胚胎種植前遺傳學檢測助孕妊娠結局的影響因素研究

王博雅 ，何英明 ，薛吟霜 ，向卉芬 ，5*

植入前遺傳學檢測（preimplantation genetic testing，PGT）是以體外受精-胚胎移植（in vitro fertilizationembryo transfer，IVF-ET）為基礎，在胚胎植入前從獲得的囊胚中取出3～8個細胞，對其進行活檢和遺傳學診斷，篩選正常胚胎植入子宮，從而提高胎兒健康概率的一種孕前診斷技術。1990年HANDYSIDE等［1］報道了人類第1例PGT嬰兒的出生。隨后，在臨床輔助生殖領域PGT扮演了重要的角色。隨著PGT技術在人類輔助生殖技術（assisted reproductive technology，ART）中的應用越來越多，全球范圍內應用該技術治療不孕不育的患者逐漸增多。胚胎異常（基因或染色體結構異常）是導致種植失敗及流產比較公認的原因之一［2］。然而經PGT篩選后的正常胚胎仍有可能出現種植失敗，其原因目前并沒有形成統一的結論。因此本研究回顧性分析了行PGT治療患者的一般資料及輔助檢查結果、促排卵及體外胚胎發育情況，以探討影響PGT患者種植失敗及流產的危險因素，為降低PGT患者種植失敗率及流產率提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性分析2018年12月至2021年2月在安徽醫科大學第一附屬醫院生殖中心行PGT助孕的329例患者的臨床資料。根據患者是否臨床妊娠分為臨床妊娠組（218例）和種植失敗組（111例），臨床妊娠率66.26%（218/329）。其中臨床妊娠組再根據妊娠結局分為活產亞組（175例）和流產亞組（43例），流產率19.72%（43/218）。

診斷標準：（1）臨床妊娠診斷標準，IVF-ET術后5周行陰道超聲檢查，若宮腔內可見孕囊則診斷為臨床妊娠；（2）流產診斷標準，妊娠不足28周、胎兒體質量不足1 000 g而終止妊娠者診斷為流產。

本研究經安徽醫科大學醫學倫理委員會審核批準（審批號：20200838）。所有患者對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 研究方法 患者應用促排方案前禁食8 h以上，次日清晨于本中心測量身高、體質量，并計算體質指數（body mass index，BMI）。患者應用促排方案前分別于月經第2～3天及非月經期空腹抽取靜脈血，測定各項生化指標，包括基礎卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、基礎黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、空腹胰島素（fasting insulin，FINS）、空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）、 糖 類 抗 原 125（carbohydrate antigen 125，CA125）、25羥維生素D〔25-hydroxyvitamin D，25-（OH）D〕。

1.3 促排方案及PGT技術 患者均采用控制性促排卵方案，陰道超聲提示卵泡有1個直徑≥18 mm或2個直徑≥17 mm或3個直徑≥16 mm時注射10 000 U人絨毛膜促性腺激素（HCG，珠海麗珠），36 h后行超聲引導下經陰道穿刺取卵術。取卵后4～6 h行卵胞質內單精子注射。受精卵體外培養5～6 d至囊胚階段，抽取3～8個滋養層細胞活檢，活檢的囊胚進行玻璃化冷凍。應用微陣列比較基因組雜交技術或高通量測序分析染色體情況［3］。

1.4 胚胎移植 患者月經第2～5天予以補佳樂2 mg（德國拜耳），2次/d，口服。當陰道超聲監測到內膜厚度≥8 mm 時，予以黃體酮60 mg，1次/d，肌肉注射轉化內膜。5 d后胚胎解凍移植1枚PGT檢測結果正常或平衡型的胚胎（指受精卵中2條不同源的染色體各發生斷裂后，互相變位重接而形成兩條結構上重排的染色體，這種易位大多數保留了原有基因總數，對基因作用和個體發育一般無嚴重影響）。

1.5 觀察指標 分別比較臨床妊娠組與種植失敗組以及活產亞組與流產亞組的臨床資料，包括年齡、BMI、不孕年限、不孕因素、既往流產次數（分為＜2次和≥2次）、內膜厚度、基礎FSH、基礎LH、LH/FSH、TSH、TC、TG、HDL-C、LDL-C、FINS、FPG、CA125、25-（OH）D等一般情況，及促排卵、胚胎發育情況，包括促性腺激素藥物（gonadotropins，Gn）天數、Gn用量、第2次減數分裂中期（MII）卵率（MII卵數/取卵數）、受精率（受精數/MII卵數）、卵裂率（卵裂數/受精數）、D3優質胚胎數、胚胎活檢正常率（活檢胚胎正常個數/活檢胚胎總數）。

1.6 統計學方法 采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析。非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗；計數資料以相對數表示，兩組間比較采用χ2檢驗；將單因素分析中P＜0.1的變量納入多因素Logistic回歸分析探討PGT患者發生種植失敗及流產的影響因素；繪制受試者工作特征（ROC）曲線探討多因素Logistic回歸分析篩選出的危險因素對PGT患者發生種植失敗及流產的預測價值，并計算靈敏度、特異度、約登指數。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床妊娠組和種植失敗組患者臨床資料比較 種植失敗組年齡、BMI、既往流產次數≥2次占比、TG水平高于臨床妊娠組，HDL-C水平、D3優質胚胎數低于臨床妊娠組，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組患者不孕年限、不孕因素占比、內膜厚度、基礎FSH、基 礎 LH、LH/FSH、TSH、TC、LDL-C、FINS、FPG、CA125、25-（OH）D、Gn天數、Gn用量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。臨床妊娠組MII卵率83.00%（3 311/3 989），受精率81.55%（2 700/3 311），卵裂率95.30%（2 573/2 700），胚胎活檢正常率33.33%（472/1 416）；種植失敗組MII卵率81.93%（1 600/1 953），受精率83.19%（1 331/1 600），卵裂率91.96%（1 224/1 331），胚胎活檢正常率31.04%（219/625）；兩組MII卵率、受精率、卵裂率、胚胎活檢率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

效果分為顯效、有效以及無效3個等級，顯效是指患者治療后的臨床癥狀明顯改善，透析過程中無低血壓發生；有效是指患者的臨床癥狀有所緩解，收縮壓在透析的過程中基本正常；無效則為患者在治療的過程中臨床癥狀和體征無明顯好轉，并出現低血壓[5]。

表1 臨床妊娠組與種植失敗組患者臨床資料比較Table 1 Clinical data and examination findings in women with clinical pregnancy and implantation failure after preimplantation genetic testing assisted reproduction

2.2 活產亞組和流產亞組臨床資料比較 流產亞組患者既往流產次數≥2次占比以及FINS水平高于活產亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）。兩組年齡、BMI、不孕年限、不孕因素占比、內膜厚度、基礎FSH、基礎 LH、LH/FSH、TSH、TC、TG、HDL-C、LDL-C、FPG、CA125、25-（OH）D、Gn天 數、Gn用 量、D3優質胚胎數比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2?；町a亞組MII卵率82.97%（2 679/3 229），受精率81.56%（2 185/ 2 679），卵裂率95.10%（2 078/2 185），胚胎活檢正常率35.32%（403/1 141）；流產亞組MII卵率83.16%（632/760），受精率81.49%（515/632），卵裂率96.12%（495/515），胚胎活檢正常率25.09%（69/275）；兩組MII卵率、受精率、卵裂率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），活產亞組胚胎活檢正常率高于流產亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表2 活產亞組與流產亞組患者臨床資料比較Table 2 Clinical data in the live birth subgroup and abortion subgroup

2.3 PGT患者種植失敗的影響因素分析 以臨床妊娠結局（賦值：種植失敗=0，臨床妊娠=1）為因變量，以單因素分析中P＜0.1的變量（既往流產次數賦值：＜2次 =0，≥ 2次 =1；年齡、BMI、TG、HDL-L、Gn用量、D3優質胚胎數均為實測值）為自變量，納入多因素Logistic回歸分析，結果顯示，低Gn用量是PGT患者種植失敗的保護性因素（P＜0.05），既往流產次數≥2次和低HDL-C水平是PGT患者種植失敗的危險因素（P＜0.05），見表3。

表3 PGT患者種植失敗影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 3 Multivariate Logistic regression analysis of risk factors for implantation failure after preimplantation genetic testing assisted reproduction

2.4 PGT患者流產的影響因素分析 以活產結局（賦值：流產=0，活產=1）為因變量，以單因素分析中P＜0.1的變量（既往流產次數賦值：＜2次=0，≥2次=1；FINS、胚胎活檢正常率均為實測值）為自變量納入多因素Logistic回歸分析，結果顯示，低FINS水平是PGT患者流產的保護因素（P＜0.05），既往流產次數≥2次和低胚胎活檢正常率是PGT患者流產的危險因素（P＜0.05），見表4。

表4 PGT患者流產影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 4 Independent risk factors for live birth outcomes identified by multivariate logistic regression analysis

2.5 既往流產次數≥2次，HDL-C水平、Gn用量對PGT患者發生種植失敗的預測價值 繪制既往流產次數≥2次，HDL-C水平以及Gn用量預測PGT患者發生種植失敗的ROC曲線，結果顯示，既往流產次數≥2次、HDL-C水平以及Gn用量預測PGT患者發生種植失敗的曲線下面積（AUC）分別為0.650、0.579、0.561，靈敏度分別為70.3%、33.3%、60.4%，特異度分別為59.6%、80.3%、56.9%，約登指數分別為0.299、0.136、0.173，見圖1。

圖1 既往流產次數≥2次、HLD、Gn用量預測PGT患者發生種植失敗的ROC曲線Figure 1 ROC curves of two or more previous abortions，serum HDL-C level，and dosage of Gn for predicting implantation failure after preimplantation genetic testing assisted reproduction

2.6 既往流產次數≥2次、FINS水平以及胚胎活檢正常率對PGT患者發生流產的預測價值 繪制既往流產次數≥2次、FINS水平以及胚胎活檢正常率預測PGT患者發生流產的ROC曲線，結果顯示，既往流產次數≥2次、FINS水平以及胚胎活檢正常率預測PGT患者發生流產的AUC分別為0.648、0.629、0.641，靈敏度分別為66.2%、72.1%、65.1%，特異度分別為63.4%、52.6%、60.6%，約登指數分別為0.296、0.247、0.257，見圖2。

圖2 既往流產次數≥2次、FINS、活檢正常率預測PGT患者發生流產的ROC曲線Figure 2 ROC curves of two or more previous abortions，fasting insulin level，and normal rate of embryo biopsy for predicting abortion after preimplantation genetic testing assisted reproduction

3 討論

PGT是一種與體外受精相結合的方法，可在胚胎移植至母體之前檢測胚胎中基因情況。因此，PGT技術可以確保被移植的胚胎沒有可檢測到的遺傳畸變。隨著該技術近年來的發展，將PGT分為PGT-M、PGT-A、PGT-SR 3種，PGT-M可以用來檢測胚胎植入前單基因遺傳病，可以識別胚胎中家族攜帶的致病突變，并移植沒有這種致病突變的胚胎，有效降低后代出現相關遺傳疾病的發生率；PGT-A可以檢測胚胎植入前染色體非整倍體，可以篩選出胚胎中染色體正常的胚胎，移植至母體可以有效降低流產、異常妊娠和植入失敗的風險；PGT-SR檢測胚胎植入前染色體結構異常，主要應用于染色體疾病的檢測，包括染色體整倍體或非整倍體的數目異常，如克氏綜合征（47，XXY）、21-三體綜合征（47，XN，+21）等，以及缺失、重復、易位、倒位的染色體結構異常。PGT技術具有極高的準確性和穩定性［4］。本研究分析了PGT患者的一般情況促排卵及體外胚胎發育情況后發現，低Gn用量是PGT患者種植失敗的保護性因素，既往流產次數≥2次、HDL-C低是PGT患者種植失敗的危險因素。低FINS是PGT患者流產的保護性因素，既往流產次數≥2次、低活檢正常率是PGT患者流產的危險因素。

有不良妊娠史的患者應用PGT技術的治療效果尚未形成統一定論。有研究表明，應用PGT技術可以改善既往流產次數≥2次患者的妊娠結局，降低流產率及出生缺陷的風險［5］。而最新的一項臨床隨機對照試驗表明，PGT并不能提高由于胚胎異常及反復植入失敗導致的反復妊娠丟失（既往流產次數≥2次）患者的胚胎活產率［6］。本研究結果顯示，臨床妊娠組與種植失敗組以及活產組與流產組在既往流產次數≥2次的占比中存在差異，既往流產次數≥2次是PGT患者發生種植失敗及流產的危險因素，既往流產次數≥2次預測PGT患者發生種植失敗及流產的AUC分別為0.650、0.648，靈敏度分別為70.3%、66.2%，特異度分別為59.6%、63.4%，約登指數為0.299、0.296。PGT可以篩選優質胚胎移植入子宮，但不良妊娠史導致子宮內膜基底層損傷、蛻膜發育不良、胚胎著床異常、胎盤灌注不足等，最終依然可能導致再次妊娠失敗或流產［7-8］。

本研究結果顯示，種植失敗組Gn用量高于臨床妊娠組，低Gn用量是PGT患者發生種植失敗的保護性因素，Gn用量預測PGT患者發生種植失敗的AUC為0.561，靈敏度為60.4%，特異度為56.9%，約登指數為0.173。有研究表明，應用大劑量Gn會對卵泡顆粒細胞、卵母細胞造成損害，導致流產率升高，臨床妊娠率和活產率下降［9］；但也有研究標明，高齡患者對Gn的敏感性有所下降，獲得卵子更加困難，需要相應的增加促排卵期Gn用量［10］，同時增加Gn用量可以獲得更高比例形態、質量較好的胚胎［11］。本研究結果顯示種植失敗組年齡高于臨床妊娠組，且種植失敗組Gn用量高于臨床妊娠組，高齡患者應用Gn劑量高、流產率高，可能是患者年齡較高所致，并不能說明患者應用高劑量Gn是導致種植失敗的原因。雖然基礎研究證實，高劑量Gn會損傷卵母細胞［9］，但臨床上為獲得數量更多的卵子而采取應用高劑量Gn，適當應用高劑量Gn對于患者“利大于弊”。因此，應用高劑量外源性Gn對于輔助生殖結局的影響目前仍有討論空間，需要更多的臨床資料及基礎研究進一步探索。

臨床工作中，通過檢測TC、TG、LDL-C、HDL-C的水平來反應患者血脂代謝情況，以上任何一種指標出現異常均稱為血脂異常［12］。有研究指出，在細胞線粒體內，脂質水解產生ATP為卵母細胞和胚胎發育提供能量［13］。血脂異常會直接或者間接損害卵母細胞和胚胎，最終導致不良的妊娠結局［14］。本研究結果顯示，臨床妊娠組與種植失敗組的HDL-C存在明顯差異，低HDL-C水平是PGT患者發生種植失敗的危險因素。HDL-C預測PGT患者發生種植失敗的AUC為0.579，靈敏度為33.3%，特異度為80.3%，約登指數為0.136。相較于臨床妊娠組，種植失敗組患者的HDL-C更低。研究發現，卵泡液中HDL-C及其組成成分載脂蛋白A1對人類早期胚胎發育起保護作用［15］。HDL-C是復雜的多功能蛋白復合體，針對其研究多數在心血管方向，而HDL-C在生殖領域的研究相對匱乏。本研究為HDL-C在生殖領域的研究提供了參考依據。

本研究結果顯示，活產亞組與流產亞組的FINS水平存在統計學差異，低FINS水平是PGT患者發生流產的保護性因素，FINS預測PGT患者發生種植失敗的AUC為0.629，靈敏度為72.1%，特異度為52.6%，約登指數為0.247。相較于活產組，流產組FINS水平更高。研究表明，高胰島素血癥和胰島素抵抗的女性生育能力降低［16］。多項研究發現，高胰島素血癥患者的胚胎植入能力降低，胚胎植入后流產率高［17-19］，本文結果與之一致。在分子層面，胰島素水平較高，胚胎著床部位和子宮內膜蛻膜標志物內膜泌乳素和骨形態發生蛋白2、子宮內膜容受性、孕激素受體的數量明顯減少。胰島素水平升高損害了小鼠子宮內膜蛻膜化，破壞了在子宮內膜蛻膜化過程中細胞增殖和凋亡之間的平衡［20］。因此，應嚴密監測PGD患者孕前FINS情況，必要時及時干預，以增加活產的成功率。

在IVF-ET過程中，胚胎染色體異常目前仍是導致胚胎質量下降的關鍵因素，受精時，胚胎質量降低可導致卵母細胞在減數分裂過程中發生錯誤，導致胚胎種植失敗、胚胎停滯發育最終導致流產［21］。本研究結果顯示，相較于活產亞組，流產亞組胚胎活檢正常率更低；胚胎活檢正常率是PGT患者發生流產的危險因素；胚胎活檢正常率預測PGT患者發生流產的AUC為0.641，靈敏度為65.1%，特異度為60.6%，約登指數為0.257。研究表明，女性高齡［22］以及雙方染色體異常［23］等多種因素會降低胚胎活檢正常率，但并未具體闡明胚胎活檢正常率對臨床評估妊娠結局的應用價值。本研究納入了行PGT檢測的IVF-ET患者，分析發現胚胎活檢正常率與活產結局的相關性與預測活產結局的臨床價值，為臨床診治患者提供參考依據。

綜上所述，既往流產次數≥2次、HDL-C的水平、Gn用量是PGT患者種植失敗的影響因素且對PGT患者種植失敗的發生有一定的預測價值；既往流產次數≥2次、FINS的水平、胚胎活檢正常率是PGT患者流產的影響因素且對PGT患者流產的發生有一定預測價值。于種植胚胎前監測上述指標，對PGT患者制定合理個性化的用藥方案，提高臨床妊娠率及活產率，有一定參考意義。本研究的樣本數據非多中心系統性調查，故存在病例選擇的偏倚及信息偏倚，本課題組正積極與全國各中心交流合作，后續將進一步擴大樣本并驗證本研究結果。

作者貢獻：王博雅負責文章的構思、研究的設計、撰寫論文；王博雅、何英明、薛吟霜負責文獻、患者資料的收集、數據收集與整理；王博雅、何英明進行結果的分析與解釋；向卉芬對文章整體負責，負責論文的可行性分析、修訂、文章的審查及監督。

本文無利益沖突。