免疫聯合治療增強Vγ9Vδ2 T細胞的抗腫瘤活性①

蘇凱 趙報 崔憶旋 馬士崟（蚌埠醫學院第一附屬醫院，蚌埠 233000）

T淋巴細胞是機體適應性免疫應答的重要組成，在對抗外界干擾和機體自我調節方面至關重要。根據T細胞抗原受體（T cell antigen receptor，TCR）不同，T細胞可分為αβT細胞和γδT細胞。αβT細胞主要參與獲得性免疫過程，受主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）限制，但γδT細胞對抗原的識別則不具有MHC限制性。γδT細胞具有抗原提呈能力，在應對機體免疫疾病和抗腫瘤等過程中發揮重要作用［1］。γδT細胞被認為是抗腫瘤免疫的重要參與細胞，作為最有利于預后的單一免疫細胞，具有腫瘤免疫治療的諸多特性，如細胞毒性、易擴增和良好的安全性等。

與B細胞相同，γδT細胞與αβT細胞利用V（D）J基因重排產生不同類型受體識別抗原。豐富的受體類型歸因于TCR中CDR3的組合多樣性和連接多樣性。其中連接多樣性是在V（D）J基因片段連接過程中產生的，其方法包括：①不對稱地打開發夾編碼端，允許結合回文序列；②通過末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）在連接處引入額外的核苷酸；③核酸外切酶裂解導致核苷酸在兩個編碼端邊界進行修剪［2-3］。γδT細胞表達變量Vγ和Vδ鏈，根據結構和功能不同，可進一步將γδT細胞分為“Vδ2”“Vδ1”和較少的“Vδ3”或“Vδ5”鏈表達細胞。盡管無限制且理論上具有較高的組合多樣性，但Vδ2鏈優先與Vγ9配對，這些Vγ9Vδ2 T細胞占外周血T細胞的1%~5%，在人體免疫中發揮重要作用，是成人血液循環中的優勢γδT細胞群［4-5］。Vγ9Vδ2 T細胞基因表達譜是典型的αβT和NK細胞雜合，其抗原活化具有特異性和接觸依賴性，且不受免疫排斥反應限制，成為近年腫瘤免疫治療的研究熱點［6］。

1 Vγ9Vδ2 T細胞識別激活和腫瘤免疫殺傷

由于不受傳統MHC限制，Vγ9Vδ2 T細胞可直接識別并殺死惡性腫瘤細胞。Vγ9Vδ2 T細胞主要識別磷酸抗原，無需加工、呈遞，且無MHC限制性。哺乳細胞磷酸抗原主要通過甲羥戊酸途徑合成，除感染或腫瘤轉化階段外，正常生理狀態下，磷酸抗原濃度不足以激活Vγ9Vδ2 T細胞。因此，Vγ9Vδ2 TCR的工作模式類似于模式識別受體，可感知惡性轉化細胞或感染細胞代謝改變。另一方面，Vγ9Vδ2 T細胞表達NKG2D受體，NKG2D在Vγ9Vδ2 T細胞介導的T細胞免疫應答（細胞因子產生、增殖和細胞毒活性）中提供重要刺激信號。Vγ9Vδ2 T細胞通過NKG2D識別腫瘤細胞表面表達的NKG2DL（包括MICA、MICB和ULBP家族成員）發揮腫瘤殺傷功能［7］。同時刺激Vγ9Vδ2 TCR和NKG2DL可更有效刺激Vγ9Vδ2 T細胞，從而具有更強的抗腫瘤活性。磷酸抗原是Vγ9Vδ2 T細胞的主要活化因子，可被氨基雙膦酸鹽（NBPs）上調。NBPs可通過抑制IPP處理酶法尼基焦磷酸合酶活性，導致細胞內IPP積聚和胞外釋放，被Vγ9Vδ2 TCR識別并激活，故經NBPs預處理的腫瘤細胞對Vγ9Vδ2 T細胞的殺傷更為敏感［8］。

遺傳學和功能性研究均揭示Vγ9Vδ2 T細胞是天然免疫和獲得性免疫系統的中間體，發揮重要作用，典型的天然免疫表型是Vγ9Vδ2 T細胞介導的抗體依賴的細胞毒活性、吞噬作用和無需預先分化或擴增的、針對病原特異性抗原的快速反應。尤其是Vγ9Vδ2 T細胞的基因表達譜是典型的αβT和NK細胞雜合，而Vγ9Vδ2 T細胞獲得性免疫的特點是具有受體基因的體細胞重排能力、記憶能力和抗原呈遞能力［4］。與NK細胞類似，Vγ9Vδ2 T細胞表達的CD16受體可結合IgG的Fc段。磷酸抗原激活后的Vγ9Vδ2 T細胞可上調CD16表達，從而增強抗體依賴的細胞毒性作用。Vγ9Vδ2 T細胞快速活化，以MHC非限制方式識別多種腫瘤相關抗原，通過穿孔素-顆粒酶、凋亡誘導蛋白配體途徑Fas-FasL及分泌大量細胞因子（如IFN-γ、TNF-α）等作用于腫瘤細胞及其微環境，殺傷多種腫瘤細胞，而不對正常細胞存活產生任何影響（圖1）［9］。

圖1 Vγ9Vδ2 T細胞激活Fig.1 Activation of Vγ9Vδ2 T cells

2 Vγ9Vδ2 T細胞在腫瘤免疫治療方面的應用

近年腫瘤自身免疫細胞及嵌合抗原受體T細胞免疫、NK細胞療法成為研究熱點，對細胞腫瘤免疫和干預具有不可估量的前景［10］。Vγ9Vδ2 T細胞可溝通先天性免疫與適應性免疫，在腫瘤發生和感染監視和防御中起重要作用，有望成為腫瘤免疫治療的新方法，尤其是傳統手術治療難以治愈的腫瘤。Vγ9Vδ2 T細胞免疫治療腫瘤研究發現，在卵巢癌、膽管癌、肝癌、骨髓瘤、膠質母細胞瘤、白血病、乳腺癌、淋巴瘤等治療方面，Vγ9Vδ2 T細胞可發揮重要作用。

2.1 卵巢癌NOéMIE等［11］采用小鼠上皮性卵巢癌模型進行體內實驗，設置未經治療的腫瘤切除小鼠、單用化療的小鼠和Vγ9Vδ2 T細胞免疫治療聯合化療的小鼠三組方案，結果顯示未經治療的小鼠出現了巨大的腹膜癌，單用化療的小鼠出現小的局限性腫瘤，但免疫治療聯合化療的小鼠幾乎未發現腫瘤；MAO等［12］將NSG實驗小鼠分為三組，分別接受PAM聯合Vγ9Vδ2 T細胞治療、Vγ9Vδ2 T細胞治療，與用1×PBS治療的對照組相比，接受全身PAM聯合Vγ9Vδ2 T細胞或單獨使用Vγ9Vδ2 T免疫治療的小鼠卵巢癌細胞完全消失。

2.2 膽 管 癌ALNAGGAR等［13］觀 察1例 接 受Vγ9Vδ2 T細胞免疫治療的30歲膽管癌伴縱隔淋巴結轉移Ⅳ期男性患者發現，前6次治療每2周接受1次Vγ9Vδ2 T細胞治療，后2次每4周接受1次γδT細胞治療，同種異體Vγ9Vδ2 T細胞用于免疫治療是安全的，可消除腫瘤轉移，MRI圖像顯示淋巴結明顯縮小，提示隨著Vγ9Vδ2 T細胞輸注次數增加，淋巴結轉移逐漸消失。

2.3 肝癌ZHOU等［14］研究表明，Vγ9Vδ2 T細胞與親脂性雙膦酸鹽結合可有效殺傷活性肝星狀細胞，活化的肝星狀細胞可促發肝癌，因此Vγ9Vδ2 T

細胞有望成為纖維化-肝硬化相關肝癌的治療策略，不僅可殺死肝癌的驅動力肝星狀細胞，還可直接殺死腫瘤細胞。同時，CIMINI等［15］研究表明，Vγ9Vδ2 T細胞具有抑制HCV復制的能力，而丙肝又是肝癌和肝移植的主要原因之一。

2.4 膠質母細胞瘤Vγ9Vδ2 T細胞感知腫瘤細胞的能力已在體內針對多種腫瘤進行了廣泛研究，CHAUVIN等［16］在體外和體內均證明了異基因人Vγ9Vδ2 T淋巴細胞可自發識別殺傷原代膠質母細胞瘤。JARRY等［17］證實在小鼠腦腫瘤實質內直接立體定向注射擴增的Vγ9Vδ2 T細胞，Vγ9Vδ2 T細胞可存活數天，隨后深入腦組織，有效控制腦膠質母細胞瘤生長。

2.5 白血病Vγ9Vδ2 T細胞可與白血病細胞相互作用并根除，達到最佳激活時Vγ9Vδ2 T細胞具有強大的抗白血病活性。GERTNER-DARDENNE等［18］采用急性髓系白血?。╝cute myelogenous leukemia，AML）細胞與Vγ9Vδ2 T細胞異種移植建立小鼠模型，發現Vγ9Vδ2 T細胞靠近植入白血病細胞的骨髓中歸位，與單獨注射AML細胞的小鼠相比，Vγ9Vδ2 T細胞和AML細胞共同注射的小鼠存活率更高。DE WEERDT等［19］采用體外激活的Vγ9Vδ2 T細胞用于慢性淋巴細胞白血病治療，同樣顯示治療有效。

2.6 乳腺癌BENZAID等［20］建立皮下移植T47D乳腺腫瘤實驗小鼠模型，結果顯示，與安慰劑組相比，利塞膦酸鹽預處理的Vγ9Vδ2 T細胞毒性增強，小鼠腫瘤體積減少了46%。MAN等［21］采用PET示蹤Zr標記的Vγ9Vδ2 T細胞，可在雙膦酸預處理的小鼠異種移植乳腺腫瘤中觀察到大量Vγ9Vδ2 T細胞，證明Vγ9Vδ2 T細胞在腫瘤靶向治療方面具有廣泛應用前景。

2.7 其他癌癥IKUO等［22］觀察了7例胃癌患者，在注射Vγ9Vδ2 T細胞前1天接受ZOL預處理，經過一輪治療即發現腹水中癌細胞減少。DUAULT等［23］證明擴增的Vγ9Vδ2 T細胞與PAg聯用可阻止小鼠淋巴瘤模型腫瘤生長。

3 單一使用Vγ9Vδ2 T細胞治療腫瘤的局限性

采用過繼轉移法轉移體外激活的Vγ9Vδ2 T細胞聯合氨基雙膦酸鹽和IL-2的臨床耐受性良好，但在多種腫瘤中顯示臨床效果有限，原因可能為激活的Vγ9Vδ2 T細胞無法到達腫瘤部位，或被腫瘤細胞和腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）中鄰近細胞控制的免疫抑制環境所削弱。TME幫助腫瘤細胞抵抗化療和逃避免疫監視［24］。TME中，腫瘤細胞及其他細胞（如基質細胞、腫瘤相關巨噬細胞）產生免疫抑制細胞因子誘導Vγ9Vδ2 T細胞出現Th17及Treg相似的特征。此外，Vγ9Vδ2 T抗腫瘤活性可通過其表面表達抑制性受體（如PD-1）及與腫瘤細胞上表達的相應配體結合而被抑制［9］。

除TME對Vγ9Vδ2 T細胞的抑制作用外，多種實體瘤細胞系對Vγ9Vδ2 T細胞的細胞毒作用的抵抗力較強［25］。TODARO等［26］通過研究結腸癌細胞發現，結腸癌細胞對化療藥物和Vγ9Vδ2 T細胞介導的細胞毒性均具有耐藥性，結腸癌細胞表達的磷酸化抗原濃度可能較低，低于反應性Vγ9Vδ2 TCR有效識別所需閾值，暴露于唑來膦酸鹽后，結腸癌細胞對Vγ9Vδ2 T細胞毒性更為敏感。

4 聯合治療增強Vγ9Vδ2 T細胞抗腫瘤活性

Vγ9Vδ2 T細胞具有一定細胞毒性，有望成為腫瘤免疫治療的新手段。但臨床研究中，Vγ9Vδ2 T細胞也反復顯示出低毒性，導致臨床治療效果有限［5］。越來越多的研究顯示，Vγ9Vδ2 T細胞免疫治療腫瘤可與其他治療結合提高其細胞毒性（圖2），以期在臨床應用中取得更好效果［27］。

圖2 聯合治療增強Vγ9Vδ2 T細胞抗腫瘤活性的途徑Fig.2 Pathways of combination therapy to enhance antitumor activity of Vγ9Vδ2 T cells

4.1 化療藥物細胞免疫療法與化療藥物聯用對癌癥治療具有重要作用，Vγ9Vδ2 T細胞由于其抗腫瘤細胞作用且異體擴增移植相對簡單而在聯合治療中備受關注。低濃度化療藥物或唑來膦酸鹽預處理可使Vγ9Vδ2 T細胞快速殺傷腫瘤細胞，細胞毒性接近90%。此外，唑來膦酸鹽增強了化療誘導的腫瘤細胞對Vγ9Vδ2 T細胞毒性的敏感性，在某些情況下導致腫瘤靶點幾乎100%溶解。無論采用哪種預處理方法，Vγ9Vδ2 T細胞識別靶點均由TCR介導，化療致敏靶點由NKG2D介導，Vγ9Vδ2 T細胞識別和釋放穿孔素后殺死腫瘤細胞?；?唑來膦酸/Vγ9Vδ2 T細胞聯合治療可廣泛用于多種惡性腫瘤，且治療相關毒性最小。唑來膦酸鹽一般無毒，化療藥物可減少到毒性較小的腫瘤致敏劑量［26］。

作為一種標準化療藥物，大量研究已證實吉西他濱在臨床上具有安全性和毒性可控，吉西他濱聯合Vγ9Vδ2 T免疫細胞具有良好應用價值。γδTCR單獨刺激不足以完全激活Vγ9Vδ2 T細胞毒性，需要NKG2D等受體共刺激信號［28］。TERUKI等［29］已證實Vγ9Vδ2 T細胞對膀胱癌的治療效果顯著，通過原位異種移植模型研究Vγ9Vδ2 T細胞和ZOL聯合吉西他濱的體內抗腫瘤作用，與未經吉西他濱預處理的實驗組相比，吉西他濱預處理增強了體內γδT細胞的細胞毒性，差異有統計學意義，Vγ9Vδ2 T免疫細胞聯合吉西他濱是一種有效的體內抗腫瘤策略。NKG2D-MICA/B信號通路和MICA/B阻斷實驗結果表明，MICA/B表達顯著上調，阻斷NKG2D受體導致UBC細胞裂解減少，表明NKG2D-NKG2DLs途徑發揮重要作用。地西他濱聯合Vγ9Vδ2 T細胞同樣可增強其細胞毒性以強化其在腫瘤免疫治療中的作用，γδT細胞對骨肉瘤效果良好，ZHAN等［7］發現相對于單用Vγ9Vδ2 T細胞或地西他濱治療，Vγ9Vδ2 T細胞聯合地西他濱對骨肉瘤細胞的增殖抑制更為有效，表明地西他濱聯合Vγ9Vδ2 T細胞治療對骨肉瘤細胞殺傷作用更好。地西他濱作為一種DNA去甲基化藥物，增加了骨肉瘤細胞表面NKG2D配體（NKG2DLs）表達，對細胞毒性Vγ9Vδ2 T細胞的識別和破壞更為敏感。此外，替莫唑胺（一種被批準用于神經膠質瘤的DNA甲基化化療試劑）能顯著增加神經膠質瘤細胞表面NKG2DL表達，使神經膠質瘤細胞更易被Vγ9Vδ2 T細胞殺死［30］。

4.2 細胞因子癌癥患者中，Vγ9Vδ2 T細胞反復被發現減少或有缺陷，增殖能力降低。體外培養Vγ9Vδ2 T細胞可在短時間內由PBMCs有效生成，采用IL-2和膦酸鹽進行細胞擴增可產生具有高分化TCRγδ陽性表型的人Vγ9Vδ2 T細胞［29］。IL-33是一種γ鏈受體獨立的細胞因子，能夠誘導PAg激活的Vγ9Vδ2 T細胞體外增殖，這些T細胞完全功能性地表達IFN-γ和TNF-α，并顯示出體外抗腫瘤活性［23］。

IL-21是一種強調節性細胞因子，在包括Vγ9Vδ2 T細胞在內的免疫效應器中可提高胞內顆粒酶B水平，進而提高細胞毒性［31］。IL-21具有增強細胞毒性和促進細胞增殖的能力，是腫瘤免疫治療的候選藥物［32］。測 定 細 胞 內GzmB表 達 前 采 用IL-21對Vγ9Vδ2 T淋巴細胞進行短暫致敏，結果表明IL-21顯著提高了人Vγ9Vδ2 T細胞內GzmB水平，且不影響其存活。JOALLAND等［6］表明，與未經處理的Vγ9Vδ2 T細胞相比，IL-21增加了Vγ9Vδ2 T細胞對膠質母細胞瘤細胞GBM-1的細胞毒性（67%），短期IL-21治療可通過長期提高細胞內GzmB水平顯著增強人同種異體Vγ9Vδ2 T細胞天然抗腫瘤活性。采用IL-21治療GBM-1荷瘤小鼠，連續3個周期（第7、14和21天）立體定向給予致敏或不致敏的人Vγ9Vδ2 T細胞，小鼠在GBM-1細胞植入后存活150 d以上，表明該療法可根除膠質母細胞瘤。IL-23是一種由新生樹突狀細胞產生的細胞因子，MOENS等［33］發現，與IL-23可與Vγ9Vδ2 T激活劑唑來膦酸鹽結合促進新生兒Vγ9Vδ2 T細胞表達高水平的細胞毒性遞質并產生IFN-γ及IL-17。HCV是肝癌的重要發病原因，慢性丙型肝炎病毒感染可導致Vγ9Vδ2 T細胞減少。Vγ9Vδ2 T細胞在病毒感染中起關鍵作用，能夠介導廣泛的抗病毒和免疫調節活性。激活的Vγ9Vδ2 T細胞抗病毒作用主要通過IFN-γ釋放實現。CIMINI等［34］研究發現，HCV患者Vγ9Vδ2 T細胞產生IFN-γ的功能受損，IFN-α可改善HCV患者的Vγ9Vδ2 T細胞功能，從而促進IFN-γ產生。

4.3 單克隆抗體過去20年中，單克隆抗體已成為對人類惡性腫瘤療效顯著且類型新穎的藥物之一，尤其是靶向免疫檢查點的單克隆抗體藥物在腫瘤免疫治療中發揮重要作用。盡管抗體免疫治療在腫瘤治療中取得了顯著進展，但對抗體單一療法相對較弱的應答以及腫瘤耐藥性仍是未解決的主要問題。單克隆抗體聯合免疫治療具有廣泛應用前景［35］。直接靶向腫瘤細胞表面抗原可增強同種異體轉移的Vγ9Vδ2 T細胞特異性［36］。單克隆抗體結合了高靶點特異性和良好的毒性特征，但單獨使用時抗腫瘤活性有限，與Vγ9Vδ2 T細胞聯用具有良好效果。表明單克隆抗體增強了Vγ9Vδ2 T細胞的細胞毒性，體外研究表明，臨床采用單克隆抗體治療腫瘤，如利妥昔單抗、赫賽汀、阿來組單抗可通過CD16介導ADCC激活γδT細胞。

Vγ9Vδ2 T細胞與曲妥珠單抗聯用增強了對HER2陽性細胞的殺傷能力［37］。曲妥珠單抗在HER2表達較低的惡性腫瘤中幾乎無抗腫瘤活性。LIU等［38］研究曲妥珠單抗聯合Vγ9Vδ2 T細胞能否增強對ZOL預處理的骨肉瘤細胞的殺傷作用，在臨床相關時間段（2 h），ZOL預處理的骨肉瘤細胞雖能刺激Vγ9Vδ2 T細胞最佳免疫應答，但曲妥珠單抗能進一步增強Vγ9Vδ2 T細胞的細胞毒性。表明曲妥珠單抗與ZOL聯用可顯著提高Vγ9Vδ2 T細胞的細胞毒性。GA101作為一種Ⅱ型糖化抗CD20單克隆抗體，聯合Vγ9Vδ2 T細胞對原發性濾泡性淋巴瘤細胞的殺傷能力顯著增強［39］。研究還發現抗PD-1治療可使Vγ9Vδ2 T細胞對磷酸抗原刺激后的細胞毒性增加近5倍，是多發性骨髓瘤免疫治療的有效手段［40］。

4.4 納米藥物納米藥物具有最佳生物相容性、體內可降解性以及優異的抗氧化和抗癌活性，具有廣泛應用前景。研究發現，納米藥物可用于增強Vγ9Vδ2 T細胞抗腫瘤免疫能力，納米顆粒較少被內化，主要在細胞表面聚集，有望成為抗癌藥物載體。通過上調α-微管蛋白乙?；€定微管結構及NKG2D、IFN-γ、FasL、穿孔素、CD16等相關受體表達可延長γδT細胞體外生存時間，提高Vγ9Vδ2 T細胞對癌細胞的殺傷能力［41］。殼聚糖納米粒（chito?san nanoparticles，CSNPs）是一種可用于增強Vγ9Vδ2 T細胞抗腫瘤免疫能力的可靠生物相容性材料，LIN等［42］設計了以CFSE標記的慢性粒細胞白血病細胞株K562為模型的細胞進行了體外殺傷實驗，結果顯示，CSNPs預處理的Vγ9Vδ2 T細胞在E∶T為5∶1時對K562細胞的細胞毒性比未處理的Vγ9Vδ2 T細胞（對照組）增強，表明CSNPs可增強Vγ9Vδ2 T細胞對癌細胞的殺傷作用。硒納米顆粒（selenium nanopar?ticles，SeNPs）還可提高細胞增殖能力和促進γδT細胞向腫瘤部位聚集。HU等［43］研究顯示，三種乳腺癌細胞與經SeNPs預處理的γδT細胞共孵育后，癌細胞死亡率明顯大于未經處理的癌細胞，體外實驗表明，SeNPs預處理能顯著提高γδT細胞對不同癌細胞株的殺傷作用。為進一步驗證SeNPs預處理的γδT細胞增強癌細胞毒性的體外研究結果，MDA-MB-231細胞小鼠模型結果表明，SeNPs能更有效地增強γδT細胞對腫瘤生長和轉移的抑制作用，提示SeNPs在調節γδT細胞抗腫瘤活性方面具有應用價值。

5 總結

Vγ9Vδ2 T細胞是目前具有廣闊應用前景的免疫細胞，由于具有T細胞和NK細胞特性，使得Vγ 9Vδ2 T細胞在腫瘤、炎癥、結核、艾滋病等眾多領域發揮重要免疫治療作用，其中腫瘤免疫治療是目前研究較為成熟且最為廣泛的。Vγ9Vδ2 T細胞研究進展為其在腫瘤免疫治療的應用鋪平了道路。以Vγ9Vδ2 T細胞為基礎的抗腫瘤免疫療法已在體內外實驗中顯示了良好功效，雙膦酸鹽類藥物可有效擴增和激活Vγ9Vδ2 T細胞?；趩我籚γ9Vδ2 T細胞抗腫瘤免疫活性不足的問題，Vγ9Vδ2 T細胞聯合化療藥物、單克隆抗體、細胞因子、納米藥物等可有效增強抗腫瘤免疫活性。未來可將聯合治療作為新的突破方向，尋找可更有效增強抗腫瘤活性的藥物，充分發掘Vγ9Vδ2 T細胞在腫瘤免疫治療中的應用價值。