獼猴桃果實貯藏期間細胞壁多糖物質降解特性及組織結構差異分析

陸玲鴻 馬媛媛 古咸彬 肖金平 宋根華 張慧琴

（浙江省農業科學院園藝研究所，浙江 杭州 310021）

獼猴桃是典型的呼吸躍變型果實，有明顯的生理后熟過程，采后易軟化腐爛，不耐貯藏。如何延長獼猴桃果實貯藏期已成為獼猴桃產業發展壯大亟待解決的問題［1］。不同基因型獼猴桃果實的耐貯性差異較大［2-3］。紅心類型的中華獼猴桃品種如紅陽，具有優異的食用品質，近年來得到了快速發展，但這類品種果實軟化較快，耐貯性較差，可食期較短［4］。近幾年，易剝皮、高維生素C含量的毛花獼猴桃已經開始規模化栽培，發展迅速［5］。毛花獼猴桃新品種華特果實中淀粉在采前已快速下降，導致其采收時硬度較低，但其貨架期和可食期較長，耐貯性較好［6-8］。

前期研究發現，不同品種獼猴桃在貯藏過程中果實質地變化存在差異［8］。與美味和中華獼猴桃相比，采前毛花獼猴桃的硬度較低，但在25 ℃貯藏時果實質地更穩定、更耐貯藏。造成這一現象的原因可能與果肉細胞組織結構及內含物成分、狀態有關，特別是細胞壁果膠，其在諸多果蔬的結構特性方面發揮著重要作用［8］。目前，針對不同貯藏溫度下，不同品種獼猴桃果實采后細胞壁多糖物質降解特性與果實貯藏性相關性的研究仍鮮見報道。本研究以紅陽和華特獼猴桃果實為試材，通過測定25和4 ℃貯藏過程中兩品種獼猴桃果實的硬度、細胞壁多糖物質含量和果膠降解相關酶活性，并比較兩品種在25 ℃貯藏下果實細胞顯微結構和鈣組分含量差異，旨在為獼猴桃果實采后細胞壁多糖物質降解特性研究及優質耐貯的獼猴桃新品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

供試品種紅陽和華特獼猴桃分別采自浙江上虞和浙江仙居的合作試驗基地，均于商業采收期采摘。紅陽果實于盛花后135 d采摘（2020年9月6日），其可溶性固形物含量為6.9%。華特果實于盛花后170 d采摘（2020年10月30日），其可溶性固形物含量為12.2%。果實采收當天挑選大小均勻、成熟度一致、無病蟲害和機械損傷的果實，均勻地放在紙箱中，用保鮮膜包裝后分別放置于25和4 ℃環境中供后續分析與取樣。貯藏期間，25 ℃貯藏組每3 d取樣一次，4 ℃貯藏組每7 d取樣一次。果實硬度低于0.02 kg時停止取樣。25 ℃貯藏時，將貯藏期分為采收期Ⅰ（采收當天）、可食期Ⅱ（硬度約為0.1 kg）和過熟期Ⅲ（硬度約為0.025 kg，紅陽為采后15 d，華特為采后18 d）。獼猴桃果肉用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存待測。每個重復取用6個果實。

1.2 主要儀器與設備

FA2004型分析電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；MDF-382E型超低溫冰箱，日本SANYO公司；Synergy型超純水儀，美國Millipore公司；FHM-1果實硬度計，日本竹村公司；PAL-1型數顯糖度計，日本Atago公司；3-18K型高速冷凍離心機，德國Sigma公司；UV-2600型紫外可見分光光度計，日本島津公司；Leica DM500 型光學顯微鏡，德國徠卡公司；微孔板檢測酶標儀，美國BIOTEK公司；HH-S顯恒溫水浴鍋，江蘇正基儀器有限公司；ZEEnit 700P型原子吸收光譜儀，德國耶拿公司。

1.3 測定指標與方法

在果實赤道部位均勻取3個點，削去約1 cm2果皮，用果實硬度計測定硬度，以kg表示。經蒸餾水調零后采用PAL-1型數顯糖度計測定獼猴桃果實赤道部可溶性固形物含量，以%表示。每品種隨機測量6個果實，結果取平均值。

半纖維素含量用蒽酮法［9］測定，用葡萄糖作標準物質，結果用mg Glu·g-1FW表示；重量法測定纖維素含量，結果用mg·g-1FW表示。不同溶解性果膠含量測定參考曹建康等［9］的方法，結果用mg GalA·g-1FW表示。

用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，并采用上海科興生物科技有限公司的ELISA試劑盒進行酶活性測定。每樣品重復3次，結果以U·g-1protein表示。

參考文獻［10］的方法。選取25 ℃貯藏條件下的紅陽和華特采收期及過熟期的果實為材料，將果實赤道部位果肉切塊并用酒精醋酸福爾馬林混合固定液固定，制作石蠟切片，并于光學顯微鏡下觀察和成像。

對紅陽和華特采收期Ⅰ、可食期Ⅱ和過熟期Ⅲ 3個時期的果樣進行不同形態鈣含量的測定。準確稱取0.6 g果肉干樣于10 mL離心管中，分別用去離子水、1 mol·L-1氯化鈉、2%醋酸和5%鹽酸逐級提取，用原子吸收光譜儀測定各鈣組分含量，試驗重復3次。

1.4 數據分析

采用Excel 2019軟件進行數據統計、分析與繪圖，利用SPSS 26.0軟件進行相關性及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃果實硬度和可溶性固形物含量的變化

果實硬度是反映果實耐貯性的重要指標。貯藏0 d時，華特果實硬度約為0.2 kg，顯著低于紅陽果實硬度（圖1）。兩種貯藏溫度下，紅陽獼猴桃果實硬度均在貯藏前期快速下降，隨后緩慢下降；25 ℃貯藏時，華特果實硬度呈緩慢下降趨勢，4 ℃貯藏時，華特果實硬度在貯藏7 d時呈現輕微上升趨勢，隨后呈緩慢下降趨勢。25 ℃條件下，紅陽和華特果實可分別可貯藏15和18 d；4 ℃條件下，紅陽和華特果實可分別貯藏42和28 d。貯藏0 d時，華特果實可溶性固形物含量顯著高于紅陽，而貯藏末期顯著低于紅陽。25 ℃貯藏下，紅陽獼猴桃果實可溶性固形物含量在貯藏前期快速增加，后期緩慢增加；華特果實可溶性固形物含量隨貯藏天數的增加呈緩慢上升趨勢。相對于25 ℃貯藏，4 ℃條件下，兩品種果實可溶性固形物含量均呈緩慢上升趨勢。

圖1 獼猴桃果實貯藏期間硬度和可溶性固形物含量的變化Fig.1 Changes of fruit firmness and soluble solid content during storage of kiwifruit

2.2 獼猴桃果實半纖維素和纖維素含量的變化

半纖維素（hemicellulose， HCL）和纖維素（cellulose，CL）是細胞主要的骨架物質，與果實硬度密切相關。由圖2可知，采收時，紅陽的HCL和CL含量顯著高于華特。不同貯藏條件下，隨著貯藏天數的增加，紅陽的HCL和CL含量均呈下降趨勢，且均在貯藏前期快速下降，而后緩慢降低，而華特的HCL和CL含量在整個貯藏過程中下降緩慢。25 ℃貯藏后期，華特的CL含量顯著高于紅陽。4 ℃貯藏條件下，紅陽的HCL和CL含量始終顯著高于華特。相關性分析表明，兩種貯藏溫度下，紅陽果實硬度與HCL和CL含量呈極顯著正相關；華特果實硬度與HCL和CL含量僅在25 ℃貯藏條件下呈極顯著正相關（表1）。

圖2 獼猴桃果實貯藏期間半纖維素和纖維素含量的變化Fig.2 Changes of hemicellulose and cellulose contents during storage of kiwifruit

2.3 獼猴桃果實果膠含量的變化

果膠是植物細胞壁的初生壁和中膠層的主要成分，果膠物質含量及成分的變化是影響果實硬度的關鍵因素之一［11］。由圖3可知，貯藏0 d時，紅陽果實水溶性果膠（water soluble pectin， WSP）含量顯著低于華特，而離子型果膠（ironic soluble pectin， ISP）和共價結合型果膠（covalent soluble pectin， CSP）含量顯著高于華特。兩種貯藏溫度下，紅陽果實WSP含量在貯藏前期快速增加，隨后緩慢增加；CSP含量在貯藏前期快速減少，隨后緩慢減少。華特WSP和CSP含量相對穩定，且WSP含量始終顯著高于紅陽。兩品種果實ISP含量均呈現先增加后減少再增加的波動變化趨勢。4 ℃貯藏條件下，紅陽ISP含量始終顯著高于華特。相關性分析表明，兩種貯藏條件下，兩品種獼猴桃果實硬度與WSP和CSP含量均存在顯著或極顯著相關性，但與ISP含量相關性不顯著（表1）。

圖3 獼猴桃果實貯藏期間果膠含量的變化Fig.3 Changes of pectin content during storage of kiwifruit

2.4 獼猴桃果實果膠降解酶活性的變化

果膠降解與果膠甲酯酶（pectin methylesterase， PME）、內切多聚半乳糖醛酸酶（endo-polygalacturonase， PG）和果膠酸裂解酶（pectate lyase， PL）等活性緊密相關［3］。25 ℃貯藏下，紅陽PME活性在貯藏3 d后不斷增加直至貯藏結束；華特PME活性在貯藏6 d時達到最低值，隨后緩慢增加，但活性始終顯著低于紅陽（圖4）；紅陽果實PME活性與硬度、WSP和CSP組分含量均達顯著相關水平，而在華特果實中的相關性均不顯著（表1）。4 ℃貯藏下，紅陽PME活性在貯藏7 d時便高達采收時的2.6倍，在貯藏后期有所降低；華特PME活性在貯藏前期緩慢增加，在貯藏21 d時達到峰值。4 ℃貯藏時兩品種獼猴桃果實PME活性較25 ℃貯藏時有所提高。相關性分析結果表明，4 ℃貯藏下的華特果實PME活性與CSP、HCL和CL組分含量均呈顯著負相關，而在紅陽果實中均不顯著（表1）。在兩種貯藏溫度下，紅陽PG活性變化幅度相對較小，活性高峰不明顯。25 ℃貯藏下，華特PG活性變化趨勢與PME活性變化趨勢較一致；4℃貯藏21 d時，華特PG活性顯著高于紅陽，低溫抑制了貯藏后期PG活性的上升。PL作用于去甲酯化后的半乳糖醛酸聚糖，催化產生不飽和寡聚半乳糖醛酸。25 ℃貯藏時，兩品種PL活性變化趨勢相似，在貯藏前9 d，華特PL活性顯著低于紅陽，但4 ℃貯藏時，除0 d以外，華特PL活性總體高于紅陽。相關性分析表明，僅在25 ℃貯藏時，華特果實PL活性與WSP、CSP、HCL和CL組分含量呈顯著相關性，而在紅陽果實中均不顯著（表1）。

圖4 獼猴桃果實貯藏期間果膠甲酯酶、多聚半乳糖醛酸酶和果膠酸裂解酶活性變化Fig.4 Changes of PME， PG and PL activities during storage of kiwifruit

表1 獼猴桃果實硬度、細胞壁組分和果膠降解酶活性之間的相關性分析Table 1 Correlation analysis between firmness， cell wall fractions and pectin-degrading enzymes in kiwifruit fruit

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-arabinofuranosidase，α-AF）是兩種主要的糖苷酶，能分別水解果膠毛發區和半纖維素上的β-半乳糖和α-阿拉伯呋喃糖。25 ℃貯藏條件下，紅陽和華特果實β-Gal活性分別于貯藏9和15 d時達到峰值，且貯藏前12 d，華特果實β-Gal活性顯著低于紅陽（圖5）。相比之下，兩品種α-AF活性變化趨勢較為一致，且均在貯藏9 d時出現活性高峰。4 ℃貯藏下，β-Gal和α-AF活性變化較為一致，均隨貯藏天數的增加呈上升-下降-上升的波動變化。相關性分析結果顯示，β-Gal和α-AF活性與硬度和各細胞壁多糖組分含量均無顯著相關性（表1）。

圖5 獼猴桃果實貯藏期間β-半乳糖苷酶和α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性變化Fig.5 Changes of β-Gal and α-AF activities during storage of kiwifruit

2.5 獼猴桃果實細胞顯微結構變化

采收期，華特表皮細胞層數（6層）為紅陽（2層）的3倍。華特果肉細胞呈橢圓形，排列緊密，且表皮細胞過渡到果肉細胞是細胞體積逐漸增大的過程。紅陽果肉細胞形態不規則，排列松散（圖6-I）。可食期，紅陽和華特果肉細胞體積增大，細胞壁染色程度降低，部分細胞破裂，紅陽近表皮細胞處出現小空腔（圖6-Ⅱ）。過熟期，紅陽和華特果肉細胞大量破裂，紅陽近表皮細胞處出現較大空腔（圖6-Ⅲ）。此外，切片結果發現，紅陽和華特果肉組織均含有針晶束（草酸鈣），但紅陽針晶束含量較少（結果未顯示），而華特針晶束數量較多（圖7）。

圖6 獼猴桃果實貯藏期間細胞顯微結構變化比較Fig.6 Comparison of cell microstructure changes during storage of kiwifruit

圖7 華特果實貯藏期間針晶束分布圖Fig.7 Distribution of needle-crystal bundles of White fruits during storage

2.6 獼猴桃果實鈣組分含量變化

切片結果顯示華特果實含有較多的草酸鈣，因此進一步檢測兩品種果實中的鈣含量。果肉樣品用去離子水、氯化鈉、醋酸以及鹽酸逐級提取分別得到水溶鈣、果膠鈣、磷酸鈣和草酸鈣。由圖8可知，紅陽和華特獼猴桃果實中的鈣均以水溶鈣為主，其次為磷酸鈣和果膠鈣，草酸鈣含量最低。3個取樣時期下，華特4種鈣組分含量均顯著或極顯著高于紅陽。

3 討論

植物細胞壁主要由多糖類的纖維素、半纖維素、果膠及少量的糖基蛋白組成［12-15］。細胞壁組分及結構的變化是導致獼猴桃果實軟化的關鍵因素。本試驗中，兩獼猴桃品種果實貯藏過程中，細胞壁組分發生不同程度的降解，紅陽獼猴桃各細胞壁多糖組分含量變化速度較快。采收時，紅陽HCL、CL、CSP和ISP含量顯著高于華特，WSP含量顯著低于華特。在25和4 ℃貯藏下，紅陽和華特獼猴桃果實HCL、CL和CSP含量呈降低趨勢，WSP含量呈上升趨勢，ISP含量相對穩定，這與前人研究結果類似［16］。高萌等［11］研究發現， 在整個貯藏期間，較不耐貯藏的徐香WSP含量極顯著高于耐貯藏的海沃德。而本研究發現，華特WSP含量始終顯著高于紅陽，但其變化幅度較小且更平緩。可見，獼猴桃WSP的含量及其穩定性均可影響果實耐貯性。相關性分析結果顯示，兩品種獼猴桃果實硬度與WSP含量呈顯著負相關，與CSP、HCL、CL含量呈顯著正相關，說明獼猴桃果實軟化與細胞壁多糖物質的降解緊密相關。

果實軟化過程中，細胞壁聚合物的解體和中膠層的溶解主要由細胞壁降解酶或蛋白質協同促進，該過程涉及多個細胞壁結構相關基因［17-18］。果膠是結構最復雜的植物細胞壁多糖，在細胞與細胞間的黏附中具有重要作用。果膠聚合物在果實成熟過程中的降解是幾種果膠代謝酶共同作用的結果［19-20］。高萌等［11］研究發現，較不耐貯藏的徐香獼猴桃PG、PME和β-Gal活性高于耐貯藏的海沃德。匡盛［21］也發現紅陽獼猴桃PG和β-Gal活性高于耐貯藏的海沃德。本研究發現，25 ℃貯藏前期，紅陽獼猴桃PL和β-Gal活性顯著高于華特；貯藏中后期，紅陽PME活性顯著高于華特。這些酶活性的差異可能是華特果實WSP和CSP含量變化速度較慢、變化幅度較小且在25 ℃時貯藏性優于紅陽的原因之一。4 ℃貯藏時，除0 d以外，華特PL活性總體高于紅陽，華特β-Gal活性較25 ℃貯藏有所提高，在貯藏中期與紅陽無顯著差異。這些酶活性的變化可能在一定程度上削弱了華特耐貯性的優勢。相關性分析表明，25 ℃貯藏時，與紅陽和華特果實軟化顯著相關的果膠降解酶分別是PME和PL；4 ℃貯藏時，與華特果實軟化顯著相關的果膠降解酶是PME。大量研究表明，不同果膠降解酶在不同物種果實軟化中的作用不同。抑制番茄中的PG活性并不能顯著延緩轉基因果實的軟化進程［22］，而抑制草莓和蘋果中的PG酶基因表達卻能顯著提高果實硬度，延長果實貨架期［23-24］。目前，在物種間造成這種差異的原因仍然未知。

果實耐貯性與果實細胞的結構密切相關。海沃德表皮細胞層數大于徐香，果肉細胞的形變程度小于徐香，均是其耐貯性較好的原因［11］。本研究結果顯示，25 ℃貯藏期間，華特表皮細胞層數更多，果肉細胞形狀更規則、排列更緊密也可能是其較耐貯的原因。此外，果皮表皮毛及角質層的厚度也影響果實的耐貯性［11］。本研究中，兩品種果皮角質層無明顯差異，但華特果實表皮毛對其貯藏性可能有積極作用。對兩獼猴桃品種果實不同形態鈣含量進行測定，發現華特果實的水溶鈣、果膠鈣、磷酸鈣和草酸鈣含量均顯著高于紅陽。果膠鈣的形成可增加細胞壁剛性，有助于膜系統的穩定和細胞膨壓的改善［25-26］，草酸鈣晶體具有組織支持作用［27］。華特耐貯性強可能與其高含量的果膠鈣和草酸鈣等鈣組分有關。相關研究表明，在幼果期噴鈣可有效提高黃金梨果肉中各鈣組分的含量，有效提升貯藏性能［28-29］。采前噴施糖醇螯合鈣可有效提高獼猴桃果實鈣含量和貯藏性能［30-31］。因此，不耐貯的獼猴桃品種可通過采前適量噴鈣來增加果實中鈣組分的含量，從而增強其耐貯性。

4 結論

本研究結果表明，獼猴桃果實軟化與細胞壁多糖物質的降解顯著相關。紅陽獼猴桃各細胞壁多糖組分含量變化速度較快。4 ℃低溫貯藏可減緩紅陽和華特果實細胞壁多糖物質的降解速度，延長其貯藏期限。25 ℃貯藏前期，紅陽獼猴桃PL和β-Gal活性顯著高于華特，貯藏中后期，PME活性顯著高于華特；25 ℃貯藏期間，華特果實表皮細胞層數更多，果肉細胞排列更緊密，果實鈣組分含量更高，均可增強華特獼猴桃的耐貯性。4 ℃貯藏前期，紅陽β-Gal活性與華特無顯著差異，而PL活性則低于華特，是低溫貯藏時華特獼猴桃相對不耐貯的原因之一。