基于PI3K/AKT/Gsk3β/p53信號通路探究解毒益智方對Aβ25-35 誘導PC12細胞神經毒性保護作用機制

馮麗娜，溫 泉，王 杰，王 琦，張馨月，黎明全，王慶偉*

（1.長春中醫藥大學中醫學院，長春 130117；2.長春中醫藥大學附屬第三臨床醫院腦病科，長春 130117；3.長春中醫藥大學中西醫結合學院，長春 130117）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD），是一種起病隱匿的神經退行性病變，現已成為全世界重要的公共衛生問題，居世界死亡原因第五位[1]。中國、印度及拉丁美洲地區阿爾茨海默病的患病率正快速增長[2]，預計到2040年，中國、印度等國家增長速度約為自身3倍[3]。但該病的發病機制尚未完全透徹，多種假說鼎足而立，其中最廣為科學研究者研究的發病機制之一是淀粉樣蛋白前體（amyloid precursor protein，APP）經水解后可產生對神經細胞有毒性的Aβ25-35肽段即“β淀粉樣蛋白學說”。課題組傳承國醫大師任繼學教授的“腦髓理論”，結合《靈樞·大惑論》內容，同時綜合李杲、葉天士等先賢的醫學理論[4]，創新提出“髓虛毒損”是阿爾茨海默病的病機關鍵，認為腎精不足，腦髓失養，加之瘀血內阻，脂膏壅塞，水津血互滲，聚為痰涎，與瘀血互阻，毒自內生，毒邪損害，神機失用。故應用“上下交損，當治其中”治療理念，確立解毒益智方。

解毒益智方由川芎、黃連、益智仁、龜板膠、地龍、山茱萸、酒大黃7味藥組成。課題組前期證實，運用解毒益智方治療非癡呆型血管性認知功能障礙（ⅤCIND）72例患者6個月后，MMSE、MOCA、ADL評分變化明顯優于對照組（口服尼莫地平片）[5]。前期亦證實，解毒益智方中黃連多糖（Coptis chinensis polysaccharide，CCP）通過抑制MAPK/JNK信號通路，對Aβ25-35誘導的PC12細胞神經毒性起到保護作用[6]。且黃連多糖可明顯延長阿爾茨海默病模型線蟲（CL4176線蟲）壽命、抑制線蟲頭部Aβ肽聚集，從而對抗神經毒性[7]。本實驗用Aβ25-35誘導的PC12細胞構建阿爾茨海默病模型，通過觀測給予解毒益智方低、中、高劑量前后細胞活力及PI3K、p-Akt、GSK3β、p53蛋白表達情況，探討解毒益智方對Aβ25-35誘導的PC12細胞神經毒性的保護作用。

1 材料與方法

1.1 PC12細胞與解毒益智方含藥血清制備 腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞（PC12細胞），購買于中科院上海細胞庫。解毒益智方及含藥血清的制備：解毒益智方由黃連、益智仁、川芎、山茱萸、酒大黃、地龍、龜板膠按比例1:2:1:1:1:1:1組成，飲片由長春中醫藥大學附屬第三臨床醫院藥學部提供。將方中所有藥物浸泡30 min后，煎煮1 h并提取藥液，如此反復操作2次，合并藥液并濃縮至濃度為1.67 g/mL制成凍干粉備用。選取200～280 g Spargue Dawley（SD）大鼠30 只[遼寧長生生物技術有限公司 SCXK（遼）提供：2020-001]，根據體表面積折算后，最終按16.67 g/（kg·d），稱重后以1 mL/100 g進行連續灌胃7 d，進行腹主動脈采血制備含藥血清，經離心及高壓滅菌后置于-20 ℃冰箱備用。

1.2 實驗試劑 Aβ25-35 淀粉樣β蛋白片段（Sigma：A4559-1MG）；胎牛血清FBS（Gibco：10099-141）；DMEM培養基（Gibco：10569010）；磷酸鹽緩沖液PBS（Gibco：10010023）；MTT（上海碧云天：ST1537-5g）；胰酶細胞消化液EDTA（上海碧云天：C0205）；二甲基亞砜DMSO（北京索萊：67-68-5）；青霉素-鏈霉素（Gibco公司：15140163）。鼠抗PI3K、兔抗P-Akt、鼠抗p53、兔抗Gsk-3β蛋白、兔抗GAPDH、HRP標記山羊抗兔IgG、HRP標記山羊抗 鼠IgG（CST：13666S；40060S；2524S；12456T；5174S；8884S；51332S）。

1.3 細胞培養與凍存 將凍存管置于37 ℃水浴鍋融化PC12細胞后，1:2加DMEM培養基，將液體吸出置于5 mL離心管，以1 000 r/min離心5 min后棄上清，加培養基（90% DMEM加10%FBS加1%雙抗）重懸，轉置于25 cm2培養瓶后，于37 ℃ 5% CO2培養箱孵育，24 h更換培養基。取對數期細胞進行1:2傳代。對數期細胞消化離心后，按1:2凍存，凍存液為DMSO:FBS按照1:9進行配制，液氮保存。

1.4 實驗分組與Aβ25-35制備 實驗分為空白組、模型組、解毒益智方低劑量組、中劑量組、高劑量組。Aβ25-35配制：1 mg Aβ25-35粉末溶于0.943 mL超純水，獲得濃度為100 μmol/L，分裝于1.5EP管中置于37 ℃ 5%CO2培養箱孵育7 d，老化后取出，-80 ℃備用。

1.5 MTT法對大鼠含藥血清濃度及Aβ25-35最佳誘導濃度確定 將對數期PC12細胞胰酶消化、離心、棄上清后，加入2 mL培養基吹勻。吸取10 μL注入細胞計數板進行計數，按每孔1×104進行均勻鋪板。次日在細胞密度約為60%時，棄原培養基加入新培養基（10%不同濃度大鼠含藥血清加90%DMEM加2%雙抗），培養24 h后每孔加入20 μL MTT孵育4 h，吸除每孔液體后加入150 μL DMSO，37 ℃搖床震蕩10 min，置于酶標儀中，設置波長490 nm，根據測定吸光度值（OD值）進行細胞增殖率測定。Aβ25-35損傷濃度確定及損傷時間操作同上。

1.6 PC12細胞形態學觀察 鋪板操作同上，將PC12細胞按密度1×104接種于24孔板，培養24 h后待細胞密度約為60%時進行給藥及造模處理。分為空白組（空白血清）、模型組（空白血清加Aβ25-35）、解毒益智方低劑量組（低劑量含藥血清加Aβ25-35）、解毒益智方中劑量組（中劑量含藥血清加Aβ25-35）及解毒益智方高劑量組（高劑量含藥血清加Aβ25-35）。先后孵育48 h后，于倒置相差顯微鏡下觀察拍照。

1.7 解毒益智方對PC12細胞中PI3K、p-Akt、GSK3β、p53蛋白表達的影響 將不同組細胞收集、裂解以提取蛋白，12 000 r/min離心5 min后收集上清。BCA試劑盒進行蛋白定量，加入上樣緩沖液煮沸變性。10%SDS-PAGE電泳分離，PⅤDF膜轉膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗滌后按說明書稀釋加入一抗PI3K（1:1 000）、p-Akt（1:500）、GSK3β（1:1 000）、p53（1:1 000）、GAPDH（1:5 000），4 ℃孵育搖床過夜。TBST洗滌后加入二抗，2 h室溫孵育后滴入ECL工作液曝光拍照。用Image J軟件定量分析目的條帶蛋白灰度值。

1.8 統計學方法 應用SPSS 26.0和Graphpad Prism 9.0軟件進行數據統計及繪圖，數據采用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOⅤA）。

2 結果

2.1 大鼠含藥血清濃度的確立、不同濃度解毒益智方含藥血清毒性的確定及Aβ25-35損傷濃度確定 通過MTT法檢測不同濃度（10%、20%、30%、40%、50%）大鼠血清對PC12細胞活力值影響。不同濃度大鼠血清與PC12細胞共培養24 h后，如圖 1a所示，當大鼠血清含量為10%時與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。提示可選擇10%大鼠含藥血清作為藥物載體，且對細胞增值無影響。當測定不同濃度（10、20、25、30、40 μmol/L）Aβ25-35對PC12細胞損傷情況時，如圖 1b結果所示：與空白組相比，Aβ25-35預處理24 h后，隨著濃度增加細胞活力值下降，當濃度達到40 μmol/L時，細胞存活率降至50%以下，差異具有統計學意義（P＜0.05）。因此，40 μmol/L Aβ25-35作為誘導PC12細胞毒性最佳濃度。當用解毒益智方各濃度含藥血清預處理PC12細胞，結果表明，解毒益智方各劑量組對PC12細胞均無明顯毒性作用，且高劑量組可促進細胞活力，差異具有統計學意義（P＜0.05），詳見圖 1c。

圖1 大鼠含藥血清及Aβ25-35最佳誘導濃度的確立；解毒益智方各劑量組對PC12細胞活力影響

2.2 解毒益智方對Aβ25-35誘導PC12細胞形態學影響 空白組PC12細胞密度較大、貼壁生長且為正常神經上皮細胞狀態，中部飽滿、觸角伸長梭形；模型組細胞密度較小，成片未貼壁且透亮、無明顯觸角，形態類似圓形。解毒益智方低、中、高劑量組預處理后，細胞懸浮死亡現象較模型組好轉，尤以高劑量效果明顯。高劑量組細胞密度大且呈梭型狀態，有觸角。表明解毒益智方高劑量組預處理PC12細胞對A β25-35誘導的損傷具有很好的保護作用。

2.3 解毒益智方對PC12細胞中PI3K、p-Akt、GSK3β、P53蛋白表達的影響 如圖 2所示，Western Blot實驗結果可知：與正常對照組相比，模型組PI3K、p-Akt蛋白表達顯著下降，GSK3β、p53蛋白表達顯著上升，差異具有統計學意義（P＜0.05）。應用解毒益智方低、中、高劑量后，與模型組相比PI3K、p-Akt蛋白表達顯著上升，GSK3β、p53蛋白表達 顯著下降，尤以高劑量組效果明顯，差異具有統計學意義（P＜0.05）。表明解毒益智方可能通過調控PI3K/AK T/Gsk3β/p53信號通路，對Aβ25-35 誘導PC12細胞神經毒性起保護作用。

圖2 各劑量組解毒益智方對PC12細胞中PI3K、p-Akt、GSK3β、p53蛋白表達的影響

3 討論

隨著人口老齡化，癡呆已成為老年人常年病，其中阿爾茨海默病型癡呆占比達60%～80%，現已成為老年人失能和死亡的主要原因[8-9]。中國是世界上癡呆患者最多的國家，流行病學調查指出中國60歲以上人口中癡呆患者約1 507萬，其中阿爾茨海默病約983萬人[10]。阿爾茨海默病是最常見的癡呆類型，因其起病隱匿、早期診斷困難，可導致患者認知障礙、精神行為問題和社會及生活功能喪失，給公共衛生系統帶來了沉重的經濟和社會負擔[11]。我國的癡呆診療文獻比世界上首個阿爾茨海默病病例報道早283年[12]，關于阿爾茨海默病的記錄散見于中醫所述的“善忘”“癡呆”“呆癡”“呆病”“郁證”“癲狂”等一類文獻當中[13-14]。對于“癡呆”一詞作為疾病最早的記載出現在先秦時期《左傳》中“周子有兄而無慧，不能辨菽麥，故不可立”“不慧，蓋世人所謂白癡”[14]。漢代《華佗神醫秘傳》最早出現“癡呆”一詞，是指腦髓消減、神機失用的一種神志異常疾病，有呆傻愚笨、智能低下、善忘等臨床表現。阿爾茨海默病其病因以內因為主，漸使腦髓空虛或腎精虧耗，痰瘀互阻，腦髓失養而發病。腎虛貫穿阿爾茨海默病的整個病程，為本，痰凝血瘀是發病的直接原因，為標，二者互為因果，致阿爾茨海默病病情發生和發展。解 毒益智方是在補腎益髓，活血化痰解毒法的前提下組方，由益智仁、黃連、川芎、龜板膠、地龍、山茱萸、酒大黃7味藥組成，其中益智仁為君藥，補腎之陰陽，溫腎益精；山茱萸補益肝腎，助陽益精；龜板膠補腎滋陰，三藥配伍，補腎益髓，使腦髓得養，共為臣藥。黃連與酒大黃共清上焦火熱；川芎活血行氣，上行頭面，中開郁結，與地龍配伍二藥共奏活血通絡之功。諸藥配伍，補腎填精益髓，瘀血 濁毒得清，腦髓得養，益智醒神[5]。

阿爾茨海默病常見的病理表現有：神經元外淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）聚集形成“老年斑”、神經元內Tau蛋白磷酸化異常聚集形成“神經原纖維纏結”、神經炎癥、腦神經元/突觸丟失、腦萎縮、葡萄糖代謝障礙等[15]。目前，阿爾茨海默病的治療方法主要基于“Aβ級聯假說、Tau蛋白過度磷酸化”，仍無法有效阻止或延緩阿爾茨海默病的疾病進程，因此找到阿爾茨海默病有效的治療靶點迫在眉睫，國內外學者仍在努力探尋治療方法[17]。

阿爾茨海默病發病與糖代謝異常的關系一直被人們所關注，已經揭示中樞胰島素信號受損與淀粉樣蛋白代謝之間存在必然的關聯。阿爾茨海默病患者早期即出現葡萄糖代謝及胰島素信號異常[17]。正常情況下，胰島素信號通路可以通過抑制APP的裂解酶BACE1（淀粉樣蛋白前體β-分解酶1）的產生，抑制Aβ產生和Tau蛋白磷酸化[18]。近來研究表明，胰島素信號轉導通路中的磷脂酰肌醇-3激酶/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/Akt）通路主要參與了Aβ的形成，PI3K-Akt信號通路是調節受損神經細胞修復、促進神經細胞存活的重要信號通路[19]。PI3K由調節亞基p85和催化亞基p110結合位點構成，當p85發生磷酸化時，p110抑制被解除，激活PI3K[20]。Akt是PI3k下游靶點，在PI3K/Akt/GSK3β信號通路中起到樞紐作用。Akt磷酸化后，神經保護作用被激活[21-22]。削弱P13 K/Akt信號途徑能使下游信號分子Akt，刺激糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）磷酸化[23]，上調γ分泌酶活性而促進Aβ40、Aβ42的合成。PI3K/Akt激活受限，影響下游激酶的級聯激活途徑導致GSK-3β等表達紊亂，大腦代謝失衡，且GSK3β是Akt重要底物，活性受Akt負調控，并與Tau蛋白過度磷酸化密切相關[24-25]。PI3K/Akt的活化降低使其對GSK-3β的抑制減弱，GSK-3β是細胞凋亡的關鍵介質，可導致早老素異常增加伴隨Aβ的堆積，還可引起糖原、脂肪酸和蛋白質的合成障礙，使神經遞質合成減弱，降低突觸可塑性，導致神經元丟失[26-27]。另TP53基因誘導表達p53蛋白，通過促進細胞增殖和凋亡，加劇神經系統退行性病變的發展[28]。已有研究顯示，Aβ的神經毒性與PI3K/Akt/GSK3β信號通路密切相關[29-30]，因此找到可調控PI3K/Akt/GSK3β信號通路的藥物對抗Aβ神經毒性，可能成為防治阿爾茨海默病的一個新途徑。本實驗研究表明，Aβ25-35可顯著降低PC12細胞中PI3K、Akt蛋白表達，提高GSK3β、p53蛋白表達水平，而應用解毒益智方能夠上調PI3K、Akt蛋白表達水平，降低GSK3β、p53蛋白表達水平（P＜0.05）。說明解毒益智方對Aβ25-35誘導PC12細胞神經毒性具有保護作用，可能是通過活化PI3K，磷酸化下游蛋白Akt，從而降低GSK3β蛋白與p53蛋白表達，發揮神經毒性保護作用。