蜜蜂遺傳育種新技術(shù)（四）
——基因芯片主要技術(shù)流程與應(yīng)用

薛運(yùn)波│文

基因芯片又叫DNA 芯片、DNA 微陣列，是在DNA 雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的、高通量的基因克隆與雜交信號間一對一的對應(yīng)識別技術(shù)。它是將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段有序地、高密度地排列固定于介質(zhì)載體上，以待測的核酸分子樣品為探針，經(jīng)過熒光、生物素等發(fā)光信號元素或基團(tuán)的標(biāo)記，與固定在載體上的DNA 陣列中的點(diǎn)按照堿基配對原理同時進(jìn)行雜交。通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片加以掃描，檢測雜交信號強(qiáng)度（圖1），獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息，再用計(jì)算機(jī)軟件處理分析數(shù)據(jù)，從而對基因序列及功能進(jìn)行大規(guī)模、高通量的研究。

圖1 核酸雜交設(shè)備（薛運(yùn)波 李興安 攝）

1.基因芯片主要技術(shù)流程

基因芯片技術(shù)的主要流程包括芯片的設(shè)計(jì)與制備、靶基因的標(biāo)記、芯片的雜交與信號檢測。基因芯片的設(shè)計(jì)是指芯片上核酸探針序列的選擇以及排布，設(shè)計(jì)方法取決于其應(yīng)用目的。目前的應(yīng)用范圍主要包括基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄圖譜分析及靶序列中單堿基多態(tài)位點(diǎn)（SNPs）或突變點(diǎn)的檢測。

基因芯片的制備方法主要包括點(diǎn)樣法和原位合成法兩種類型：

（1）點(diǎn)樣法：首先是探針庫的制備，根據(jù)基因芯片的分析目標(biāo)，從相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫中選取特異的序列，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增或直接人工合成寡核苷酸序列，然后通過計(jì)算機(jī)控制的三坐標(biāo)工作平臺，用特殊的針頭和微噴頭，分別把不同的探針溶液逐點(diǎn)分配在玻璃、尼龍等載體表面的不同位點(diǎn)上，采用物理的和化學(xué)的方法使之固定。

（2）原位合成法：在玻璃等硬質(zhì)載體表面上直接合成寡核苷酸探針陣列（圖2）。主要有光去保護(hù)并行合成法、壓電打印合成法等，其關(guān)鍵是高空間分辨率的模板定位技術(shù)和高合成產(chǎn)率的DNA 化學(xué)合成技術(shù)，適合制作大規(guī)模DNA 探針芯片，實(shí)現(xiàn)高密度芯片的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)模化生產(chǎn)。

圖2 核酸純化設(shè)備（薛運(yùn)波 李興安 攝）

樣品的制備是基因芯片實(shí)驗(yàn)流程的一個重要環(huán)節(jié)。靶基因在與芯片探針雜交之前必須進(jìn)行分離、擴(kuò)增與標(biāo)記。標(biāo)記的方法根據(jù)樣品來源、芯片類型和研究目的的不同而有所差異。通常是在待測樣品的PCR擴(kuò)增、逆轉(zhuǎn)錄或體外轉(zhuǎn)錄過程中實(shí)現(xiàn)對靶基因的標(biāo)記。

基因芯片與靶基因的雜交過程，與一般分子雜交的過程基本相同。雜交反應(yīng)的條件，要根據(jù)探針的長度、G+C 含量及芯片類型確定。用于基因表達(dá)檢測的芯片雜交嚴(yán)格性較低，而用于突變檢測的芯片雜交條件相對嚴(yán)格。如果是用同位素標(biāo)記靶基因，其后的信號檢測即是放射自顯影。若用熒光標(biāo)記，則需要一套熒光掃描及分析系統(tǒng)作為設(shè)備支持。

2.基因芯片的應(yīng)用

目前，基因芯片被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)圖譜的繪制。近年來，隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展和成熟，已經(jīng)成功構(gòu)建了一些昆蟲抗性相關(guān)基因芯片，并投入對昆蟲抗藥性的研究（圖3）。Shen 等構(gòu)建了淡色庫蚊的細(xì)胞色素P450 基因芯片，對24 個CYP4 家族基因在淡色庫蚊抗性和敏感品系中的差異表達(dá)進(jìn)行檢測。Le Goff 等也構(gòu)建了一個黑腹果蠅的細(xì)胞色素P450 基因芯片，對抗不同殺蟲劑的果蠅的基因表達(dá)變化進(jìn)行研究。Wu 等和David 等也都構(gòu)建了不同的基因芯片，并對淡色庫蚊和岡比亞按蚊的抗藥性進(jìn)行研究。這些基因芯片在昆蟲抗藥性研究中的應(yīng)用，為了進(jìn)一步揭示昆蟲對殺蟲劑的抗性機(jī)制，系統(tǒng)地理解不同的抗性相關(guān)基因之間的聯(lián)系及其相互作用提供理論依據(jù)。美國伊利諾伊州大學(xué)Charlse 等人研究內(nèi)勤蜂和外勤蜂：他們用含有大約5500 個基因的DNA芯片檢測這兩種蜜蜂的大腦組織提取物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，內(nèi)勤蜂與外勤蜂之間的基因表達(dá)是不相同的，而不同的內(nèi)勤蜂或不同的外勤蜂之間，其基因表達(dá)則非常相似。研究表明，基因和行為之間的聯(lián)系程度比以前所認(rèn)識到的更加密切。該研究結(jié)果將有助于發(fā)現(xiàn)開啟特定行為的主要基因。

圖3 核酸質(zhì)譜設(shè)備（薛運(yùn)波 李興安 攝）

基因芯片技術(shù)的發(fā)展勢頭十分迅猛，在基因表達(dá)譜分析、基因診斷、藥物篩選及序列分析等諸多領(lǐng)域已得到廣泛地應(yīng)用，取得大量的數(shù)據(jù)和研究結(jié)果，呈現(xiàn)出廣闊的研究、開發(fā)與應(yīng)用前景。但是該方法也存在不足之處，首先是基因芯片檢測技術(shù)成本高，其次，該技術(shù)只能從基因突變和基因表達(dá)差異方面給予檢測結(jié)果，尚不能根據(jù)分子檢測結(jié)果對生物體的表型和功能做出整體評估。雖然基因芯片技術(shù)還存在一些不足，但是隨著研究的不斷深入和技術(shù)的不斷完善，基因芯片一定會在蜜蜂科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。