6 種蜂蜜的抗氧化和抑菌活性研究

張國志 李珊珊 鄭火青 胡福良

（浙江大學動物科學學院，杭州 310058）

近年來，隨著抗生素的濫用，越來越多的細菌產(chǎn)生耐藥性，這對全世界公共衛(wèi)生是一個巨大的挑戰(zhàn)。蜂蜜復雜的化學成分使得其具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗腫瘤等多種生物學活性[1]。多項研究表明蜂蜜可以作為一種替代或補充的抑菌方法[2-4]。

蜂蜜的化學成分受植物來源、地理來源、蜂種來源、氣候條件、加工方式等因素影響[5,6]。正因如此，蜂蜜可以作為一種強大的抗菌劑，甚至其抑菌和殺菌作用可以媲美抗生素[5,7,8]。研究表明過氧化氫是大多數(shù)蜂蜜的主要抑菌成分[9]，過氧化氫通過解離出具有高活性的羥基自由基抑制微生物的生長。蜂蜜中過氧化氫是葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖過程產(chǎn)生的，此外多酚自氧化等也可產(chǎn)生過氧化氫[10]。除過氧化氫外，蜂蜜的滲透壓、pH、酚酸、黃酮、王漿主蛋白、抗菌肽、丙酮醛等也是蜂蜜發(fā)揮抑菌作用的因素[11]。Zhang等[12]研究國產(chǎn)9 種蜂蜜的抗氧化和抑菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茴香蜜、藿香蜜和石榴蜜抗菌和抗氧化活性均較好，具有進一步開發(fā)的潛力。Anand[13]等研究表明藿香蜜在40%濃度下具有良好的抑制白色念珠菌及皮膚真菌的作用。目前研究表明沙棗蜜[14]、神農(nóng)架蜂蜜[15]、石榴蜜[16]和蘋果蜜[17]均具有良好的抗氧化活性，但是缺少抑菌活性的評價。

我國幅員遼闊，蜜粉源植物豐富，蜜蜂采集植物的花蜜或分泌物并經(jīng)充分釀造后形成了各具特色的蜂蜜。本研究收集國內(nèi)6 種不同植物來源的蜂蜜，通過測定蜂蜜樣品的抗氧化能力以及蜂蜜樣品對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和大腸桿菌（Escherichia coli）的抑菌效果，以期發(fā)掘具有良好抑菌活性的蜂蜜，為特色蜂蜜的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究共收集6 種不同植物來源的蜂蜜，具體信息見表1。所有蜂蜜樣品避光保存在-20℃冰箱直至分析。

表1 蜂蜜樣品的采集信息

S.aureusATCC 29213、E.coliATCC 25922（上海北諾生物科技有限公司），沒食子酸、福林酚（上海麥克林生化科技有限公司），無水碳酸鈉、氯化鈉、可溶性淀粉、碘化鉀、乙酸（國藥集團化學試劑有限公司），DPPH（Sigma 公司），總抗氧化能力檢測試劑盒（FRAP 法）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），過氧化氫定量分析試劑盒（水兼容性）、LB 肉湯培養(yǎng)基［生工生物工程（上海）股份有限公司］，營養(yǎng)瓊脂（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

手持式折射儀（北京萬成北增精密儀器有限公司，WZ-116ATC），pH 計［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，EL20］，島津分光光度計（日本島津有限公司，UV-2550），全波長酶標儀（美國伯樂公司，Model 550），氣浴恒溫振蕩器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，THZ-92A）。

1.3 試驗方法

1.3.1 基本理化指標

在室溫下，用手持式折射儀測定蜂蜜樣品的含水量。準確稱取20.0g 蜂蜜樣品并用蒸餾水定容至100mL，在20℃用電導儀測定其電導率，結(jié)果用 μS/cm表示[18]。準確稱取10.0g 蜂蜜樣品，溶解在75mL 蒸餾水中，在25℃用pH 計測定樣品的pH 值[19]。采用分光光度法測定蜂蜜中淀粉酶活性，將淀粉溶液和蜂蜜緩沖溶液在40℃水浴，淀粉酶活性表示為1g 蜂蜜在1h內(nèi)水解1%淀粉的毫升數(shù)，單位用mL/(g·h)表示[20]。蜂蜜中蛋白質(zhì)含量的測定參考Zhang 的方法[21]，用牛血清白蛋白作為標準。

1.3.2 總酚含量

采用福林酚（Folin-Ciocalteu）比色法[22]測定蜂蜜總酚含量。取0.5mL 蜂蜜溶液（0.2g/mL）與2.5mL 福林酚試劑（0.2mol/L）混勻靜置5 min，然后加入2mL 的Na2CO3溶液（0.1g/mL）并定容至10mL，避光靜置反應2h 后，在波長725nm 處測定吸光度值。以蒸餾水為空白對照，以沒食子酸含量（0.04～0.24mg/mL）為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果表示為每100g 蜂蜜中沒食子酸標準品當量（mg GAE/100g）。

1.3.3 抗氧化能力測定

1.3.3.1 DPPH 自由基清除能力測定

參考Turkmen[23]的方法，并做適當修改。將100μL 蜂蜜樣品溶液（0.2g/mL）與100μL DPPH 乙醇溶液（0.08mg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用）混合均勻，室溫下避光反應 30min，于 517nm 波長處測定吸光度。以維生素C 濃度（5～50μg/mL）為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果表示為mg Vc/100g。

1.3.3.2 ABTS+·自由基清除能力測定

將7.5mL 7mmol/L ABTS 溶液和132μL 140mmol/L 過硫酸鉀溶液室溫避光反應16h，制得ABTS 母液。在使用前，把ABTS 母液用蒸餾水稀釋成ABTS 工作液（要求ABTS 工作液吸光度減去相應的蒸餾水空白對照后，A734 為0.7±0.05）。取5μL 蜂蜜樣品溶液（0.2g/mL）加入200μL ABTS 工作液，空白對照加入5μL 蒸餾水。室溫避光孵育6min 后測定734nm 處的吸光度值。以Trolox 溶液（0.1～1.3mM）為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果表示為每kg蜂蜜中Trolox 當量（mmol Trolox/kg）。

1.3.3.3 鐵離子還原/抗氧化能力（FRAP）的測定

采用總抗氧化能力檢測試劑盒（FRAP 法）檢測蜂蜜抗氧化能力。5μL 0.2g/mL 蜂蜜溶液中加入180μL FRAP 工作液，37℃孵育5min 后，在593nm測定吸光度。以Trolox 溶液（0.05～1.3mM）為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果表示為每kg蜂蜜中Trolox 當量（mmol Trolox/kg）。

1.3.4 抑菌能力測定

1.3.4.1 瓊脂擴散法

參考Zhang[12]的方法并適當修改。用滅菌的蒸餾水稀釋蜂蜜樣品至50%（w/v）。將25mL 的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基鋪于75mm 的培養(yǎng)皿中，待冷卻凝固后，使用LB 肉湯培養(yǎng)基將菌液稀釋至1×106CFU/mL，每培養(yǎng)板涂布100μL 稀釋后的菌液。使用打孔器于培養(yǎng)基上均勻打四個孔（直徑為8mm），然后在孔中加入150μL 待測蜂蜜稀釋液或陰性對照（無菌水）、陽性對照（10%苯酚溶液），并將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中正置37℃培養(yǎng)18h，最后使用游標卡尺以十字交叉法測量抑菌圈的直徑（mm）。

1.3.4.2 肉湯稀釋法

采用肉湯稀釋法測定蜂蜜樣品的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）[12,24]。

用LB 肉湯培養(yǎng)基配置不同濃度的蜂蜜樣品（50%、25%、20%、12.5%、10%、6.25%、5%、3.125%、2.5%、1.25%），并將菌液稀釋至1×106CFU/mL。被測蜂蜜溶液和菌液按9∶1 的比例混合，100μL 混合液體加入96 孔細菌培養(yǎng)板（空白組以培養(yǎng)基代替蜂蜜溶液），并在600nm 處測定吸光度，記為T0。然后將培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)24h，取出測其600nm 處的數(shù)值記為T18。細菌的抑制率公式為:抑制率/%=1-(實驗組T24-實驗組T0)/ (空白組T24-空白組T0) ×100%。

取MIC 試驗中無細菌生長的20μL 懸液在營養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)，37℃孵育24h，無細菌生長的最低濃度為MBC。

1.3.5 過氧化氫含量測定

參考zhang[12]的方法，配置50%（w/v）的蜂蜜溶液用過氧化氫定量分析試劑盒（水兼容性）測定蜂蜜中過氧化氫的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有蜂蜜樣品均測定3 個平行，結(jié)果以平均值（Mean）±標準差（SD）表示。采用Tukey 檢驗法分析各組數(shù)據(jù)間的差異顯著性（p ＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 基本理化指標分析

表2 顯示6 種蜂蜜的基本理化指標。含水量是蜂蜜質(zhì)量中的一個重要參數(shù)，與蜂蜜的發(fā)酵、成熟度和結(jié)晶有關(guān)[25,26]。本研究中蜂蜜的含水量為15.93%～19.50%，均符合歐盟[27]和食品法典委員會[28]的規(guī)定（＜20%）。蜂蜜的pH 值影響其口感、穩(wěn)定性和保質(zhì)期[29]。本研究中蜂蜜的pH 值為3.66～4.62。從表2 可以看出，神農(nóng)架蜂蜜具有最高的pH 值（4.62±0.01）。蜂蜜的電導率與灰分和酸度相關(guān)[29]。除神農(nóng)架蜂蜜外，本研究中其他蜂蜜的電導率均符合標準[27,28]規(guī)定的蜂蜜的電導率不超過0.8mS/cm。試驗測得6 種蜂蜜的總蛋白含量為4.06～6.65mg/g，其中蒲公英蜜的總蛋白含量顯著高于其他5 種蜂蜜（p＜0.05）。蜂蜜的總蛋白含量主要與蜂蜜的釀造時間和釀造程度有關(guān)[30]。淀粉酶常被用來表征蜂蜜的新鮮度及加工程度[31]。本研究中6 種蜂蜜的淀粉酶值為13.55～37.07mL/(g·h)，均達到相關(guān)標準[27,28]規(guī)定的不低于8mL/(g·h)。沙棗蜜的淀粉酶活性顯著高于其他5 種蜂蜜（p＜0.05）。

表2 蜂蜜樣品的基本理化指標

2.2 總酚含量及抗氧化能力分析

研究表明蜂蜜的總酚含量與其抗氧化能力明顯相關(guān)[32]。6 種蜂蜜的總酚含量和抗氧化能力見表3。本研究中所有蜂蜜樣品的總酚含量為128.64～360.40mg GAE/kg，其中神農(nóng)架蜂蜜的總酚含量（360.40±6.36mgGAE/kg）顯著高于其他5 種蜂蜜。不同種類的蜂蜜的總酚含量具有明顯差異，這主要與蜜蜂采集的蜜源植物有關(guān)[15]。DPPH 自由基、ABTS+·自由基清除能力和FRAP 總抗氧化活性是3 種常用來評估蜂蜜體外抗氧化能力的方法，且這3 種方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性均良好[32,33]。DPPH 自由基清除實驗表明神農(nóng)架蜂蜜具有最高的抗氧化活性（13.14mg Vc/100g），其次是蘋果蜜（10.45mg Vc/100g）。6 種蜂蜜對ABTS+·自由基的清除能力最高的是神農(nóng)架蜂蜜，蘋果蜜的抗氧化能力顯著高于狼牙刺蜜和石榴蜜。FRAP 總抗氧化能力測定結(jié)果顯示神農(nóng)架蜂蜜的抗氧化能力最高（0.92±0.07mmol Trolox/kg），其次是蘋果蜜（0.78±0.04mmol Trolox/kg）和蒲公英蜜（0.33±0.01mmol Trolox/kg）。3 種抗氧化能力評價方法得出的結(jié)果基本一致，即神農(nóng)架蜂蜜的抗氧化活性最好，蘋果蜜次之。

表3 蜂蜜樣品的總酚含量以及抗氧化活性

2.3 抑菌活性及過氧化氫含量分析

我們采用瓊脂擴散法和肉湯稀釋法來評價蜂蜜對S.aureus和E.coli的抑菌能力并且測定了蜂蜜中過氧化氫的含量。瓊脂擴散試驗（表4）表明所有蜂蜜樣品均未對E.coli產(chǎn)生抑菌圈，而對S.aureus都產(chǎn)生了超過11mm 的抑菌圈。Zhang 等[12]研究結(jié)果同樣表明9 種單花蜜均未對E.coli產(chǎn)生抑菌圈，對S.aureus則均產(chǎn)生明顯的抑菌圈，造成這種差異的原因可能是由于兩種細菌細胞壁的組成不同。不同植物源蜂蜜對S.aureus的抑菌能力不同，蘋果蜜（16.87±0.80 mm）和神農(nóng)架蜂蜜（16.31±0.74mm）產(chǎn)生的抑菌圈顯著高于其他4 種蜂蜜（p＜0.05），沙棗蜜、狼牙刺蜜和石榴蜜抑菌圈無顯著差異，產(chǎn)生最小抑菌圈的則是蒲公英蜜（11.08±0.21mm）。6 種蜂蜜的H2O2含量為159.10～482.28μmol/g，沙棗蜜（482.28±25.56μmol/g）的過氧化氫含量顯著高于其他蜂蜜（p＜0.05），其次是神農(nóng)架蜂蜜（388.16±8.73μmol/g），而蒲公英蜜、蘋果蜜、狼牙刺蜜和石榴蜜差異不顯著。我們研究中沙棗蜜的H2O2含量最高，但是其抑菌能力卻并不是最好的，類似的蘋果蜜的抑菌活性最高，但是其H2O2含量卻并不高。Bucekova 等[34]研究同樣表明在某些情況下，蜂蜜樣品表現(xiàn)出高抗菌活性，同時生成低水平的H2O2，反之亦然。雖然H2O2是蜂蜜的主要抑菌成分，但是總的抑菌效果還受滲透壓、酸度、pH、多酚、黃酮、抗菌肽、王漿主蛋白等因素的影響[11]。由于蜂蜜的成分復雜，各成分的抑菌效果及其相互的作用機制目前還不清楚[35]。

表4 蜂蜜樣品的抑菌活性和過氧化氫含量

肉湯稀釋法（表5）結(jié)果表明蘋果蜜對S.aureus的MIC（MIC50：0～1.25% w/v，MIC90：3.125%～5% w/v）和MBC（3.125%～5% w/v）最低，而石榴蜜相比其他蜂蜜對于E.coli的MIC（MIC50：2.5%～3.125% w/v，MIC90：12.5%～20% w/v）最低。MIC 和MBC 結(jié)果表明蜂蜜對革蘭氏陽性菌的抑制效果比革蘭氏陰性菌更好，這與Goslinski 研究的結(jié)論一致[36]。

表5 蜂蜜樣品對S.aureus和E.coli的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

3 結(jié)論

本研究收集國產(chǎn)6 種特色蜂蜜，并對其基本理化指標、抗氧化和抑菌活性進行測定和分析。結(jié)果表明，不同植物來源的蜂蜜的抗氧化和抑菌活性有明顯差異，蜂蜜的抗氧化活性與總酚含量有關(guān)，其中神農(nóng)架蜂蜜的總酚含量和抗氧化活性最高，蘋果蜜對S.aureus的MIC（MIC50：0～1.25% w/v，MIC90：3.125%～5%w/v）和MBC（3.125%～5% w/v）最低，而石榴蜜對E.coli的MIC（MIC50：2.5%～3.125% w/v，MIC90：12.5%～20% w/v）最低。對不同植物來源蜂蜜的品質(zhì)和活性評價，為進一步開發(fā)特色蜂蜜奠定良好基礎(chǔ)。