A-6型直流穩壓穩流電源，北京大華無線電儀器廠；CX221 FS1C型生物顯微鏡，奧林巴斯（廣州）工業有限公司；JSM-6360LV掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；PHS-3C酸度計，上海平軒科學儀器有限公司；TU-1901紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

圖1 試驗裝置Fig.1 Experimental setup

1.3 試驗方法

1.3.1 CGDP的產生及·OH、H2O2、NO3-濃度和pH值的測定 如圖1所示，CGDP發生及反應系統由反應器和高壓直流電源兩部分組成。反應器中的陽極為直徑0.5 mm的鉑電極，陰極為直徑1 cm的碳棒電極。反應器外設循環水浴控制溫度。調節電壓至鉑電極發生穩定輝光放電而使水分子活化并產生等離子體。為防止樣品中其他因素的干擾，本試驗采用無菌水代替樣品，以檢測CGDP處理過程中活性粒子濃度的變化。540 V電壓下，取一定體積的無菌水，其他條件相同，進行放電處理，每隔5 min取樣，共30 min，平行3次。溶液中NO3-濃度采用二磺酸酚分光光度法進行測定［16］；·OH的測定參考杜明遠等［17］的方法，以甲基紫為捕獲劑；H2O2測定使用南京建成過氧化氫（H2O2）試劑盒。

1.3.2 菌株活化和孢子懸浮液的制備 取培養7 d的Fusarium solani一皿，加入10 mL無菌水（含有0.01 mL吐溫80），使用無菌三角涂布器刮下菌落，四層無菌紗布過濾，所得溶液即為孢子懸浮液。吸取1 μL孢子懸浮液至血球計數板，置于顯微鏡下計數，無菌水稀釋調節孢子濃度至2 × 106CFU·mL-1。

1.3.3 CGDP對殺菌效果的影響 為了研究電壓、處理時間、孢子初始濃度和抗壞血酸濃度對等離子體殺菌效果的影響。取50 mL無菌水，通過調節電源電壓從0 V增加到650 V，測定電流隨電壓的變化曲線，確定CGDP產生的電壓范圍；取50 mL濃度為2×106CFU·mL-1的孢子懸浮液在不同電壓（500、520、540、560、580 V）下用CGDP處理；取50 mL不同初始濃度（4×105、2×106、3×106、4×106CFU·mL-1）和含有不同濃度抗壞血酸（5、10、20 mmol·L-1）的孢子懸浮液，分別在540 V下用CGDP處理。所有樣品每隔5 min取樣，共30 min，平行3次，將取好的樣品于25 ℃恒溫培養3 d，采用平板計數法進行菌落總數的計數。等離子體對Fusarium solani的殺菌效果用孢子減少量表示。孢子減少量為處理樣品和未處理樣品菌落計數的對數之差，見公式（1）。

式中，N：處理后樣品的菌落數，CFU·mL-1；N0：處理前樣品的菌落數，CFU·mL-1；lgS：殺菌處理前后菌落總數降低的對數。

1.3.4 CGDP處理對Fusarium solani生長、細胞膜完整性及孢子形態的影響 取50 mL濃度為2×106CFU·mL-1的孢子懸浮液，540 V條件下，CGDP處理0（CK）、5、10、15、20、25和30 min后分別測定其各種生理指標。孢子萌發率參考杜明遠等［17］的方法，通過生物顯微鏡觀察統計孢子萌發數；通過十字交叉法測定菌落直徑和菌絲生物量；核酸泄漏量和蛋白質泄漏量通過紫外吸收法測定，核酸泄漏量和蛋白質泄漏量分別用OD260和OD280表示；孢子碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色參考王志芳等［18］的方法，并通過熒光顯微鏡觀察結果；掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）前處理參考潘春青［19］的方法，在5 000倍掃描電鏡視野下觀察、拍照。

1.3.5 殺菌動力學模型及評價 常見的動力學模型有三類，分別是Linear模型、Weibull模型和Log-Logistic模型。運用MatLab1.0.01軟件分別對所得的數據進行模型擬合，得到不同電壓下CGDP處理過程中，Fusarium solani菌落數下降值隨處理時間變化的動力學方程。并且引入相關系數（R2）、精確因子（Af）、偏差因 子（Bf）和 均方 根方 差（root mean square error，RMSE）四個參數評價擬合效果。其中R2是評價模型擬合優度的度量值，值越接近1代表模型擬合程度越佳；Af和Bf為預測值與實測值的偏離程度，Af與Bf值越接近1，代表預測值與實測值偏離程度越低；RMSE表示模型擬合的精確性，值越小代表模型擬合精確度越高。其表達式如表1所示。

表1 3種動力學模型數學表達式及模型參數Table 1 Mathematical expressions and model parameters for three kinetic models

1.4 數據處理

所有試驗重復3次，采用Excel 2016和SPSS 21.0軟件進行數據處理和方差分析（analysis of variance，ANOVA），結果表示為平均值±標準偏差（P<0.05），并用Origin 2018和MatLab1.0.01軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 CGDP對·OH、H2O2、NO3-濃度及pH值的影響

等離子體殺菌過程中，由于受等離子體自身粒子不穩定性以及細胞多樣性影響，其殺菌機理目前仍處于探索階段，其中公認最多的是等離子體氧化殺菌。CGDP處理時，當施加于針狀電極的電壓達到某一擊穿電壓時，電極附近的水分子會被活化成H2O+，并通過電子轉移產生·OH和·H，進而生成H2和O2，這一區域又被稱為等離子體區。在等離子體區附近的液相區，液體中的水分子又與來自電極附近的H2O+gas相互撞擊分解成H和O，進一步生成H2O2；同時水分子還與H2O+發生電荷轉移生成·OH，這些物質從等離子體層遷移，進而充滿整個溶液。它們不但可以相互作用，還可以與底物發生反應［13］。

另外，在放電過程中還會形成活性氮粒子，這些粒子在水中形成亞硝酸和硝酸等酸性物質，使樣品酸化，從而抑制菌體生長。

表2為540 V電壓下CGDP處理后測量得到的·OH、H2O2、NO3-濃 度 和pH值。與0 min相比，CGDP處理30 min，·OH和H2O2濃度分別增加到1.57 mg·L-1和73.89 mmol·L-1，且表現出顯著差異（P<0.05）；NO3-濃度在30 min內隨著處理時間的延長而線性增加，最高達到12.72 mg·L-1；pH值經CGDP處理后從7.07降低到4.66（30 min）。Annachiara等［20］在分析氣體等離子體對水溶液中化學物質的影響時也得到了類似的結果，并推測活性粒子濃度的增加可能是微生物失活的主要原因。

表2 540 V條件下CGDP過程中·OH、H2O2、NO3-濃度及pH值Table 2 ·OH， H2O2 and NO3- concentrations and pH in the CGDP process at 540 V

2.2 CGDP伏安特性

CGDP處理過程中電流-電壓關系如圖2所示。結果表明，電流隨電壓的變化主要分為3個階段：AB段為普通的電解過程，在此范圍內電流與電壓呈線性正相關關系，并符合法拉第定律；BC段為不穩定區，前期電流隨電壓的增大而急劇下降，并伴隨著氣泡的產生，之后隨著電壓的增大出現劇烈波動；CD段為輝光放電區，當電壓調節到C點（500 V）時，電極尖端開始出現紫色的輝光，且隨著電壓的增大輝光放電逐漸穩定，水分子被活化并產生等離子體，此段也稱為等離子體區。本試驗選擇輝光放電穩定的最低電壓為540 V。

圖2 CGDP處理過程中電流-電壓特征曲線Fig.2 Current-voltage characteristic curve during CGDP processing

2.3 電壓及處理時間對CGDP殺菌效果的影響

在能夠穩定產生CGDP的電壓范圍內，本試驗研究了電壓在500～580 V之間CGDP處理對Fusarium solani殺菌效果的影響。結果表明（表3），在相同的處理時間下，隨著電源電壓的升高，Fusarium solani孢子的存活數逐漸降低；在相同的電壓下，隨著處理時間的延長，樣品中孢子存活數逐漸減少。當電壓為500 V時，與對照相比，CGDP處理20 min時，孢子對數值下降了0.19 lg（CFU·mL-1），繼續升高電壓為560 V時，樣品中孢子對數值下降了2.5 lg（CFU·mL-1），大多數孢子被殺死，當電壓升高到580 V時，可殺死全部孢子。此外，當電壓為540 V時，CGDP處理20 min使孢子對數值下降了2.66 lg（CFU·mL-1），繼續延長處理時間至25 min時，樣品中沒有活孢子檢出。殺菌效果是處理時間及電壓強度共同作用的結果，因此，后續研究采用電壓強度作為動力學研究的變量。

表3 電壓及處理時間對Fusarium solani孢子殺菌效果的影響Table 3 Effect of voltage and time on the fungicidal effect of Fusarium solani spores /lg（CFU·mL-1）

2.4 抗壞血酸對CGDP殺菌效果的影響

由圖3可知，540 V電壓下，CGDP處理后，隨著處理時間的延長，對照組菌落存活數逐漸減少，殺菌效果增強。當加入一定濃度的抗壞血酸后，菌落存活數增加，殺菌效果減弱。加入5 mmol·L-1的抗壞血酸，CGDP處理30 min時，與對照相比，菌落存活數下降了3.6 lg（CFU·mL-1）。繼續提高抗壞血酸濃度到10 mmol·L-1和20 mmol·L-1，菌落存活數下降速率降低，CGDP處理20 min時，菌落存活數僅為對照組的46.4%和56.9%，基本保持不變。這可能是抗壞血酸的濃度過高所導致，此時抗壞血酸對活性氧的抑制即將達到飽和狀態。

圖3 抗壞血酸對Fusarium solani孢子殺菌效果的影響Fig.3 Effect of ascorbic acid on the fungicidal effect of Fusarium solani spores

2.5 Fusarium solani孢子初始濃度對CGDP殺菌效果的影響

電源電壓540 V下，考察Fusarium solani不同孢子濃度對CGDP殺菌效果的影響，結果如圖4所示。在不同的初始濃度條件下，CGDP對Fusarium solani孢子都有著明顯的殺菌效果。當初始濃度為4×105CFU·mL-1時，CGDP處理20 min，可全部殺死樣品中孢子，當初始濃度為2×106、3×106CFU·mL-1時，殺死全部孢子所需時間分別為25和30 min。繼續提高孢子初始濃度至4×106CFU·mL-1時，CGDP處理30 min未能殺死全部孢子。由此可知，提高孢子濃度會降低殺菌效率。

圖4 Fusarium solani孢子初始濃度對CGDP殺菌效果的影響Fig.4 Effect of initial concentration of Spores of Fusarium solani on bactericidal effect of CGDP

2.6 CGDP處理對Fusarium solani生長、細胞膜完整性及孢子形態的影響

微生物結構的完整性是保證其生長及各種代謝活動的基礎。表4反映了CGDP處理對Fusarium solani孢子生長抑制以及細胞膜破壞作用。結果表明，隨著CGDP處理時間的延長，菌落直徑整體顯著減小（P<0.05）。處理時間為0 min時，對照組菌落直徑為5.53 cm，而處理時間為20 min時，菌落直徑減小至3.23 cm，僅為對照組的58.4%；繼續延長處理時間至25 min，未發現菌絲生長。另外，菌絲生物量和孢子萌發率也隨著CGDP處理時間的延長而顯著降低（P<0.05）。處理時間為20 min時，菌絲生物量為對照組的4.45%，孢子萌發率較比照組下降98.47個百分點；繼續延長處理時間，Fusarium solani無孢子萌發，菌絲生物量也無積累，此結果與菌落直徑對應，同時也證明CGDP處理25 min可對Fusarium solani孢子達到完全滅活。

表4 CGDP處理對Fusarium solani孢子生長及細胞膜完整性的影響Table 4 Effect of CGDP treatment on the growth and cell membrane integrity of Fusarium solani spores

碘化丙啶（PI）不能透過完整的細胞膜，但能染紅細胞膜有破損的細胞。由表4可知，Fusarium solani胞內核酸泄漏量隨著CGDP處理時間的延長而顯著增大（P<0.05）；蛋白質泄漏量在CGDP處理前10 min幾乎無變化，繼續延長處理時間，蛋白質泄漏量增加，但差異不顯著。處理時間為20 min時，核酸泄漏量和蛋白質泄漏量的增加量分別為對照組的40%和9%，表明Fusarium solani細胞膜出現了損傷或破碎。圖5也證明了這一結果，即未處理的Fusarium solani孢子活性較高，均未被PI染色劑染色，而處理后的Fusarium solani孢子均出現可見熒光，且隨著CGDP處理時間的延長，熒光強度愈加明顯。

SEM圖顯示了CGDP處理對Fusarium solani孢子形態的影響，圖5-G為未經CGDP處理的孢子形態，圖5-H和I分別為經CGDP處理15和30 min的孢子形態圖。由圖5-G可以看出，未經CGDP處理的Fusarium solani孢子呈規則的鐮刀狀，且表面光滑、內部飽滿、有3條不明顯的棱膜；CGDP處理15 min后，Fusarium solani孢子形態發生明顯變化，孢子表面變得粗糙，且內部發生皺縮，3條棱膜開始變得明顯。當CGDP處理時間延長至30 min時，孢子表面愈發粗糙，且出現明顯的破損，胞內物質發生泄漏，3條棱膜也可明顯地觀察到。此外，對比圖5-G、H、I可明顯觀察到，隨著處理時間的延長，等離子體對Fusarium solani孢子形態的破壞加重。

圖5 CGDP處理Fusarium solani孢子PI染色圖和SEM圖Fig.5 PI staining and SEM images of CGDP-treated Fusarium solani spores

2.7 模型擬合分析

采用3種常見的微生物致死模型Linear模型、Weibull模型和Log-Logistic模型，分別對不同電壓下，CGDP處理過程中，Fusarium solani孢子隨處理時間變化的失活曲線進行擬合，擬合參數如表5所示。Linear模型經常被用來反映殺菌過程中，微生物存活數隨處理時間變化的關系。500～580 V不同電壓下，CGDP處理Fusarium solani失活曲線決定系數（R2）分別為0.722 3、0.464 0、0.754 1、0.736 0和0.775 5，決定系數較低，表明CGDP處理對Fusarium solani的失活過程不符合Linear模型。同時，CGDP處理過程中產生的活性粒子對Fusarium solani孢子致死效應存在差異，導致在整個過程中致死效率不相同。因此，Linear模型不適用于描述CGDP處理條件下微生物的致死規律。

運用另外2種常見的微生物致死模型（Weibull、Log-Logistic模型），進行CGDP處理過程中失活曲線的擬合。不同電壓下，2種擬合方程決定系數均高于0.823 7（表5），表明這2種模型可較好地擬合CGDP對Fusarium solani孢子失活曲線。

表5 3種模型擬合CGDP殺滅Fusarium solani 孢子動力學曲線參數Table 5 Parameters of the kinetic curves for CGDP killing of Fusarium solani spores fitted by the three models

為了衡量實測值與預測值之間的差異，以同一模型中實測值為橫坐標，預測值為縱坐標作圖，并進行線性擬合得到決定系數（R2）。實測值與預測值越接近，擬合曲線斜率越接近1。由圖6可知，CGDP處理Fusarium solani實測值與3種模型預測值的關系曲線斜率存在一定差異。其中Linear、Log-Logistic模型關系曲線斜率相對較低，且截距較大，Weibull關系曲線斜率為0.893 1，較接近1。由表6可知，相比于其他兩種 模 型，Weibull模 型 的Af、Bf和R2更 接 近1，并 且RMSE較小，表明該模型可靠性高于其他模型。因此，在3個模型的整體比較中，Weibull模型能更好地擬合CGDP處理過程中Fusarium solani的殺滅動力學曲線。

圖6 CGDP處理對Fusarium solani殺菌效果實測值與預測值相關性圖Fig.6 Correlation between measured and predicted values of the fungicidal effect of CGDP treatment on Fusarium solani

表6 3種模型評價參數的比較Table 6 Comparison of the evaluation parameters of the three models

3 討論

3.1 CGDP對Fusarium solani殺菌效果的影響及影響因素

在等離子體中，一般認為高能電子、帶電粒子、紫外線、氧自由基等物質與微生物的滅活有關。本試驗結果表明，隨著CGDP電壓的增加，殺菌效果逐漸提高。同時，CGDP處理過程中的活性粒子（·OH、H2O2和NO3-）濃度隨處理時間的延長而逐漸增大。這與Liu等［21］在研究接觸輝光放電產生的光發射特性和自由基時發現的現象相似，即當施加電壓超過450 V時，自由基的強度隨外加電壓的增加而增加。其原因是當施加電壓較低時，電子能量不足以活化更多水分子，使陽極尖端產生持續的活化粒子。本試驗還表明，使用自由基清除劑抗壞血酸后，殺菌效果明顯降低。黃明明［22］研究等離子體對添加抗壞血酸沙門氏菌的殺菌效果時發現，隨著抗壞血酸的添加，沙門氏菌對等離子體的抗性增強。因此，推測CGDP過程中產生的活性粒子是殺菌的主要因素之一。對于高濃度的孢子，CGDP殺滅低濃度孢子的效率較大（圖4），在滑弧放電等離子體對大腸桿菌的滅菌效果研究中發現，穿透效應是細菌失活的主要因素之一［23］。這可能是因為孢子濃度較高時，CGDP處理過程中產生的高能離子不足以持續穿過細胞壁或細胞膜，破壞胞內電解質，促使細胞死亡。此時殺菌作用可能主要來自活性氧（ reactive oxygen species，ROS）的氧化作用，而高速粒子的穿透效應可以忽略不計。

3.2 CGDP對Fusarium solani生理指標及細胞膜的影響

CGDP處理對Fusarium solani孢子生長及細胞膜完整性測定結果表明，隨著處理時間的延長，孢子的生長受到明顯的抑制。SEM和PI染色結果也證明了這一點，經CGDP處理后的孢子形態發生明顯變化，表面粗糙，可以觀察到嚴重破損現象，PI染色熒光強度也大幅度提高，這與李兆杰等［24］的研究一致。這可能是由等離子體中正負離子在微生物表面產生的剪切力大于其細胞膜表面張力，激活細胞表面刻蝕效應所致［25］。通常，消毒產品中，乳酸分子的電離可以使細胞膜滲透性改變從而破壞底物。CGDP過程中觀察到溶液pH值由7.07降至4.66的酸化，可能導致類似的失活模式。然而等離子體引起的酸度增加并未被確定是造成細胞死亡的真正原因，Korachi等［26］通過觀察CGDP處理后的胞內物質，發現活性粒子是造成DNA裂解導致細胞凋亡的真正原因。Kim等［27］研究大氣壓等離子體射流（atmospheric pressure plasma jet，APPJ）對孢子的滅活機制時也表明，ROS等活性物質是導致細胞凋亡的主要因素。

3.3 CGDP殺菌動力學模型

通過對殺菌效果和電壓強度關系的分析，得到CGDP處理Fusarium solani的動力學特征與Weibull模型擬合程度最高（R2=0.924 2），更符合CGDP殺菌過程中微生物致死規律。這與王英［28］關于低溫等離子體殺滅蘋果汁中耐高滲酵母的結果一致。但該模型是否適用于等離子體殺滅其他微生物動力學有待進一步深入研究。

4 結論

本研究結果表明，CGDP能夠有效殺滅Fusarium solani孢子。升高電壓、延長處理時間和降低孢子初始濃度均能夠提高殺菌效果；當CGDP處理20 min時，電壓從500 V升高到580 V，Fusarium solani（2×106CFU·mL-1）菌落存活數減少6.05 lg（CFU·mL-1）；在540 V時，CGDP對孢子萌發率、菌絲生長量及菌落直徑的抑制作用均隨處理時間的延長而增大，處理時間為25 min時，抑制率達到100%；孢內核酸和蛋白質的滲漏量也隨處理時間的延長而增大，與0 min相比，處理時間為25 min時，分別增加了48%和13.6%；模型擬合結果表明，Weibull模型符合CGDP處理對Fusarium solani的殺菌動力學曲線。